Isolering av embryonala vävnader och bildandet av vaktel-kyckling chimära organ med exemplet bräss
Summary
Denna artikel ger en metod för att isolera ren embryonala vävnader från vaktel och kyckling embryon som kan kombineras för att bilda ex vivo chimära organ.
Abstract
Förmåga att isolera embryonala vävnader var ett viktigt steg för att fastställa vaktel-kyckling chimera systemet, vilket i sin tur har lämnat obestritt bidrag till avtäckningen nyckelprocesser i utvecklingsbiologi.
Är häri beskrivs en optimerad metod för att isolera embryonala vävnader från vaktel och höns av mikrokirurgi och enzymatisk nedbrytning samtidigt bevara sin biologiska egenskaper. Efter isolering, vävnader från båda arterna är associerade på in vitro-organotypic test för 48 h. vaktel och kyckling vävnader kan diskrimineras av olika nukleära funktioner och molekylära markörer så att studiet av den cellulära överhörning mellan heterospecific föreningen i vävnader. Detta tillvägagångssätt är därför ett användbart verktyg för att studera komplexa vävnad interaktioner i utvecklingsprocesser med högdynamiska rumsliga modifieringar, såsom de som inträffat under faryngala morfogenes och bildandet av framtarmen endoderm-derived organ. Detta experimentella tillvägagångssätt utvecklades först för att studera de epiteliala-mesenkymala interaktionerna tidigt skede-av tymus bildandet. I detta, den endoderm-derived blivande thymic rudiment och mesoderm-derived mesenchyme, var isolerade från vaktel och kyckling embryon, respektive.
De omkringliggande vävnaderna förmåga att generera organ kan testas ytterligare genom ympning dem på det chorioallantoic membranet (CAM) av en kyckling embryo. CAM ger näringsämnen och gas utbyte till explanterad vävnader. Efter 10 dagars ovo utveckling, kan chimär organ analyseras i de skördade bladsticklingar av konventionella morfologiska metoder. Detta förfarande kan också studera vävnadsspecifika bidrag under organ kan bildas, från dess ursprungliga utveckling (in vitro-utveckling) till slutskedet av organogenesen (i ovo utveckling).
Slutligen, förbättrad isolering metoden också ger tredimensionellt (3D) bevarade embryonala vävnader, som också kan användas för högupplösta topografisk analys av vävnadsspecifika-genuttryck mönster.
Introduction
I början av 1970, har en elegant vaktel-kyckling chimera-systemet utvecklats av Le Douarin, öppna nya vägar för att förstå rollen av cellmigration och cellulära interaktioner under utveckling1,2. Modellen som utformades på förutsättningen att cellen utbyte mellan de två arterna avsevärt inte skulle störa embryogenes, bekräftade senare när används för att studera många utvecklingsprocesser, inklusive bildandet av nervsystemet och den hematopoetiska system1. Tar den senare som ett exempel, de cykliska vågorna av hematopoetiska progenitorceller kolonisera den thymic epitelial rudiment observerades först använder vaktel-kyckling chimera system3. För det var tymus, endoderm av de tredje och fjärde faryngala påsarna (3/4PP), blivande territorium mekaniskt och enzymatiskt isolerad från vaktel (q) embryon på 15 till 30 – somite Stadium [embryonala dag (E) 1,5-E2.5]. Dessa stadier motsvarar kyckling hamburgare och Hamilton4 (HH) – arrangerar 12-17. Förfaranden som isolering började med användning av trypsin att enzymatiskt sära endoderm från den bifogade mesenchyme. Isolerade endoderm var ympade in i somatopleura regionen av en värd kyckling (c) embryo på E3-E3.5 (HH-stadier 20-21). Detta heterologa mesenchyme ansågs ”tillåtande” thymic epitel utvecklingen bidrar också till orgel bildandet3. Efteråt, infiltrerat successiva vågor av kyckling värd blodburna stamceller vaktel givare thymic epitelial motstyckena bidrar till brässen bildas i värd embryo3.
