Summary
该协议描述了一种基于细胞分选的方法, 用于从产后小鼠或大鼠的新皮层和海马中纯化和培养荧光 gabaep 或谷氨酸神经元。
Abstract
该协议的总体目标是产生来自 Gabaep 或谷氨酸神经元的纯化神经元培养。纯化的神经元可以在体外的定义培养基中培养 16天, 并适合通常对离解培养物进行的任何分析, 包括电生理、形态学和存活分析。这些培养物的主要优点是, 在没有复杂外部影响的情况下, 例如由胶质细胞或其他神经元类型产生的影响, 可以有选择地研究特定的细胞类型。然而, 在规划纯化细胞的实验时, 需要注意的是, 神经元的生长和生存在很大程度上依赖于胶质调节的培养基。此外, 谷氨酸神经元进一步依赖于胶质分泌的因素来建立突触传递。因此, 我们也描述了一种方法, 共同培养神经元和胶质细胞在非接触安排。利用这些方法, 我们已经确定了 Gabaep 神经网络和谷氨酸神经元网络的发展之间的主要差异。因此, 研究纯化神经元的培养具有很大的潜力, 可以促进我们对神经系统如何发育和功能的理解。此外, 纯化培养物可能有助于研究药理剂、生长因子的直接作用, 或探讨遗传操作对特定细胞类型的影响。随着越来越多的转基因动物变得可用, 标记额外的特定细胞类型的兴趣, 我们预计这里描述的协议将增长在其适用性和潜力。
Introduction
细胞分选是一种有力的工具, 用于从异质细胞的混合物中分离出感兴趣的活细胞。细胞可以根据大小和形状标准以及荧光标记 1, 2 的表达进行排序。通常情况下, 氟共轭抗体被用来标记不同的细胞类型, 通过针对细胞特异性表面抗原3,4。或者, 转基因动物或病毒传递系统被设计出来, 以表达荧光在细胞特异性促进剂5,6。从历史上看, 转基因工具和动物的开发成本高昂且耗时。最近, 成本的降低和技术困难的减少导致了可用记者行的数量急剧增加。随着转基因工具和记者动物的不断增长, 荧光细胞分类方法的有用性和适用性也在不断增长。
我们最近证明, 转基因动物的细胞分选可以通常应用于纯化原代神经元, 为细胞培养做准备7。通过对大鼠或小鼠细胞进行分离, 我们能够分离和培养荧光神经元, 荧光神经元在 gabaep 或谷氨酸神经元6,8,9中表达荧光报告蛋白。通过研究这些纯化的神经元培养, 我们能够确定 Gabaep 和谷氨酸神经元依赖于胶质分泌因子建立突触传递的方式的一个重要区别 7.此外, 通过与纯化神经元共同培养胶质细胞, 我们能够扩展到先前的观察, 证明胶质细胞在神经元 10,11的生长和存活中的关键作用。因此, 通过细胞分类和细胞培养的结合, 我们不仅能够研究特定神经元类型的分离发展, 而且能够研究胶质细胞对其功能的影响。
我们在这里提出了一个纯化和培养 Gabaep 和谷氨酸神经元从皮层和海马的转基因小鼠或大鼠的方案。我们还提出了一种从 Geissler 等人的研究中改编的纯化神经元和胶质细胞的非接触共培养方法。为了产生纯化的 Gabaep 培养物, 我们对来自 VGAT-Venus-A Wistar 大鼠8或 vgat-v指 us 小鼠13的荧光神经元进行了分类, 这些神经元在 & & gt;95% 的皮质 Gabaep 活神经元。为了产生纯化的谷氨酸培养物, 我们对 NexCre 的荧光神经元进行了分类;Ai9只老鼠 6,9, 在皮质谷氨酸神经元中表达番茄。整个分选和培养过程可在3-4小时内进行, 可用于生成数百种适合于电生理、形态学和细胞存活分析的复制培养。该方法简便、重现性好, 可为感兴趣的细胞类型产生纯度大于97% 的纯化神经元培养物。
