Summary
I denne protokol, vi viser, hvordan opdrætte Astyanax mexicanus voksne, hæve larverne, og udføre hele-mount Immunhistokemi på post larve fisk at sammenligne fænotyper af overfladen og hule morphotypes.
Abstract
Floden og grotte-tilpasset populationer af Astyanax mexicanus viser forskelle i morfologi, fysiologi og adfærd. Forskning fokuseret på sammenligne voksen former har afsløret det genetiske grundlag for nogle af disse forskelle. Mindre er kendt om hvordan befolkningen er forskellige på post larve stadier (i starten af fodring). Sådanne studier kan give indsigt i hvordan cavefish overleve gennem voksenalderen i deres naturlige miljø. Metoder til at sammenligne post larve udvikling i laboratoriet kræver standardiserede akvakultur og fodring regimer. Her beskriver vi hvordan man hæve fisk på en diæt af næringsrige hjuldyr i ikke-recirkulerende vand i op til to uger post befrugtning. Vi demonstrere, hvordan indsamler post larve fisk fra denne børnehave system og udføre hele-mount immunfarvning. Immunfarvning er et attraktivt alternativ til transgen udtryk analyse for at undersøge udviklingen og genfunktion i A. mexicanus. Metoden børnehave kan også bruges som en standardprotokol for etablering af tæthed-matchede befolkninger for vækst til voksne.
Introduction
Den mexicanske tetra Astyanax mexicanus, er en enkelt arter af fisk, der findes som river-bolig populationer (overflade fisk) og en række hulen-boligen populationer (cavefish) opkaldt efter de huler, de bebor (dvs., Tinaja, Molino, Pachón). Et stigende antal forskere bruger A. mexicanus til at undersøge de genetiske og udviklingsmæssige baser adfærdsmæssige1,2,3,4, metabolisk5,6 ,7,8, og morfologiske evolution9,10,11. Tilgængelige ressourcer til undersøgelser af A. mexicanus omfatter en sekventeret og kommenteret genom12; transkriptom13; udviklingsmæssige midlertidige tabel14; og metoder for avl15,16,17, oprette transgenics18, og redigere gener19. Formidling af yderligere værktøjer og opdaterede standardprotokoller vil accelerere vækst af Fællesskabets cavefish forskning (Se denne metoder samling20).
Vores mål er at tilføje til det eksisterende repertoire af værktøjer ved at give en robust metode til vurdering af gene aktivitet i situ i post larve A. mexicanus, på en måde, der er sammenlignelige mellem laboratorier. Der er to udfordringer for at nå dette mål. Først, der er behov for standardiseret regimer rugeæg og hæve fisk mellem laboratorier, som forskelle i parametre såsom fodring og tæthed påvirker vækst og modning, derved påvirker genaktivitet. Andet er der behov for en standardiseret endnu fleksibel metode til at undersøge mønstre af genaktivitet i post larve fisk. Vi løser disse problemer her, etablere standard praksis for at hæve fisk til post larve faser og indføre en robust hele-mount Immunhistokemi (IHC) protokol for at vurdere genekspression i A. mexicanus.
Vi viser først, hvordan at avle fisk gennem naturlig gydning og identificere befrugtede æg. Beskrevet næste er, hvordan man luge befrugtede æg (larver) og overføre dem til børnehave beholdere, hvor de er vedligeholdt med en tæthed på 20 fisk per container for to uger uden recirkulerende eller ændre vandet. På 5-dages post befrugtning, fisk har udviklet til post larve faser (ikke længere at have en æggeblomme forsyning) og leveres alger-fed Brachionus plicatilis (hjuldyr) som en næringsrig mad kilde, der ikke kræver daglig genbestilling. Denne metode giver ensartet vækst parametre for larver og post larve udvikling.
