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Genetics

पोस्ट-लार्वा Phenotypes और पूरे-माउंट Immunohistochemistry के विश्लेषण के लिए मैक्सिकन टेट्रा Astyanax mexicanus स्थापना

Published: December 28, 2018 doi: 10.3791/58972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Harvard Medical School

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शन कैसे Astyanax mexicanus वयस्कों नस्ल, लार्वा जुटाने के लिए, और पोस्ट-लार्वा मछली पर पूरे माउंट immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए सतह और गुफा phenotypes की morphotypes तुलना करें ।

Abstract

Astyanax mexicanus के नदी और गुफा-अनुकूलित आबादी आकृति विज्ञान, फिजियोलॉजी, और व्यवहार में अंतर दिखाएँ । वयस्क रूपों की तुलना पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान इन मतभेदों में से कुछ के आनुवंशिक आधार से पता चला है । कम के बारे में जाना जाता है कि आबादी के बाद लार्वा चरणों में अलग (खिलाने की शुरुआत में) । इस तरह के अध्ययनों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है कैसे cavefish अपने प्राकृतिक वातावरण में वयस्कता के माध्यम से जीवित रहते हैं । प्रयोगशाला में लार्वा विकास के बाद की तुलना के लिए तरीके मानकीकृत जलीय कृषि और खिला शासन की आवश्यकता है । यहां हम वर्णन कैसे पोषक तत्वों की एक आहार पर मछली बढ़ाने के लिए गैर में-परिसंचारी पानी के लिए दो हफ्तों के बाद निषेचन के लिए जल rotifers । हम इस नर्सरी प्रणाली से पोस्ट-लार्वा मछली इकट्ठा करने और पूरे माउंट immunostaining प्रदर्शन करने के लिए कैसे प्रदर्शन करते हैं । Immunostaining एक mexicanusमें विकास और जीन समारोह की जांच के लिए transgene अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक आकर्षक विकल्प है । नर्सरी विधि भी वयस्कों में विकास के लिए घनत्व मिलान आबादी की स्थापना के लिए एक मानक प्रोटोकॉल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax mexicanus, मछली की एक प्रजाति है कि नदी के रूप में मौजूद है आबादी (सतह मछली) और गुफा के एक नंबर आवास आबादी (cavefish) गुफाओं वे निवास के लिए नाम (यानी, Tinaja, Molino, Pachón) । शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या का उपयोग कर रहे हैं एक. mexicanus व्यवहार के आनुवंशिक और विकास के ठिकानों की जांच करने के लिए1,2,3,4, चयापचय5,6 ,7, 8, और रूपात्मक विकास9,10,11। a. mexicanus की पढ़ाई के लिए उपलब्ध संसाधन एक अनुक्रम और व्याख्या जीनोम12शामिल हैं; transcriptome13; विकास स्टैगिंग तालिका14; और15,16,17प्रजनन के लिए तरीके,18transgenics बनाने, और संपादन जीन19। अतिरिक्त उपकरणों के प्रसार और अद्यतन मानक प्रोटोकॉल cavefish अनुसंधान समुदाय के विकास में तेजी लाने (इस तरीके संग्रह20देखें) होगा ।

हमारा लक्ष्य प्रयोगशालाओं के बीच तुलनीय तरीके से, पोस्ट-लार्वा a. mexicanusमें सीटू में जीन गतिविधि का आकलन करने के लिए एक सुदृढ़ विधि प्रदान करके उपकरणों की मौजूदा प्रदर्शनियों को जोड़ने का है. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए दो चुनौतियाँ हैं. पहले, वहां के लिए मानकीकृत सरकारों के लिए एक की जरूरत है सेने और प्रयोगशालाओं के बीच मछली स्थापना, जैसे कि भोजन और घनत्व को प्रभावित विकास और परिपक्वता के रूप में मानकों में अंतर है, जिससे जीन गतिविधि प्रभावित । दूसरा, वहां के बाद लार्वा मछली में जीन गतिविधि के पैटर्न की जांच के लिए एक मानकीकृत अभी तक अनुकूलनीय विधि के लिए एक की जरूरत है । हम इन मुद्दों पर यहां पता, के बाद लार्वा चरणों के लिए मछली स्थापना के लिए मानक प्रथाओं की स्थापना और एक मजबूत पूरे-माउंट immunohistochemistry (आइएचसी) एक. mexicanusमें जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का परिचय ।