Protocol
所有程序和动物维护都是根据机构准则、《德国动物福利法》和欧洲理事会关于保护动物的第86/609/EEC 号指令进行的, 并得到了当地地方的许可。(Lgeso Berlin, T-021511)。
请注意:该协议描述了从单个转基因小鼠或大鼠幼崽纯化神经元的培养 (产后天 0–2)。所有技术都应在无菌条件下进行。所有溶液都应使用0.2μm 过滤器进行灭菌 (参见材料表)。玻璃盖板和解剖工具应在185°c 下进行3小时的热处理。
1. 多-l-赖氨酸镀膜玻璃盖板
- 通过除霜200μgml 多 l-赖氨酸 (PLL) 溶液进行5毫升的玻璃盖板制备玻璃盖板。加入45毫升的纯注入级水, 将该库存溶液稀释至20μg/ml。将溶液过滤后灭菌成一个新的50毫升锥形管。将此管标记为 "PLL 无菌"。
请注意:使用储存在室温下的水加快除霜过程。 - 在无菌 PLL 溶液中加入100个无菌、圆形、12毫米玻璃盖板。每5-10分钟搅拌一次管, 2-3分钟, 以确保均匀的涂层。用这种方式把被单涂上1小时。
请注意:德国制造的圆形玻璃盖板 (直径 = 12 毫米) 是首选, 因为它们提供了可靠的培养表面, 很容易地融入24井细胞培养板的井。 - 在锁相环涂层40分钟后, 取2张纸巾, 并将其平铺在流动柜中。用70% 乙醇对纸张进行消毒, 然后扁平去除折痕, 然后离开干燥。
- 用锁相环涂覆玻璃覆盖物1小时后, 去除多余的 PLL 溶液, 加入无菌注射等级的水。轻轻搅拌2-3 秒的盖板, 以去除多余的 PLL。重复此冲洗步骤2次。
- 去除多余的水, 然后将盖板转移到无菌纸巾上。使用弯曲的钳子小心地分离每个盖板, 然后离开干燥。
请注意:不容易分离的封面板可以丢弃。或者, 可以添加少量的水, 以帮助分离。 - 一旦干燥, 将盖板转移到24井培养板上。
请注意:在开始解剖过程之前, 应在大约 30 min–1小时内准备好盖板。板材可存放在37°c 和 5% co 2 的孵化器中, 直至需要.
2. 海马和皮质组织的分离
- 细胞培养溶液的制备
- 为了神经组织的离解第一次解冻40毫升的细胞培养缓冲液 (成分 [在 m]: 116 氯化钠, 5.4 Kcl, 26 Nahco 3, 1.3 Nah2po 4, 1 MgSO 4·7h2 o, 1 ccl 2·2h 2H, 0.5 edta ·2Na·2H2o和 25 d-葡萄糖, ph 值 = 7.4)。将细胞培养缓冲液的12毫升测量到15毫升的锥形管;标签为 "BSA"。将5毫升细胞培养缓冲液测量到不同的15毫升管;标签为 "木瓜蛋白酶"。在37°c 的水浴中将两个管培养15分钟。
- 过滤消毒剩余的细胞培养缓冲液, 标签为 "缓冲-无菌", 并存储在 4°c, 直到需要。
- 称量120毫克的牛血清白蛋白 (BSA), 并添加到标记为 "BSA" 的试管中。称量7毫克木瓜蛋白酶, 并添加到标记为 "木瓜蛋白酶" 的管。将两管送回水浴15分钟。