For at vurdere genfunktion, vise vi hvordan du fjerne fisk fra børnehave containere og udføre hele-mount IHC. Metoden IHC præsenteret er tilpasset fra protokoller udviklet til brug med Danio rerio21 og er effektiv til at undersøge antigener i alle A. mexicanus væv testet, herunder hjernen, tarmen og bugspytkirtlen. IHC er et hurtigere alternativ til generering af transgene dyr undersøgelse af genekspression og protein lokalisering. Denne protokol vil være nyttig for undersøgelser rettet mod voksende A. mexicanus og sammenligning fænotyper overflade fisk og cavefish på post larve stadier.
Protocol
Procedurerne i denne protokol er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Harvard Medical School.
1. avls
Bemærk: Der er flere offentliggjorte metoder til avl15,16,17,20 , der også kunne bruges på dette trin. Tidligere hen til opdragelse, voksne fisk er fastholdt på et 10:14 lys: mørke cyklus på 23 ° C og fodret en pellet kost (Se tabel af materialer) én gang dagligt. Fisk kan være opdrættet i en recirkulerende system med mekanisk filtrering og UV sterilisation. Avl kan også ske i statisk (ikke recirkulerende) tanke, men fisk bør ikke være tilbage i en statisk tank for mere end 3 dage, da vandkvaliteten hurtigt nedbrydes.
- Fyld en 5 gal tanken med fisk-klar vand (dechlorinated vand tilpasses: pH = 7.1 +/-2, ledningsevne = 900 +/-150 µS, temperatur = 23 ° C).
- Placer plast mesh (Se materialer) i bunden af tanken. Hvis avl i tanke, anbringe en vandvarmer til siden af tanken. Hvis avl i en recirkulerende system, skal du placere en vandvarmeren i system sump.
Bemærk: Plast masken forhindrer voksne fra forbruge æg. - Sted en kvindelige og to mandlige A. mexicanus fiske på mere end 1 år gammel i tanken. Tillad fisk at acclimate til 30 min.
- Indstil temperaturen af ovnen til 24 ° C (eller 1 ° C varmere end den begyndende temperatur).
- Efter 24 h, øge temperaturen med 1 ° C.
- Efter 24 h, øge temperaturen med 1 ° C. Kontrollere tanke dagligt for æg ved skinner en lommelygte ind i bunden af tanken. Tilbageholde fisk fra mad i denne 3-dages periode.
- Hvis gydningen ikke har blevet induceret efter 3 dage, slukke ovnen og lad vandet for at vende tilbage til stuetemperatur (RT) før flytte fisk til deres originale tank.
2. rugeæg befrugtede æg
- Når æggene er identificeret i en formering tank, fjerne voksne og plast mesh, og reducere vandet i en dybde på 10 cm ved hjælp af et bægerglas eller kop.
Bemærk: For at vurdere tidspunktet for æglægning, bruge en overførsel pipette til at placere flere æg i en petriskål og se dem med et stereomikroskop til at bestemme scenen14 og vurdere tidspunktet for befrugtning. - Flytte tanken til en praktisk arbejdsoverflade og fjerne enhver uigennemsigtig æg eller afføring, forlader kun de gennemsigtige, frugtbare æg i tanken.
Bemærk: Antallet af frugtbare æg kan optages på dette tidspunkt. - Fyld tanken med fisk-klar vand (Se trin 1.1) og tilføje 6-7 dråber methylenblåt til tanken, som vandet fylder.
NOTE: Den endelige koncentration af methylenblåt er ca 1,5 ppm. - Tilføje et varmeapparat og akvariet Bobleflasken (knyttet til en luftpumpe, med en regulator) til tanken.
- Indstil ovnen til 24 ° C og justere airstream regulator til at producere en blide strøm af bobler.
- Placer en dækning på tank til at opretholde vandets temperatur.
Bemærk: Æggene skal begynde rugeæg inden for 24 timer af de gydende tid.
3. overførsel af skraveret larver til børnehave containere
- Der tilsættes 20 g salt (Se materialer) 8 L af fisk-klar vand (Se trin 1.1) og rør indtil opløst. Fyld hver 1,5 L børnehave container (Se materialer) med 1 L af den forberedte vand.