हम पहले प्रदर्शित कैसे प्राकृतिक के माध्यम से मछली नस्ल को पैदा करने और निषेचित अंडे की पहचान । अगले वर्णित है कैसे निषेचित अंडे (लार्वा) हैच और उंहें नर्सरी कंटेनरों, जहां वे दो सप्ताह के लिए कंटेनर प्रति 20 मछली के एक घनत्व पर recirculat या पानी बदलने के बिना बनाए रखा जाता है हस्तांतरण के लिए । 5 दिनों के बाद निषेचन, मछली के बाद लार्वा चरणों (अब एक जर्दी की आपूर्ति होने) विकसित किया है और शैवाल खिलाया Brachionus plicatilis (rotifers) एक पोषक तत्व युक्त खाद्य स्रोत है कि दैनिक भरपाई की आवश्यकता नहीं के रूप में प्रदान की जाती हैं । इस विधि लार्वा और पोस्ट-लार्वा विकास के लिए लगातार वृद्धि मापदंडों प्रदान करता है ।

जीन समारोह का आकलन करने के लिए, हम प्रदर्शन कैसे नर्सरी कंटेनरों से मछली निकालने के लिए और पूरे माउंट आइएचसी प्रदर्शन । आइएचसी विधि प्रस्तुत ढाणियो rerio21 के साथ प्रयोग के लिए विकसित प्रोटोकॉल से अनुकूलित है और सभी A. mexicanus ऊतकों परीक्षण में एंटीजन की जांच के लिए प्रभावी है, मस्तिष्क सहित, आंत, और अग्ंयाशय. आइएचसी जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की परीक्षा के लिए ट्रांसजेनिक पशुओं पैदा करने के लिए एक तेजी से विकल्प है । यह प्रोटोकॉल ए. mexicanus उगाने के उद्देश्य से अध्ययनों के लिए उपयोगी होगा और पश् लार्वा चरणों में सतह मछली और cavefish के phenotypes की तुलना करना ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. प्रजनन

नोट: प्रजनन के लिए कई प्रकाशित तरीकों15,16,17,20 कि भी इस कदम पर इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रजनन से पहले, वयस्क मछली एक 10:14 प्रकाश पर बनाए रखा: 23 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे चक्र और एक गोली आहार खिलाया ( सामग्री की तालिका देख) एक बार दैनिक कर रहे हैं । मछली यांत्रिक निस्पंदन और यूवी नसबंदी के साथ एक परिसंचारी प्रणाली में पैदा किया जा सकता है । प्रजनन भी स्थिर (गैर परिसंचारी) टैंक में पूरा किया जा सकता है, लेकिन मछली एक स्थिर टैंक में अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए नहीं छोड़ा जाना चाहिए, पानी की गुणवत्ता के रूप में जल्दी नीचा ।

  1. मछली के लिए तैयार पानी (dechlorinated के लिए समायोजित पानी के साथ एक 5 लड़की टैंक भरें: पीएच = ७.१ +/-2, चालकता = ९०० +/-१५० µS, तापमान = 23 ° c) ।
  2. जगह प्लास्टिक जाल ( सामग्रीदेखें) टैंक के तल में । यदि स्थैतिक टैंक में प्रजनन, टैंक के पक्ष में एक पानी हीटर प्रत्यय । यदि एक पुनर्संचारण प्रणाली में प्रजनन, जगह प्रणाली नाबदान में एक पानी हीटर ।
    नोट: प्लास्टिक मेष अंडे लेने से वयस्कों को रोकता है ।
  3. टैंक में 1 वर्ष से अधिक आयु के एक महिला और दो पुरुष A. mexicanus मछली प्लेस । 30 मिनट के लिए acclimate मछली की अनुमति दें ।
  4. 24 ° c (या 1 प्रारंभिक तापमान से गर्म ° c) के लिए हीटर का तापमान सेट करें ।
  5. 24 घंटे के बाद, 1 डिग्री सेल्सियस से तापमान में वृद्धि ।
  6. 24 घंटे के बाद, 1 डिग्री सेल्सियस से तापमान में वृद्धि । टैंक के नीचे में एक टॉर्च चमक द्वारा अंडे के लिए दैनिक टैंक की जांच करें । इस 3 दिन की अवधि के दौरान भोजन से मछली रोक ।
  7. अगर अंडे 3 दिन के बाद प्रेरित नहीं किया गया है, बंद हीटर बारी और पानी के कमरे के तापमान पर लौटने के लिए (आरटी) उनके मूल टैंक के लिए मछली जाने से पहले की अनुमति ।