请注意:在称重船上添加少量缓冲液是有帮助的, 便于木瓜粉的转移。 - 一旦所有粉末溶解, 过滤消毒每个溶液到一个新鲜的15毫升锥形管。对于管木瓜, 将过滤后的溶液贴上 "木瓜-无菌" 的标签。对于 BSA 管, 将无菌 BSA 溶液分成3个管, 每个管包含4毫升的 BSA 溶液。将每个管标记为 "BSA-无菌" 和 "1"、"2" 或 "3"。将所有管道送回水浴中, 并在37°c 下继续孵育, 直到需要。
- 组织解剖的准备
- 取一张35毫米滤纸 (见材料表), 用70% 乙醇消毒;留在100毫米 Petri 培养皿的盖子里, 放在流动柜里晾干。
- 放置海马和皮层解剖所需的剪刀、钳子、手术刀和铲子 (见材料表)。
- 将两个35毫米 Petri 培养皿和一个含有无菌滤纸的100毫米 Petri 培养皿放在流动柜中央的无障碍位置。
- 收集转基因 NexCre;Ai9 和 VGAT 金星老鼠幼崽将被解剖。使用具有适当激发和发射过滤器的荧光灯 (见材料表) 来区分荧光灯幼崽与野生类型的垃圾。
- 在解剖动物之前, 用冷冻的无菌细胞培养缓冲液填充每个35毫米的 Petri 培养皿。
请注意:一个培养皿是用来清洗解剖之间的工具, 另一个是用来收集海马和皮层。
- 组织解剖
- 一旦细胞培养缓冲液倒入, 用大的、锋利的剪刀将产后一天0-2 转基因小鼠或大鼠小狗斩首, 并使用无菌的100毫米 Petri 培养皿将头部转移到流动柜中。使用钳子、剪刀和铲子小心地将转基因小狗的大脑转移到无菌滤纸上。
- 使用22型手术刀解剖小脑, 并分离2个半球。使用一个小铲子横向滚动半球。在每个半球上, 轻轻按下, 使皮层与滤纸接触。轻轻移动中脑区域, 以揭示海马体和皮层。
请注意:当压在半球或细胞可能会被压碎时, 要注意不要施加太多的压力。 - 使用手术刀或铲子将海马体和皮层从每个半球分开。将解剖组织转移到含有冷冻细胞培养缓冲液的35毫米 Petri 培养皿中。
请注意:如果解剖多个动物, 将无菌细胞培养缓冲液储存在冰上的50毫升锥形管中。每次解剖后, 将解剖组织转移到冷冻细胞培养缓冲液中。 - 成功解剖皮质-海马组织后, 将无菌木瓜蛋白酶溶液从水浴转移到流动柜。使用3毫升的巴斯德移液器将解剖的海马体和皮层转移到一个不育的35毫米 Petri 培养皿的盖子。用22型手术刀的扁平部分进行纵横交错的运动, 直到组织成小块。
- 使用少量的木瓜蛋白酶溶液将切碎的组织从培养皿的盖子转移到无菌木瓜蛋白酶管。将木瓜蛋白酶管送回水浴中, 在37°c 孵育组织25分钟。
- 在木瓜蛋白酶孵育过程中, 制作完整的荧光培养基溶液。除霜 B27 的1毫升, 格拉塔玛克斯的0.5 毫升, 平链的0.5 毫升。将低荧光介质的48.5 毫升倾斜到50毫升的锥形管。添加 B27, 谷氨酸和彭瑞到溶液中。把溶液摇匀, 然后过滤消毒, 并将其标记为 "Hibernate 一个完整的介质" (带有日期和首字母)。在37°c 的水浴中孵化。
- 木瓜蛋白酶孵育后, 将纸管和无菌 bsa 管转移到流动柜。使用1毫升的巴斯德移液器, 只去除皮质海马组织从木瓜蛋白酶管到 bsa 管1。
请注意:注意尽量减少过量木瓜蛋白酶溶液的转移。
- 细胞的分离
- 为了分解任何大型组织团块, 使用1毫升的巴斯德移液器对组织进行几次三尖血化。接下来, 使用一个细尖巴斯德移液器对组织进行7次三分法处理。让组织站立 30秒, 使较大的组织进入沉积物。