Mer nyligen, en modifierad version av detta synsätt var också visat sig vara viktigt för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner tidigt skede-thymus bildandet5. I detta avseende var vävnaderna som är inblandade i bildandet av ektopisk bräss i chimära embryon3 isolerad, båda från givare och värd embryon, och tillhörande ex vivo. Ett förbättrat protokoll användes för att isolera vaktel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) och kyckling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonala vävnader var isolerade av mikrokirurgi och omfattas av in vitro-pankreatin matsmältningen. Dessutom var villkoren för enzymatisk nedbrytning, temperatur och tid för inkubation optimerad enligt vävnadstyp och utvecklingsstadier (tabell 1).
Nästa, isolerade vävnader var förenade i en organotypic i vitro system för 48 h, som tidigare rapporterats5,6. In vitro-föreningen av vävnader härmar de lokala cellulära interaktioner i embryot, övervinna vissa begränsningar av invivo manipulation. Detta system är särskilt användbart för att studera cellulära interaktioner i komplexa morfogena händelser, såsom utveckling av faryngeal apparaten.
Varje vävnad i thymus histogenesis bidrag, liksom möjligheten för föreningen heterospecific att generera en bräss kan vara ytterligare utforskas med hjälp av CAM metodik, tidigare detaljerade5,7,8. Kortfattat, var odlade vävnader ympade på CAM cE8 embryon och får utvecklas i ovo för 10 dagar. Sedan utvärderades bräss bildandet av Morfologisk analys i de skördade bladsticklingar. Som i den klassiska vaktel-kyckling studier3koloniserades vaktel thymic epitelet av hematopoetiska stamceller (HPCs) härrör från kyckling embryot, som senare visades att bidra till orgel utveckling9,10 . HPCs migrerade från embryot till ektopisk chimära tymus genom den högt vaskulariserad CAM5,7,8. Vaktel härledda thymic epitel kan identifieras genom immunhistokemi med artspecifika antikroppar (dvs. QCPN – MAb vaktel perinukleära), övervinna behovet vävnadsspecifika molekylära markörer.
Denna experimentella metod, tillåter som den tvåstegsstrategi som rapporterats i tidigare publikation8, moduleringen av signalvägar genom regelbunden administrering av farmakologiska agenter under in vitro- och ovo utveckling. Dessutom kan bladsticklingar skördas vid någon tidpunkt av de experiment8.
Slutligen, isolering protokollet här detaljerade tillåter bevarandet av de naturliga egenskaperna och 3D-arkitekturen av embryonala vävnader, särskilt användbart för detailing jordbaserad gen-uttryck mönster av embryonala territorier annars otillgängliga av konventionella metoder. Dessutom kan transkriptom analys metoder, inklusive RNA-seq eller microarrays, också tillämpas i isolerade vävnader utan att genetiska markörer samtidigt som den ger en vävnadsspecifika hög genomströmning ”omics” analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det förfarande för isolering av embryonal vävnad som anges här har förbättrats från tidigare tekniker för att producera vaktel-kyckling chimära embryon i olika biologiska sammanhang3,5,6.
Denna metod är lämplig att isolera ren embryonala vävnader utan att genetisk manipulation eller användning av vävnad-specifika markörer, som ofta är obestämd, begränsa användningen av genetiskt mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma att Isabel Alcobia för den kritiska behandlingen av manuskript, Mário Henriques för video berättande samt Vitor Proa från tjänsten histologi av Instituto de Histologia e Biologia gör skattemyndigheten, Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, för teknisk support. Vi är särskilt tacksamhetsskuld till Paulo Caeiro och Hugo Silva från det Unidade de audiovisuais (audiovisuella enheten), Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa för deras enastående engagemang för produktionen av denna video. Vi erkänner Leica Microsystems för vänligt att ge ett stereoskop utrustad med en video-system och Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A för att bidra med vaktel befruktade ägg. Detta arbete stöds av Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