2. सेने निषेचित अंडे

  1. एक बार एक प्रजनन टैंक में अंडे की पहचान कर रहे हैं, वयस्कों और प्लास्टिक मेष निकालें, और एक चोंच या कप का उपयोग कर 10 सेमी की गहराई के लिए पानी को कम ।
    नोट: अंडे के समय का अनुमान करने के लिए, एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए एक पेट्री पकवान में कई अंडे जगह और उंहें एक stereomicroscope के साथ देखने के लिए मंच14 निर्धारित करने और निषेचन के समय का अनुमान है ।
  2. एक सुविधाजनक काम सतह के लिए टैंक हटो और किसी भी अपारदर्शी अंडे या मल को हटाने, टैंक में केवल पारदर्शी, उपजाऊ अंडे छोड़ने ।
    नोट: इस समय उपजाऊ अंडों की संख्या दर्ज की जा सकती है ।
  3. मछली के लिए तैयार पानी के साथ टैंक भरें (१.१ कदम देखें) और पानी भरता के रूप में टैंक के लिए methylene नीले रंग की 6-7 बूंदें जोड़ें ।
    नोट: methylene नीले रंग की अंतिम एकाग्रता लगभग १.५ पीपीएम है ।
  4. एक हीटर और मछलीघर bubbler जोड़ें (एक हवाई पंप से जुड़े, एक नियामक के साथ) टैंक के लिए ।
  5. 24 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटर सेट और बुलबुले की एक कोमल धारा का उत्पादन करने के लिए airstream नियामक समायोजित करें ।
  6. पानी के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए टैंक पर एक कवर रखें ।
    नोट: अंडे समय पैदा करने के 24 घंटे के भीतर सेने शुरू कर देना चाहिए ।

3. नर्सरी कंटेनरों में रची गई लार्वा की ट्रांसफर

  1. नमक के 20 ग्राम जोड़ें ( सामग्रीदेखें) मछली के 8 एल के लिए तैयार पानी (१.१ कदम देखें) और हलचल जब तक भंग । प्रत्येक १.५ एल नर्सरी कंटेनर को भरने ( सामग्रीदेखें) 1 के साथ तैयार पानी की l ।
  2. कंटेनर प्रति 20 मछलियों के घनत्व पर तैयार किए गए लार्वा को पिपेट में ले जाने के लिए स्थानांतरण का उपयोग करें ।
    नोट: एक headlamp का पता लगाने और रची लार्वा हस्तांतरण करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
  3. के बाद सभी दिखाई सेने का लार्वा हटा दिया गया है, उत्तेजित करके टैंक में पानी के लिए आंदोलन, और/या पिपेट के साथ टैंक के किनारों और कोनों में पानी जेट उड़ाने ।
    नोट: यह पहली पास पर याद किया गया है कि लार्वा प्रकट करने में मदद मिलेगी ।
  4. प्रयोगशाला कल्याण (OLAW) के कार्यालय के दिशानिर्देशों का उपयोग करके इस स्तर पर अप्रयुक्त लार्वा का निपटान करना । ६.१५% की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए टैंक में सोडियम हाइपोक्लोराइट जोड़ें । नीचे सिंक डालने से पहले कम से 5 मिनट रुको ।
  5. प्रत्येक नर्सरी कंटेनर की तारीख और निषेचन के समय के साथ लेबल । नर्सरी कंटेनरों को रोजाना देखें और किसी भी मृत लार्वा को दूर करने के लिए जारी रखें ।

4. Rotifer आधारित मछली खाना तैयार करना

  1. rotifers प्राप्त करने के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें । 22rotifers सेट अप, बनाए रखने, और फसल के लिए संदर्भित प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  2. फसल rotifers के 1 एल करने के लिए शैवाल मिश्रण के 3 मिलीलीटर ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़कर मछली खाना तैयार करें । यह मिश्रण एक खाद्य आपूर्ति के रूप में नर्सरी कंटेनरों को सीधे जोड़ दिया जाएगा ।

5. पश् लार्वा मछली की फीडिंग

  1. जब मछली 5 दिनों के बाद निषेचन (dpf), मछली भोजन के 3 मिलीलीटर (४.२ कदम में तैयार) प्रत्येक नर्सरी कंटेनर के लिए जोड़ रहे हैं । इष्टतम घनत्व पर, rotifers नर्सरी कंटेनरों के कोनों पर घने समूहों में दिखाई जानी चाहिए, और कम कंटेनर के केंद्र में स्पष्ट है । अतिरिक्त rotifer मिश्रण जब तक उचित घनत्व तक पहुंच गया है जोड़ें ।
  2. rotifers की उपस्थिति के लिए दैनिक कंटेनरों की जांच करें और अधिक जोड़ने अगर एकाग्रता समाप्त हो जाता है । किसी भी मृत लार्वा को हटाने के लिए जारी रखें ।
  3. जब मछली 14 dpf तक पहुंचने के लिए, उंहें एक टैंक फिट करने के लिए 5 मछली के एक घनत्व पर एक पुनर्संचारित प्रणाली के साथ कदम/
    नोट: लार्वा मछली के जीवित होने की संख्या इस समय दर्ज की जा सकती है ।

