Summary

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

Published: January 25, 2019
doi:

Summary

ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価分析のため実験のセットアップの詳細な説明を提供します。

Abstract

幹と幹細胞由来細胞様々 な変性疾患の再生治療として大きな可能性があります。DNA は、幹細胞を含むすべてのセル内の遺伝データの倉庫との整合性はその再生能力の基本。幹細胞移植のための必要な数を達成するためにラボでの急速な伝播を受けます。加速された細胞の成長は活性酸素、カルボニル、アルキル化剤など、蓄積した代謝物による DNA の完全性の損失につながります。これらの細胞を移植生着不全と悪化の器官の再生になります。また、突然変異、dna、細胞老化細胞の DNA 損傷リードを移植とおそらく、生命を脅かすがんなどの病気。したがって、移植細胞の適合性を評価するための品質管理法のための即時の必要性があります。ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価手順のプロトコルを提供します。

Introduction

実験的ならびに臨床的細胞移植することができます心1,2,3,4,5 を失敗して左心室収縮性能を改善して適度に示します ,6,7,8,9。最近の進歩は、心血管の再生のための機会をさらに魅力的な開いています。体細胞に多能性を誘導し、異なる心臓系統、重要な心筋細胞 (CM)10にこれらの誘導多能性幹細胞 (iPSC) を区別するためにリプログラミング因子の強制発現が含まれます11,12,13。 人工的に生成された Ips と iPSC 由来 CM (iPS CM)、などを含むすべてのセルの遺伝性材料の DNA です。DNA に格納されている遺伝命令は、成長、開発、および細胞、組織、器官、生物の機能を決定します。DNA ではない不活性です。細胞の代謝、活性酸素、カルボニル、窒素種などとアルキル化剤は原因 DNA の in vitro および in vivo で14,15,16,17を傷つけることができます。重要なは、重要な頻度のすべてのセルで直感的に DNA 損傷が発生します。これらの損傷が修正されていない場合それは DNA の突然変異、細胞の老化、DNA ・細胞の整合性、および多分、生命を脅かす癌を含む疾患の損失に します。したがって、DNA の整合性を維持する任意のセル、特にクリニックの巨大な潜在性を持つ Ips に不可欠です。

数量やゲノムの DNA の分離の整合性を評価する高価な機器は市場で利用できます。ただし、セルを孤立させることがなく細胞内 DNA の整合性を評価するためにシンプルでコスト効率の良い方法もありません。さらに、ユーザーによる DNA 分解 DNA の隔離は、これらのメソッドを使用して主な欠点の 1 つです。単細胞ゲル電気泳動 (コメット試験法として知られている)18,19と γH2A.X 反応8テクニックは、DNA 損傷を評価するための研究所の根本的なアプローチ。これらの 2 つの方法では、高価な機器や DNA 整合性8,20,21を分析するゲノム DNA の分離は必要ありません。全体のセル; これらの技術で実行されましたので、サンプル準備の間に DNA、RNA、タンパク質分解のユーザー誘導は、これらのプロトコルには影響を与えません。ここでは、DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞における DNA 損傷応答を査定する、彗星法と γH2A.X 反応の両方を実行するステップバイ ステップのプロトコルを提供します。また、これらの 2 つのアプローチを組み合わせて、移植細胞の適合性を評価するために使用できます素朴な評価を提案します。

コメットアッセイ、または単一セルの電気泳動のゲル、細胞での DNA 切断を測定します。低融点アガロースに埋め込まれた細胞は、スーパー コイル DNA を含むフォーム ユーグレナグラシリスに分離します。彼らの巨大なサイズとマトリックス蛋白質とその活用のため、そのまま DNA は制限された移行を持っているに対し電気泳動に断片化された DNA と壊れた dna の小さな断片はアガロースゲル細孔に移行します。蛍光顕微鏡下でステンド グラスの DNA のパターンは、彗星を模倣します。彗星の頭にそのままな DNA が含まれていると尾を断片で構成され、壊れた dna。DNA 損傷の割合は、そのまま DNA (彗星頭部) 強度を基準にして損傷した DNA (彗星の尾) の蛍光強度が測定できます。図 1に示すように、パラメーター テール モーメントを計算できます。

DNA 損傷は、ヒストン H2A のリン酸化を誘導します。DNA PK、ATR、ATM キナーゼ (γH2A.X) を Ser139 で X。リン酸化と H2A の募集。DNA 鎖切断に X は、DNA 損傷応答 (DDR) と呼び、DNA が破損している後急速に起こる。次のこのプロセス、細胞周期のチェックポイントを介した逮捕、DNA 修復プロセスが開始されます。DNA の修復が正常に完了した後、γH2A.X は脱燐酸化し、脱燐酸化酵素による不活化します。長時間、複数の DNA 鎖切断は、dna γH2A.X 巣の蓄積に 。これは、DNA 損傷と DNA の完全性の損失を修復する細胞のできないことを示します。DNA のこれらの γH2A.X の巣によって識別できます、セクション 2 のプロトコルを使用して DDR 巣の数を数えることができます。

Protocol

1. コメットアッセイ 試薬の準備 低融点アガロースの低融点アガロースの 500 mg を 100 mL の DNA – に/水の RNA 無料します。Agarose が溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。37 ° C の水浴必要になるまでにボトルを置きます。注:さらに、DNA の巻き戻しの時間といくつかの電気泳動の要因23agarose 濃度の影響を検討した Azqueta et al., ?…

Representative Results

ひと誘導多能性幹細胞の培養や DNA の完全性の測定として使用された DNA 損傷とテール モーメント コメットアッセイによって分析されました。iPS 細胞は、低融点アガロースに埋め込まれているされ、ガラス スライド上に配置。セルは、スーパー コイル DNA を取得する、アルカリ溶液に続いての換散バッファーと扱われた。ユーグレナグラシリス、electrophoresed し、彗?…

Discussion

DNA の完全性は、細胞の完全性を描いています。損傷 DNA と細胞ストレスが多いし、最終的にその整合性を失います。幹と幹細胞由来の細胞が移植を目的として伝達されているの整合性は、その目的の機能を実行するセルのプリンシパルです。損傷 DNA と細胞移植生着不全率と細胞8,20のパフォーマンスになります。したがって、細胞移植前に DNA の検…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国立心臓、肺、血液研究所助成金 RO1-HL-99507、によって部分で支えられた HL-114120 UO1 HL-134764 (j. 張) に、HL138023、HL 131017、アメリカ心臓協会の科学的な開発補助金 17SDG33670677 (R. Kannappan) します。

Materials

0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG
Jackson Immuno
Research Laboratories
711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories
711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

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Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

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