- Brug overførsel pipette til at flytte skraverede larver til rede børnehave beholdere med en tæthed på 20 fisk per container.
Bemærk: En forlygte kan være nyttig til at lokalisere og overføre de skraverede larver. - Efter alle de synlige udklækkes larver er blevet fjernet, agitere vand i tanken ved omrøring, og/eller blæser vandstråler ind i kanter og hjørner af tank med en pipette.
Bemærk: Dette vil hjælpe med at afsløre larver, der var savnet på den første pass. - Bortskaffe ubrugte larver på dette tidspunkt ved hjælp af retningslinjer for Office af laboratoriet velfærd (OLAW). Tilføjes tank til at opnå en endelig koncentration på 6.15% natriumhypochlorit. Vent mindst 5 min før hælde ned i vasken.
- Label hver børnehave container med datoen og tidspunktet for befrugtning. Se Gartneriet containere dagligt og fortsætte med at fjerne eventuelle døde larver.
4. forberedelse af Rotifer-baseret fisk mad
- Se Tabel af materialer for at få oplysninger om anskaffelse af hjuldyr. Følg den refererede protokollen for at oprette, vedligeholde og høste hjuldyr22.
- Forberede fisk mad ved tilsætning af 3 mL af alger blanding (Se Tabel af materialer) til 1 L af høstede hjuldyr. Denne blanding tilsættes direkte til Gartneriet containere som en fødevareforsyning.
5. fodring af post larve fisk
- Når fisken er 5 dage efter befrugtningen (dpf), 3 mL fiskefoder (udarbejdet i trin 4.2) tilsættes til hver børnehave container. På den optimal tæthed, skal hjuldyr være synlig i tætte grupper i hjørnerne af containerne, børnehave, og mindre synlige i midten af beholderen. Tilføj yderligere rotifer blandingen, indtil den passende tæthed er nået.
- Kontrollere containere dagligt til tilstedeværelsen af hjuldyr og tilføje flere, hvis koncentrationen bliver forarmet. Fortsætte med at fjerne eventuelle døde larver.
- Når fisk nå 14 dpf, flytte dem til en tank passer med en recirkulerende system med en tæthed af 5 fisk/liter vand.
Bemærk: Antallet af overlevende efter larve fisk kan optages på dette tidspunkt.
6. hele-mount Immunhistokemi post larve fisk
- Fjern post larve fisk af den ønskede scene fra mad i 24 timer ved at hælde børnehave beholder indeholdende fisk gennem et nylon mesh si og placere en si i en beholder med rent fisk-klar vand (Se trin 1.1).
Bemærk: Det er vigtigt at fjerne alle fødevaren. Selv små mængder af fødevarer i tarmen er auto-fluorescerende og vil påvirke billeddannelse. - Indsamle og aflive fisken.
Bemærk: Aktiv dødshjælp-protokollen skal følge OLAW retningslinjer og godkendes af din institutionelle Animal Care og brug udvalget. Vi har bemærket, at tricaine alene ikke aflive post larve fisk, og fiskene begynder at bevæge sig når overføres fra tricaine til fiksativ, hvis fisken ikke også holdes på is.- Forbered tricaine løsning i et bægerglas ved at tilføje 0,4 g tricaine-Sørensen og 0,8 g natriumbicarbonat at 1 L deioniseret vand, og placere den på is.
- Hæld vand indeholdende fisk gennem et nylon mesh si at indsamle fisk. Forsigtigt nedsænkes si i iskold Tricaine løsning og overlade det i isbad i 10 min.
- Fix det aflivede fisk.
- Brug overførsel pipette med et cut tip til at overføre fisken til en konisk slange.
- Fjerne Tricaine løsningen med en overførsel pipette og erstatte med fiksativ. Inkuber med vuggende.