6. पूरे-माउंट Immunohistochemistry के बाद लार्वा मछली

  1. पोस्ट-लार्वा मछली एक नायलॉन जाल छलनी के माध्यम से मछली युक्त कंटेनर डालने और स्वच्छ मछली के लिए तैयार पानी के साथ एक कंटेनर में छलनी रखने के द्वारा 24 घंटे के लिए भोजन से वांछित मंच के (१.१ कदम देखें) ।
    नोट: यह खाना सभी को दूर करने के लिए आवश्यक है । पेट में भोजन की भी छोटी मात्रा में ऑटो फ्लोरोसेंट है और इमेजिंग प्रभाव होगा ।
  2. मछली को लीजिए और euthanize ।
    नोट: इच्छामृत्यु प्रोटोकॉल OLAW दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए और अपने संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । हमने उल्लेख किया है कि अकेले tricaine लार्वा मछली नहीं euthanize है, और मछली जब tricaine से निर्धारण करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए शुरू अगर मछली भी बर्फ पर नहीं रखा जाता है ।
    1. tricaine-एस के ०.४ ग्राम और सोडियम बिकारबोनिट के ०.८ ग्राम के 1 L को tricaine पानी में जोड़कर एक चोंच में घोल तैयार करें और इसे बर्फ पर लगाएं ।
    2. मछली इकट्ठा करने के लिए एक नायलॉन जाल छलनी के माध्यम से मछली युक्त पानी डालो । धीरे बर्फ में छलनी-शीत Tricaine समाधान जलमग्न और 10 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें ।
  3. euthanized मछली को ठीक करें ।
    1. एक कट टिप के साथ एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए एक शंकु ट्यूब के लिए मछली हस्तांतरण ।
    2. एक अंतरण पिपेट के साथ Tricaine समाधान निकालें और निर्धारण के साथ बदलें । कमाल के साथ मशीन ।
      नोट: निर्धारण और निर्धारण समय एंटीबॉडी इस्तेमाल के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए । 10% formalin समाधान (4% formaldehyde, सामग्री देखें) रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध एंटीबॉडी के लिए पर्याप्त है ।
      चेतावनी: Formalin विषाक्त और ज्वलनशील है । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, लैब कोट, और छप चश्मे) पहनते है और एक रासायनिक हुड में संभाल । formalin युक्त समाधान खतरनाक कचरे के रूप में निपटारा किया जाना चाहिए ।
    3. मछली को अशांत किए बिना नियति को सावधानीपूर्वक निकालने के लिए अंतरण पिपेट का प्रयोग करें । फॉस्फेट बफर खारा-ट्राइटन समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें [०.१% ट्राइटन (PBST) के साथ पंजाब, सामग्रीदेखें] और झूली कुरसी के साथ आर टी पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    4. PBST निकालें और ताजा PBST और 15 मिनट के लिए गर्मी के साथ बदलने के लिए इस "धुलाई" एक अतिरिक्त समय दोहराएं ।
      नोट: मछली कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.०२% सोडियम azide युक्त पंजाब में संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. पूरे माउंट immunostaining प्रदर्शन ।
    1. समाधान अवरुद्ध की ५० मिलीलीटर तैयार [पीबी-०.५% ट्राइटन एक्स, ०.२% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 1% dimethyl sulfoxide (DMSO), ०.०२% सोडियम azide, 5% गधा सीरम] ।
      सावधानी: सोडियम azide और DMSO विषैले होते हैं । व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, लैब कोट, और छप चश्में) जब हैंडलिंग इस्तेमाल किया जाना चाहिए । कोई भी समाधान खतरनाक कचरे के रूप में निपटारा किया जाना चाहिए ।
    2. मछली को स्क्रू टॉप कैप के साथ 4 मिलीलीटर ग् शीशी में ट्रांसफर करने के लिए एक ट्रांसफर पिपेट का प्रयोग करें । PBST को निकालने और 3 मिलीलीटर ब्लॉकिंग समाधान जोड़ने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें । कमाल के साथ आरटी में 1 एच के लिए मशीन ।
    3. अवरोध समाधान को निकालने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें और प्राथमिक एंटीबॉडी को ब्लॉकिंग समाधान में पतला जोड़ें । आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर रात भर गर्मी ।
      नोट: उदाहरण के लिए, जोड़ें 1:250 विरोधी के कमजोर पड़ने-HuC/HuD के प्रोटीन माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एंटीबॉडी की एक सूची है कि सफलतापूर्वक एक. mexicanusमें इस्तेमाल किया गया है के लिए सामग्री की तालिका देखें) । कोई प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मछली का एक सेट इस कदम पर शामिल किया जाना चाहिए जोड़ा । एंटीबॉडी की मात्रा मछली को कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए और आंदोलन के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. PBST के साथ 3 बार मछली धोने के रूप में चरण 6.3.4 में वर्णित है । माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ PBST बदलें समाधान अवरुद्ध में पतला और आंदोलन के साथ आरटी पर रात भर गर्मी ।
      नोट: इष्टतम प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता, मशीन समय, और गर्मी के तापमान प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । आरटी पर रातोंरात सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध एंटीबॉडी के लिए प्रभावी था ।
    5. मछली धो PBST के साथ 3 बार, प्रत्येक 15 मिनट के रूप में कदम 6.3.4 में वर्णित धोने के साथ ।
    6. विच्छेदन के साथ आगे बढ़ने से पहले अल्पकालिक भंडारण के लिए पंजाबियों को मछली हस्तांतरण, बढ़ते, या मछली अनुभाग ।

