Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil
Summary
Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Gap kavşak (GJs) bitişik hücreler arasında 1 kDa daha küçük moleküllerin difüzyon izin hücre zarı kanallar vardır. Fizyolojik ve patolojik rollere sahip olduğu ilaç bulma ve toksikoloji deneyleri GJ modülatörler tanımlamak için lüzum-in yüksek-den geçerek (HTS) eleme deneyleri. Bir roman iyodür-Sarı floresan protein-gap junction hücreler arası iletişim (ı-YFP-GJIC) tahlil bu ihtiyacı karşılamaktadır. Stabil olan floresans hassas iyodür veya SLC26A4, bir iyodür taşıyıcı tarafından sırasıyla söndürülür bir sarı floresan protein (YFP) değişken ifade etmek için tasarlanmıştır alıcısı ve donör hücreleri de dahil olmak üzere hücre tabanlı bir tahlil olduğunu. İyodür iki hücre tiplerinin karışık bir kültüre eklendiğinde, donör hücreleri ile SLC26A4 taşıyıcı girin ve nereye YFP floresan gidermek GJs ile bitişik alıcısı hücrelere diffüz. YFP floresan iyi iyi bir kinetik modunda ölçülür. YFP su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Güvenilir ve HTS. için kullanılacak hızlı tahlil LN215 hücreleri, insan gliyom hücreleri, kullanarak ben-YFP-GJIC tahlil için protokol açıklanmıştır.
Introduction
Gap kavşak (GJs) hareket hücreler arası kanalları küçük moleküllerin difüzyon izin vermek için < 1 kDa besin, metabolitleri ve bitişik hücreler arasında sinyal molekülleri gibi. Bileske öğeleri hemichannel veya connexon her hücrede içerir ve her connexon altı connexins (Cxs)1teşkil eder. GJs ve Cxs gibi GJ inhibitörleri2,3,4olan aromatik polisiklik hidrokarbonlar (PAH), karsinojenler, toksikoloji deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Kesintiye GJIC nongenotoxic karsinojenezis5,6ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Potansiyel terapötik hedef olarak, belirli alt türlerinden nöbetler7,8, kalp ve beyin iskemi/reperfüzyon hasarı9, migren aura10ile koruma GJ tutulum bildirilmiştir, ilaca bağlı karaciğer hasarı6,11ve12şifa yara. Yüksek işlem hacmi (HTS) eleme deneyleri GJ oransal kimyasal madde veya ilaç bulma, toksikoloji deneyleri için için antikorlar tanıtmakta ve Roman hücresel düzenleyiciler GJ faaliyet tanımlamak için gereklidir. HTS deneyleri GJ modülatörler2,13,14,15yapısı-aktivite ilişkileri araştırmak için kullanabilirsiniz.
Bazı GJIC deneyleri boya transferi veya ikili yama kelepçe teknikleri içerir. Lucifer sarı CH (LY) ve calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) boya-devret deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Hücreler LY, mikroenjeksiyon, yükleme kazıma veya Elektroporasyon tarafından kullanılmaya geçirgen değildir. Bir kez hücre içindeki komşu hücreleri yoluyla GJs LY yayılır ve GJ etkinlik LY geçiş16ölçüde tarafından denetlesinler. Calcein-AM deneyleri genellikle photobleaching17,18sonra boşluk-floresan kurtarma içerir. Calcein-AM intracellularly geçirimsiz calcein tarafından içsel bir esteraz dönüştürülür bir hücre permeant boya var. Tahlil bu lazer photobleaching takip çevresindeki bir hücreye calcein-AM transferini gözlemlemek için confocal mikroskop gerektirir. Fonksiyonel GJs varsa, calcein-AM bitişik hücrelerde photobleached hücreleri girer ve floresan kurtarılır. GJ faaliyet photobleached hücrelerinin floresans kurtarma ölçüde tarafından denetlesinler. Boya-devret deneyleri zahmetli ve zaman alıcı veya düşük hassasiyetleri sahip. İkili yama sıkma bileske gürültülerinden ölçer elektrofizyolojik bir yöntemdir. Gürültülerinden doğrudan bir bağımlılık açık GJs19sayısı ile oldukça hassas; Ancak, bu teknik olarak talep, zaman alıcı ve pahalı20. Ben-YFP-GJIC tahlil HTS. kullanım için geliştirilmiştir
Şekil 1 gösterir bileşenleri ve alıcısı hücreleri H148Q ve I152L taşıyan bir iyodür duyarlı YFP değişken ifade kullanır-YFP GJIC tahlil adımlardan (YFPQL) ve donör hücreleri bir iyodür ışınlama (SLC26A4) ifade21 . YFPQL tarafından yapılan iki mutasyon floresans iyodür22tarafından Şoklama izin. İodides Co kültürlü alıcısı ve donör hücreleri eklenir; alıcısı hücreleri girmez ancak mevcut SLC26A4 taşıyıcıları tarafından donör hücreleri alınır. İodides donör hücreleri işleyen GJs nerede YFPQL floresans gidermek bitişik alıcısı hücrelere yaygın. GJs kapalı veya inhibitörleri tarafından bloke, iyodür floresans gidermek için alıcısı hücreleri giremezsiniz. YFPQL su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Ben-YFP GJIC tahlil ne karmaşık ne de zaman alıcı bir işlemdir. HTS ile uyumlu ve nispeten kısa bir süre içinde GJ etkinlik bileşikler çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılabilir. Sadece alıcısı ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözüm gerektirir. Aşağıda açıklanan protokol önemli olan Cx Cx4321yaşında LN215 hücreleri temel alan. LN215-YFPQL reseptörü ve LN215-ı− donör hücreleri YFPQL veya SLC26A421,23ifade lentiviruses ile iletim tarafından üretilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sağlam, hızlı ve ucuz olduğu için ben-YFP-GJIC tahlil HTS için kullanılabilir. Bir HTS tahlil sağlam kabul edilir eğer Z’-0.525bir faktördür. Zhang ve ark. bkz: HTS deneyleri25uygunluğunun değerlendirilmesi için kullanılan istatistiksel analiz açıklaması için. LN215 hücreler kullanıldığında, Z’-faktör oldu > 0,5 olmadan herhangi bir tahlil en iyi duruma getirme. Diğer hücre tipleri tahlil ve onun Z kullanılan Eğer ‘-faktör < 0.5, sağlamlık ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 ve 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