Bemærk: Fiksativ og fiksering tid skal bestemmes baseret på antistof anvendes. 10% formalin løsning (4% formaldehyd, se materialer) natten over ved 4 ° C er passende for de antistoffer, der er anført i Tabel af materialer.
Forsigtig: Formalin er giftige og brandfarlige. Bære personlige værnemidler (handsker, laboratoriekittel og splash beskyttelsesbriller) og håndtere i en kemisk hætte. Opløsninger indeholdende formalin skal bortskaffes som farligt affald. - Bruge en overførsel pipette til fjern forsigtigt fiksativ uden at forstyrre fisken. Tilføj 3 mL af phosphat bufferet saltvand-triton løsning [PBS med 0,1% Triton (PBST), se materialer] og Inkuber i 15 min. ved RT med vuggende.
- Fjern PBST og erstatte med frisk PBST og inkuberes for 15 min. Gentag dette "vask" en ekstra gang.
Bemærk: Fisk kan gemmes i PBS, som indeholder 0,02% natriumazid ved 4 ° C i flere uger.
- Udføre hele-mount immunfarvning.
- Forberede 50 mL blokerende løsning [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovint serumalbumin (BSA), 1% dimethylsulfoxid (DMSO), 0.02% natriumazid, 5% æsel serum].
Forsigtig: Natriumazid og DMSO er giftige. Personlige værnemidler (handsker, laboratoriekittel og splash beskyttelsesbriller) bør anvendes, når du håndterer. Enhver løsninger skal bortskaffes som farligt affald. - Bruge en overførsel pipette til at overføre fisken til en 4 mL hætteglas med skrue-top cap. Brug overførsel pipette til at fjerne PBST og tilsættes 3 mL blokerende løsning. Inkuber i 1 time på RT med vuggende.
- Brug overførsel pipette til at fjerne blokering løsningen og tilføje primære antistof fortyndet i blokerende løsning. Der inkuberes natten over ved stuetemperatur med agitation.
Bemærk: For eksempel tilføje 1:250 fortynding af anti-HuC/HuD Neuronal Protein mus monoklonalt antistof (Se Tabel af materialer til en liste af antistoffer, der er brugt med succes i A. mexicanus). Et sæt af fisk med ingen primære antistof tilføjet bør medtages på dette trin. Volumen af antistof bør være nok til at dække fisken og give mulighed for agitation. - Vask fisk 3 gange med PBST, som beskrevet i trin 6.3.4. Erstatte PBST med sekundær antistof fortyndet i blokerende løsning og inkuberes natten over ved RT med agitation.
Bemærk: Optimale primær og sekundær antistof koncentrationer, inkubationstiden og inkubation temperaturen bør fastsættes for hver antistof. Overnatning på RT var effektiv for de antistoffer, der er anført i Tabel af materialer. - Vask fisk 3 gange med PBST med hver vask varig 15 min som beskrevet i trin 6.3.4.
- Overføre fisken til PBS for kortvarig oplagring inden igangsættelsen af dissekere, montering, eller skære fisken.
- Forberede 50 mL blokerende løsning [PB-0.5% Triton X, 0,2% bovint serumalbumin (BSA), 1% dimethylsulfoxid (DMSO), 0.02% natriumazid, 5% æsel serum].
Representative Results
Tabel 1 viser succes i løbet af et års avl overflade fisk og Tinaja, Molino og Pachón cavefish i statisk opdræt tanke. Overflade og Pachón gyder med befrugtede embryoner altid produceret udklækkes larver, mens Molino og Tinaja var mislykket, noget af tiden (2/6 og 2/18 gydning begivenheder ikke producere skraverede larver, henholdsvis). Der er variation i kobling størrelse, der ikke tilsyneladende tilskrives alder af overordnede fisk. Tabel 2 viser det samlede antal skraverede larver som følge af nogle af de gydende begivenheder, og alder af de overordnede fisk. I almindelighed, vi har fundet at overflade fisk giver det største antal larver pr. gyde (gennemsnitlig 1.550 ± 894, n = 5), efterfulgt af Pachón (gennemsnitlig 879 ± 680, n = 6), Tinaja (gennemsnitlig 570 ± 373, n = 11), og Molino (gennemsnitlig 386 ± 276, n = 3). Antallet af larver produceret er typisk mere end der er behov for pr. eksperiment eller for vækst til voksne. Vi typisk oprettet 6-18 børnehave containere (120-360 larver) og aflive den resterende fisk.