Representative Results

1 तालिका प्रजनन सतह मछली और Tinaja, Molino, और स्थैतिक प्रजनन टैंक में Pachón cavefish के एक वर्ष के दौरान सफलता से पता चलता है । सतह और Pachón निषेचित भ्रूण के साथ अंडे हमेशा रची लार्वा का उत्पादन किया, जबकि Molino और Tinaja समय के कुछ असफल रहे थे (2/6 और 2/18 अंडे की घटनाओं रचा लार्वा का उत्पादन नहीं था, क्रमशः) । वहां क्लच आकार में भिंनता है कि जनक मछली की उंर के लिए जिंमेदार नहीं दिखाई देता है । 2 तालिका अंडे की घटनाओं में से कुछ के परिणामस्वरूप रचा लार्वा की कुल संख्या से पता चलता है, और माता पिता के मछली की उंर । सामांय में, हमने पाया है कि सतह मछली अंडे प्रति लार्वा की सबसे बड़ी संख्या का उत्पादन (औसत १,५५० ± ८९४, n = 5), Pachón द्वारा पीछा किया (औसत ८७९ ± ६८०, n = 6), Tinaja (औसत ५७० ± ३७३, एन = 11), और Molino (औसत ३८६ ± २७६, एन = 3) । आम तौर पर उत्पादित लार्वा की संख्या प्रति प्रयोग या वयस्कों में वृद्धि के लिए आवश्यक है । हम आम तौर पर 6-18 नर्सरी कंटेनरों (120-360 लार्वा) की स्थापना और शेष मछली euthanize ।

नर्सरी प्रोटोकॉल की सफलता को मापने के लिए हम रची लार्वा की संख्या दर्ज की और सफल बनाने की घटनाओं से पोस्ट-लार्वा मछली जीवित । 3 तालिका पुनर्संचारी टैंक में प्रजनन के 1 महीने से डेटा दिखाता है और नर्सरी कंटेनरों कि 14 dpf के लिए बच के लिए स्थानांतरित लार्वा की संख्या भी शामिल है । इस महीने के दौरान, जीवित रहने की दर 41-81 प्रतिशत से लेकर, प्रयोगों या वयस्कों में वृद्धि के लिए जनसंख्या प्रति उपलब्ध 65-293 मछली में जिसके परिणामस्वरूप ।

अगर पूरे माउंट immunostaining सफल होता है निर्धारित करने के लिए, हम माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ही गर्मी उन लोगों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन के नमूनों की प्रतिदीप्ति की तुलना में । फ्लोरोसेंट संकेत केवल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन मछली में दिखाई दे रहा है । हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक ंयूरॉंस लेबल करने के लिए10 (चित्रा 1) और अग्नाशय कोशिकाओं6 चरणों में १२.५ dpf तक दोनों सतह और गुफा morphotypes में ।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूरॉन लेबलिंग. पूरे-माउंट immunostaining of A. mexicanus. १२.५ dpf सतह मछली की छवि (क) और Pachón cavefish (ख) । मध्य शरीर क्षेत्र की छवि [रची पीली रूपरेखा में दिखाया (a) और (b)] सतह मछली की (c) और Pachón cavefish (d) दाग पैन के साथ-न्यूरॉनी एंटीबॉडी (हू). (ङ) सतह मछली आंत के एक क्षेत्र की फोकल छवि दर्जी न्यूरॉन्स दिखा (हू) और उनके अनुमानों (acetylated tubulin). इस छवि के लिए, आंत बाहर निकाल दिया गया था और नाभिक के दाग के लिए DAPI युक्त मध्यम में घुड़सवार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जनसंख्या प्रयास घटनाओं अंडे चंगुल
सतह ९४ 23 23
Molino ११० 6 4
Pachón १६७ 13 13
Tinaja २४२ 18 16

तालिका 1: प्रजनन के एक वर्ष से डेटा का सारांश A. स्थैतिक टैंक में mexicanus । प्रजनन प्रयासों की संख्या, जिसके परिणामस्वरूप अंडे की घटनाएँ होती हैं, और रची गई लार्वा का उत्पादन करने वाली घटनाओं की संख्या ।

जनसंख्या पैरेंट आयु ने रचा लार्वा
सतह 1 वर्ष ९८९
सतह 1 वर्ष १०५०
सतह 3 साल २२१४
सतह 3 साल ४३२
सतह 3 साल १७६८
सतह 4 साल २८५२
Pachón 1 वर्ष ११९४
Pachón 1 वर्ष १९३३
Pachón १.५ साल ३७१
Pachón 3 साल ४८०
Pachón 4 साल ११९०
Pachón 4 साल ११०
Tinaja 9 महीने २५९
Tinaja 9 महीने २५३
Tinaja 10 महीने ११००
Tinaja 11 महीने ८५७
Tinaja 1 वर्ष ७१३
Tinaja 1 वर्ष ८५३
Tinaja 1 वर्ष ५४२
Tinaja १.५ साल ३६०
Tinaja १.५ साल ५८
Tinaja १.५ साल ११००
Tinaja 4 साल १८५
Molino २.५ साल ४६०
Molino २.५ साल ६१९
Molino 3 साल ८१

तालिका 2: अनुमानित महिला उंर और व्यक्ति के संकेत की आबादी से अंडे की घटनाओं से रची लार्वा की संख्या अ. mexicanus.

जनसंख्या प्रयास घटनाओं अंडे चंगुल क्लच आकार नर्सरी कप में लार्वा स्थानांतरित पोस्ट-14dpf में लार्वा मछली अस्तित्व (%)
सतह 4 3 2 ५७६ & १७२८ ३६० १७४ ४८
Molino 4 2 1 २२८ १५९ ६५ ४१
Tinaja 4 1 1 १९५२ १७५ ९३ ५३
Pachón 4 1 1 १६९६ ३६० २९३ ८१

तालिका 3: एक पुनर्संचारित प्रणाली में प्रजनन a. mexicanus के एक महीने से डेटा का सारांश और लार्वा जुटाने । प्रजनन प्रयासों की संख्या, परिणामस्वरूप अंडे की घटनाओं, चंगुल कि रची लार्वा का उत्पादन, प्रति क्लच लार्वा की औसत संख्या, लार्वा नर्सरी कंटेनरों में स्थानांतरित, और नर्सरी कंटेनरों में लार्वा मछली के बाद 14 दिनों के बाद मौजूद ।

Discussion

सतह और गुफा ए mexicanus के बीच जीन गतिविधि की तुलना सावधानी से नियंत्रित पर्यावरणीय मापदंडों और विधियों कि प्रयोगशालाओं में दोहराया जा सकता है की आवश्यकता है । mexicanus स्थापना के लिए हमारे प्रोटोकॉल के बाद लार्वा विकास के दौरान लगातार पोषण सामग्री प्रदान करता है । इस खिला शासन के बाद, जीन समारोह आत्मविश्वास से आबादी के बीच की तुलना में मजबूत immunohistochemistry प्रोटोकॉल हम वर्तमान का उपयोग कर सकते हैं । यहां हम इस विधि के महत्व के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी सीमाओं और भविष्य के अनुप्रयोगों पर चर्चा।

घनत्व मिलान वृद्धि प्राप्त करने के लिए, हमने पाया है कि पोस्ट-लार्वा मछली rotifers के एक आहार पर १.५ एल कंटेनरों में दो सप्ताह के लिए पानी के बिना परिसंचारी उठाया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल भी एक परिसंचारी प्रणाली पर मछली उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, rotifers टैंक बहिर्वाह के माध्यम से खो उन लोगों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए दैनिक जोड़ा जाना चाहिए । नव रचा Artemia nauplii सामांयतः जलीय कृषि में एक खाद्य स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है, लेकिन हमने पाया है कि rotifers का उपयोग काफी फायदे हैं, सहित: कम कीमत, बेहतर सुरक्षा, लगातार पोषण, और पानी की गुणवत्ता में सुधार (नीचे देखें) ।

सबसे पहले, उपभोग्य सामग्रियों में साप्ताहिक लागत rotifers के लिए 4 डॉलर है, Artemiaके लिए 14 डॉलर की तुलना में । जैविक सुरक्षा के बारे में, rotifers प्रयोगशाला में नियंत्रित परिस्थितियों में उठाया जाता है, जबकि Artemia जंगली से एकत्र कर रहे हैं और माइक्रोबियल या रोगज़नक़ सामग्री23में प्राकृतिक भिन्नता के अधीन । इसके अतिरिक्त, Artemia nauplii के पोषक तत्वों की संरचना पर्यावरण की दृष्टि से निर्धारित कर रहे है और इसलिए असंगत । Nauplii सेने के बाद अपने स्वयं के ऊर्जा भंडार पर पनपे; वे जल्दी से पोषण मूल्य ढीला के रूप में वे विकसित और इष्टतम कई घंटे के भीतर मछली को खिलाया जाना चाहिए । Artemia 12 घर के बाद सेने में खिला शुरू, पहली बार है कि वे पोषण समृद्ध हो सकता है का प्रतिनिधित्व; हालांकि, इस स्तर पर वे 5 dpf मछली के लिए बहुत बड़े हो गए है भस्म । इसकी तुलना में rotifers लगातार उच्च पोषक तत्व सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप समुद्री सूक्ष्म शैवाल पर फ़ीड की परवाह किए बिना जब rotifers काटा जाता है । Rotifers Artmeia nauplii (१६० बनाम ४०० माइक्रोन) की तुलना में बहुत छोटे हैं, उन्हें आसानी से मछली पकड़ने और निगलने के लिए बना । पोस्ट-लार्वा सतह मछली और cavefish समान मात्रा में rotifers का उपभोग करने के लिए वरीयता या rotifers10पर कब्जा करने की क्षमता में कोई अंतर नहीं का सुझाव ।