For at måle succesen af Planteskole-protokollen registreres vi antallet af udklækkede larver og overlevende efter larve fisk fra vellykkede gydning arrangementer. Tabel 3 viser data fra 1 måned af avl i recirkulerende kampvogne og omfatter antallet af larver overført til børnehave beholdere, at overlevet til 14 dpf. I løbet af denne måned, overlevelsesraten varierede fra 41-81 procent, hvilket resulterer i 65-293 fisk til rådighed pr. befolkning for eksperimenter eller vækst til voksne.
For at afgøre, om hele-mount immunfarvning er vellykket, sammenlignede vi fluorescens af prøverne inkuberes med primær antistof mod de inkuberes med sekundær antistof kun. Den fluorescerende signal er kun synlige i fisk inkuberes med primær antistof. Vi har brugt denne protokol at mærke neuroner10 (figur 1) og pancreas celler6 i faser op til 12,5 dpf i både overflade og hule morphotypes.
Figur 1: Neuron mærkning. Hele-mount immunfarvning af A. mexicanus. Billede af 12,5 dpf overflade fisk (en) og Pachón cavefish (b). Billede af regionen midten krop [skraverede gule disposition vises i (a) og (b)] overflade fisk (c) og Pachón cavefish (d) farves med pan-neuronal antistof (Hu). (e) Confocal billede af en region med overflade fisk tarmen viser enteriske neuroner (Hu) og deres fremskrivninger (acetyleret tubulin). For dette billede, var tarmen dissekeret ud og monteret i medium indeholdende DAPI for at plette kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| befolkningen | forsøg på | gydende begivenheder | koblinger |
| overflade | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabel 1: sammendrag af data fra det ene år med avl af A. mexicanus i statisk tanke. Antallet af ynglende forsøger, resulterer gydning begivenheder, og antallet af gydende begivenheder, der produceres udklækkes larver.
| befolkningen | overordnede alder | skraveret larver |
| overflade | 1 år | 989 |
| overflade | 1 år | 1050 |
| overflade | 3 år | 2214 |
| overflade | 3 år | 432 |
| overflade | 3 år | 1768 |
| overflade | 4 år | 2852 |
| Pachón | 1 år | 1194 |
| Pachón | 1 år | 1933 |
| Pachón | 1,5 år | 371 |
| Pachón | 3 år | 480 |
| Pachón | 4 år | 1190 |
| Pachón | 4 år | 110 |
| Tinaja | 9 måneder | 259 |
| Tinaja | 9 måneder | 253 |
| Tinaja | 10 måneder | 1100 |
| Tinaja | 11 måneder | 857 |
| Tinaja | 1 år | 713 |
| Tinaja | 1 år | 853 |
| Tinaja | 1 år | 542 |
| Tinaja | 1,5 år | 360 |
| Tinaja | 1,5 år | 58 |
| Tinaja | 1,5 år | 1100 |
| Tinaja | 4 år | 185 |
| Molino | 2,5 år | 460 |
| Molino | 2,5 år | 619 |
| Molino | 3 år | 81 |
Tabel 2: anslået kvindelige alder og antallet af udklækkede larver fra individuelle gydende begivenheder fra de angivne populationer af A. mexicanus.
| befolkningen | forsøg på | gydende begivenheder | koblinger | kobling størrelse | Larverne overført til børnehave kopper | post larve fisk på 14dpf | overlevelse (%) |
| overflade | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabel 3: oversigt over data fra en måned af avl A. mexicanus i en recirkulerende system og hæve larverne. Antallet af ynglende forsøg, der følger koblinger gydning begivenheder, produceres skraverede larver, gennemsnitlige antal larver pr. kobling, larver overføres til børnehave containere, og post larve fisk findes i børnehave beholdere efter 14 dage.