अंत में, Artemia nauplii शुरू होने के बाद कई घंटे ताजे पानी में मरने लगते हैं । खाया nauplii क्षय होगा, तेजी से पानी की गुणवत्ता कम अगर वे मैंयुअल रूप से नहीं हटा रहे हैं । मृत Artemia को हटाना समय लेने वाली और पोस्ट-लार्वा मछली है कि Artemia से ज्यादा बड़ा नहीं कर रहे है और गलती से हटा दिया या घायल हो सकता है के लिए खतरनाक है । Rotifers नर्सरी कंटेनरों में अनिश्चित काल तक रह सकते है और पानी की गुणवत्ता को काफी प्रभावित किए बिना हर समय मछली को भोजन प्रदान करते हैं ।

जबकि एक खाद्य स्रोत के रूप में rotifers का उपयोग काफी लाभ है, rotifer शेयर बनाए रखने के लिए, शैवाल संस्कृति प्रणाली के लिए दैनिक जोड़ा जाना चाहिए । यह एक स्वचालित फीडर है कि rotifer संस्कृति कंटेनर में तरल शैवाल तिरस्कृत ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ प्राप्त किया जा सकता है । Rotifers भी संस्कृति के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए हर 24-48 घंटे इस सेट से काटा जाना चाहिए । शोधकर्ताओं कि नस्ल मछली बहुत अक्सर (एक बार एक साल, उदाहरण के लिए) और के बाद में आबादी के बीच तुलना बनाने के साथ संबंध नहीं है लार्वा चरणों एक खाद्य स्रोत के रूप में Artemia पसंद कर सकते हैं, के बाद से encysted भ्रूण किसी भी समय रचा जा सकता है ।

हम हैच और जीवित लार्वा की संख्या पर नज़र रखने के लिए सेने और विकास की सफलता पर नजर रखने की सलाह देते हैं । अगर ज्यादातर भ्रूण या लार्वा मर जाते हैं, तो यह जीवाणु या फंगल प्रदूषित होने के कारण हो सकता है । यह मछली के पानी की गुणवत्ता के लिए तैयार पानी की निगरानी और ७०% इथेनॉल के साथ किसी भी उपकरण को निष्फल करने की सिफारिश की है । नर्सरी कंटेनरों फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद वे साफ कर रहे है और निष्फल । रोग के जोखिम को कम करने के लिए, यह भी नर्सरी कंटेनरों से किसी भी मृत मछली को हटाने और 5 dpf से पहले rotifers नहीं जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, जब मछली खाने के लिए शुरू ।

ए mexicanus लगभग एक वर्ष की उंर में यौन परिपक्व हैं । यह ढाणियो rerio (zebrafish) है कि 10-12 सप्ताह24में नस्ल कर रहे है की तुलना में ट्रांसजेनिक a. mexicanus पैदा करने के लिए एक सीमा है । Immunohistochemistry (आइएचसी) जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल हर कदम पर अनुकूलित किया जा सकता है और ब्याज की किसी भी ऊतक में एंटीजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि कुछ ऊतकों को और अधिक हो सकता है की सतह मछली रंजकता के कारण में कल्पना मुश्किल (एक बाधा है कि विवर्णीय cavefish में मौजूद नहीं है), जो तुलनात्मक अध्ययन की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं । इस संभावित समस्या का पता करने के लिए, सतह मछली वर्णक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग कर निर्धारण के बाद ब्लीच किया जा सकता है ।

आइएचसी सफल ऊतक निर्धारण, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी पैठ की आवश्यकता है । प्रत्येक के लिए तरीके ऊतक और ब्याज के प्रोटीन के आधार पर बदलती हैं । निर्धारण और निर्धारण समय प्रतिजन epitope बनाए रखते हुए सेल वास्तुकला की रक्षा करना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम क्रॉस-लिंक करने वाले निर्धारण (paraformaldehyde) का उपयोग करते है और denaturing निर्धारण (जैसे मेथनॉल या एसीटोन) को छोड़ देते हैं । हमने पाया है कि एसीटोन में मशीन न्यूरॉन और अग्नाशय मार्करों के लिए एंटीबॉडी संकेत कम. अवरुद्ध कदम ऊतक में गैर लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्यकारी से एंटीबॉडी को रोकने के लिए आवश्यक है । इस विधि का एक संयोजन का उपयोग करता है सामांय सीरम (5%) और BSA (०.२%) ब्लॉकिंग समाधान में । अवरुद्ध समाधान एंटीबॉडी और प्रोटीन है कि ऊतक में प्रोटीन पर प्रतिक्रियाशील साइटों के लिए बाध्य होते हैं, कम गैर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन ।