Discussion
Sammenligne genaktivitet mellem overfladen og cave kræver A. mexicanus nøje kontrolleret miljøparametre og metoder, der kan genskabes på tværs af laboratorier. Vores protokol for at hæve A. mexicanus giver konsekvent ernæringsmæssige indhold under post larve udvikling. Efter denne fodring regime, kan genfunktion sammenlignes trygt mellem befolkninger ved hjælp af robust Immunhistokemi protokollen præsenterer vi. Her kan vi diskutere betydningen af denne metode samt dens begrænsninger og fremtidige applikationer.
For at opnå tæthed-matchede vækst, fandt vi, at efter larve fisk kan hæves uden recirkulerende vand i to uger i 1,5 L containere på en diæt af hjuldyr. Denne protokol kan også bruges til at hæve fisk på en recirkulerende system; dog skal hjuldyr tilføjes dagligt til at kompensere for de mistede gennem tank udstrømning. Nyklækkede Artemia nauplii er almindeligt anvendt som en fødekilde i akvakultur, men vi fandt, at bruge hjuldyr har betydelige fordele, herunder: reduceret pris, forbedret biosikkerhed, konsekvent ernæring og bedre vandkvalitet (se nedenfor).
Først, den ugentlige omkostningerne i forbrugsvarer er 4 dollars for hjuldyr, i forhold til 14 dollars for Artemia. Med hensyn til biosikkerhed, hjuldyr er rejst i laboratorium under kontrollerede forhold, mens Artemia er indsamlet fra naturen og underlagt naturlig variation i mikrobiel eller patogen indhold23. Derudover er den ernæringsmæssige sammensætning af Artemia nauplii miljømæssigt målrettet og derfor inkonsekvent. Nauplii trives på deres egen energi butikker efter klækning; de miste hurtigt næringsværdi som de udvikle og bør optimalt fodres til fisk i flere timer. Artemia begynde fodring på 12 hus efter udklækning, der repræsenterer den første gang, at de kunne være ernæringsmæssigt beriget; dog på nuværende tidspunkt er de blevet for stor til 5 dpf fisk til at forbruge. I sammenligning feed hjuldyr løbende på marine mikroalger resulterer i høje næringsstofindhold uanset hvornår hjuldyr er høstet. Hjuldyr er meget mindre end Artmeia nauplii (160 vs 400 mikron), hvilket gør dem lettere for fisk at fange og sluge. Post larve overflade fisk og cavefish forbruge hjuldyr i lignende mængder tyder på nogen forskel i præference eller evnen til at fange hjuldyr10.
Endelig begynde Artemia nauplii at dø i ferskvand flere timer efter at være indført. Uspist nauplii henfalder hurtigt faldende vandkvaliteten, hvis de ikke fjernes manuelt. Fjerner døde Artemia er tidskrævende og farlige for post larve fisk, der er ikke meget større end Artemia og kan være ved et uheld fjernet eller skadet. Hjuldyr kan leve på ubestemt tid i børnehaven containere og levere mad til fisk på alle tidspunkter uden væsentligt påvirker vandkvaliteten.
Mens ved hjælp af hjuldyr, som en fødekilde har betydelige fordele til at opretholde rotifer lager, alger skal føjes til kultur-systemet dagligt. Dette kan opnås med en automatisk arkføder, der dispenserer flydende alger i rotifer kultur beholder (Se Tabel af materialer). Hjuldyr skal også høstes fra dette set-up hver 24-48 timer for at bevare sundheden for kulturen. Forskere, at avle fisk meget sjældent (en gang om året, for eksempel) og er ikke bekymret med sammenligninger mellem befolkninger på post larve stadier kan foretrækker Artemia som en fødekilde, da de encysted embryoer kan blive udklækket til enhver tid.