एंटीबॉडी प्रवेश प्राप्त करने के लिए, ऊतक permeabilized होना चाहिए । यह डिटर्जेंट या denaturing सॉल्वैंट्स के साथ प्राप्त किया जा सकता है लेकिन प्रतिजन epitope संरक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । हमारे प्रोटोकॉल ट्राइटन और dimethyl sulfoxide (DMSO) के संयोजन का उपयोग करता है । ट्राइटन और DMSO ०.५% और 1%, क्रमशः की सांद्रता पर अवरुद्ध और एंटीबॉडी गर्मी कदम के दौरान शामिल हैं । इस एकाग्रता का उपयोग करना, हम मस्तिष्क में दाग देखा है, अग्ंयाशय, आंत, और मांसपेशी, सुझाव है कि यह सभी ऊतकों के प्रवेश के लिए प्रभावी होने की संभावना है । मछली का आकार भी पैठ को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल है कि 14 दिनों से अधिक पुराने है मछली पर परीक्षण नहीं किया गया है (लगभग 7 मिमी लंबाई में) । धुंधला होने का निवारण करने के लिए, यह निर्धारण, अवरुद्ध, और एंटीबॉडी प्रवेश कदम को बदलने के लिए सिफारिश की है । यह भी महत्वपूर्ण है कि immunogen के mexicanus प्रोटीन के साथ के अनुक्रम संरक्षण की जांच करने के लिए उपलब्ध जीनोम25का उपयोग कर ब्याज की ।

ए mexicanus एक उत्कृष्ट एक ही प्रजाति है कि नाटकीय रूप से अलग वातावरण में विकसित किया है की आबादी के रूप में विकास की जांच मॉडल है सीधे प्रयोगशाला में तुलना में किया जा सकता है । मानक पशुपालन प्रोटोकॉल, दोनों के भीतर और प्रयोगशालाओं के बीच, सतह मछली और cavefish के बीच जैविक मतभेदों को समझने के लिए आवश्यक हैं । हमारे लेख के बाद लार्वा में विकास और जीन गतिविधि की जांच करने के लिए एक विधि प्रदान करता है लगातार विकास के मापदंडों को उजागर मछली ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [HD089934, DK108495] से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methylene blue Kordon B016CBHZUS antifungal
heater Finnex 4711457836017 100W Digital Control Heater
airstone Lee's Aquarium & Pet Products 10838125202 disposable air stone
salt Instant Ocean 51378014021 Sea Salt
nursery container IPC 21545-002 40 oz or 1.5 L clear containers
transfer pipette VWR 414004-002 plastic bulb pipettes
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers Reed Mariculture na fish food
RGcomplete APBreed 817656016572 32 oz bottle of rotifer food
Programmable Auto Dosing Pump DP-4 Jebao DP-4 automatic feeder for rotifers
Tricane-S Western Chemical MS 222 fish anesthetic
sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G for tricane solution
nylon mesh strainer HIC (Harold Import Co.) 735343476235 3-inch diameter
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixative
10X PBS Invitrogen AM9625 buffer, dilute to 1X using distilled water
Triton-x 100 Sigma-Aldrich T8787-250ML detergent
sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G anti-bacterial
bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-100G blocking reagent
glass vial with screw-top cap 4mL Wheaton 224742 staining vial
plastic mesh screen for breeding tank Pentair N1670 Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.
vinyl-coated disk magnets Kjmagnets D84PC-AST
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food New Life International na Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website
Antibodies
insulin antibody from guinea pig Dako A0564 1:200
glucagon antibody from sheep Abcam ab36215 1:200
acetylated tubulin antibody from mouse Sigma T6793 1:500
HuD/HuC antibody from mouse Life Technologies A-21271 1:500
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit Abcam ab106417 5μg/mL
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit Abcam ab178850 1:2000
seratonin (5HT) from rabbit Immunostar 20080 1:500

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References

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जेनेटिक्स अंक १४२ Astyanax mexicanus immunohistochemistry मछली पशुपालन cavefish जलीय कृषि पूरे माउंट immunostaining
पोस्ट-लार्वा Phenotypes और पूरे-माउंट Immunohistochemistry के विश्लेषण के लिए मैक्सिकन टेट्रा <em>Astyanax mexicanus</em> स्थापना
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Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (142), e58972, doi:10.3791/58972 (2018).

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