Vi anbefaler, registrering af antallet af udklækkede og overlevende larver til at overvåge succesen af rugeæg og vækst. Hvis de fleste af embryoner eller larver dør, kan det skyldes bakterie- eller svampeinfektion forurening. Det anbefales at overvåge vandkvaliteten i fisk-klar vand og sterilisere udstyr med 70% ethanol. Børnehave beholdere kan bruges igen, efter at de er rengjort og steriliseret. For at minimere risikoen for sygdom, er det også afgørende for at fjerne eventuelle døde fisk fra børnehave-beholdere og ikke tilføje hjuldyr før 5 dpf, når fisken begynder at spise.
A. mexicanus er kønsmodne omkring et år gammel. Dette er en begrænsning for at skabe transgene A. mexicanus i forhold til Danio rerio (zebrafisk) der er i stand til at avle på 10-12 uger24. Immunhistokemi (IHC) er en alternativ metode til at undersøge genekspression og protein lokalisering. Protokollen beskrevet her kan tilpasses på hvert trin og bruges til at afsløre antigener i væv af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at nogle væv kan være sværere at visualisere i overflade fisk på grund af pigmentering (en barriere, der ikke findes i unpigmented cavefish), som kan påvirke fortolkningen af sammenlignende undersøgelser. For at imødegå dette potentielle problem, kan overflade fisk pigment være bleget efter fiksering ved hjælp af 3% brintoverilte.
IHC kræver vellykkede væv fiksering, blokering, og antistof penetration. Metoder for hvert varierer afhængigt af de væv og protein af interesse. Fiksativ og fiksering tiden skal bevare celle arkitektur samtidig opretholde antigen epitop. For denne protokol, vi bruger tværbindingsmidler fiksativ (PARAFORMALDEHYD) og udelader en denaturering fiksativ (såsom methanol eller acetone). Vi fandt, at inkubation i acetone formindsket antistof signal for neuronal og pancreas markører. Den blokerende skridt er afgørende for at forhindre antistoffer bindende for ikke-målarter proteiner i vævet. Denne metode bruger en kombination af normale serum (5%) og BSA (0,2%) i den blokerende løsning. Den blokerende løsning indeholder antistoffer og proteiner der binder til reaktive steder på proteiner i væv, faldende ikke-specifik binding af de primære og sekundære antistoffer.
For at opnå antistof penetration, skal være permeabilized væv. Dette kan opnås med rengøringsmidler eller denaturering opløsningsmidler men skal optimeres for at bevare antigen epitop. Vores protokol bruger en kombination af Triton og dimethyl sulfoxid (DMSO). Triton og DMSO er inkluderet i blokering og antistof inkubation skridt i koncentrationer på 0,5% og 1%, henholdsvis. Ved hjælp af denne koncentration, har vi observeret farvning i hjerne, bugspytkirtel, tarm og muskel, tyder på, at det er sandsynligt, effektivt for indtrængning af alle væv. Fisk størrelse kan også påvirke penetration. Denne protokol er ikke blevet testet på fisk, der er større end 14 dage gamle (ca. 7 mm i længden). For at foretage fejlfinding af farvning, anbefales det at ændre fiksering, blokering, og antistof penetration trin. Det er også vigtigt at undersøge sekvens bevarelse af immunogenerne med A. mexicanus protein af interesse ved hjælp af de tilgængelige genom25.
A. mexicanus er en fremragende model til at undersøge udviklingen som de samme arter, som har udviklet sig i dramatisk forskellige miljøer kan sammenlignes direkte i laboratoriet. Standard dyrehold protokoller, både inden for og mellem laboratorier, er nødvendigt for at forstå de biologiske forskelle mellem overflade fisk og cavefish. Vores artikel beskrives en metode til at undersøge udviklingen og genaktivitet i post larve fisk udsættes for konsekvent vækst parametre.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189 (2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659 (2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