- 30秒后, 将溶液和组织的较低 1 mL 从 bsa 管1转移到 bsa 管2。使用细尖巴斯德移液器多次对 bsa 管2中的组织进行气管化。
- 经过三化, 再将较低的1毫升组织和溶液从 bsa 管1转移到 bsa 管3。使用细尖巴斯德移液器对 bsa 管中的组织进行了几次。
- 经过三化后, 将所有溶液和组织从2号和3号管转移到 bsa 管1中。再进行2-3 次的触控, 离心 3分钟, 3, 000 x克。
- 离心过程中, 制作完整的神经基部 a 媒体 (NBA 媒体)。将48.5 毫升的 NBA 培养基注射到50毫升的锥形管, 并在37°c 的水浴中孵育。标记此管 "仅限 NBA"。此外, 在室温下解冻 B27 的1毫升, 0.5 毫升的谷氨酸, 0.5 毫升的奔腾 Aliquot。
- 离心后, 小心地从颗粒组织中取出上清液, 并在2毫升的完整培养基中重新悬浮细胞。使用 P1000 移液器将组织上下三度旋转20次。
请注意:注意不要把细胞移液太用力。如果施加过多的压力, 细胞可能会损坏。 - 使用1毫升巴斯德移液器将细胞悬浮液通过30μm 的电池筛子过滤成聚苯乙烯样品管。
请注意:如果细胞悬浮液没有立即通过细胞筛子, 可能需要用无菌手套按压筛子的顶部, 以启动流动。这一重要步骤可防止细胞分拣器堵塞。 - 为收集神经元分类后, 准备收集管通过移液300μl 的完整介质到所需数量的聚丙烯管。
- 细胞悬浮液现在已经准备好被带到细胞分拣器进行排序。采取细胞悬浮液, 额外的收集管和备件完整的介质, 以防样品稀释是必需的。
3. 纯化的 Gabaep 或谷氨酸神经元的细胞分选
请注意:为了最大限度地减少分选过程中细菌污染的可能性, 请在分拣前用70% 乙醇冲洗分拣机的样品管至少5分钟。详细的分类参数因仪器而异, 基本考虑如下。
- 在第一次细胞分类过程中, 通过对野生类型动物的细胞进行分类和比较, 建立未标记细胞的背景荧光水平。
- 对于要排序的每个荧光电池类型, 选择适当的激发和发射过滤器。分别使用 488 nm 或 531 nm 激发波长激发金星和 TdTomato 蛋白。通过 530/和530/40 发射过滤器分别探测发射光。
- 在细胞分拣机中加入含有300μl 的完整介质的聚丙烯收集管, 以便进行细胞采集。
- 对于高纯度, 请对标记明亮的荧光细胞进行排序 (例如, 参见图 1 b中的点图)。
- 在分类之后, 为了获得最佳结果, 请对已分类的细胞进行纯度测试, 以估计纯度水平。请注意, 分选后单元格的典型恢复率在70–80% 之间。
- 记下每个收集管中排序的单元格数。此值由单元格排序工具给出。
请注意:可使用70μm 喷嘴 (70 psi 护套流体压力) 或100微米喷嘴 (20 psi 护套流体压力) 进行电池分选。
4. 培养排序神经元
- 在细胞分选后, 使用1毫升的巴斯德移液器, 将收集的细胞转移到2毫升圆形的底部离心管中。以 3, 000 x 克的速度离心细胞 3分钟, 形成细胞颗粒。
请注意:为了帮助确定细胞颗粒的位置, 将圆的底部离心管定位, 盖子的铰链朝外, 这使得细胞颗粒形成在离心管的背面 (即与铰链在管的同一侧)。 - 离心过程中, 在预热的 NBA 媒体的48.5 毫升中加入1毫升的 B27、0.5 mL 的谷氨酸和0.5 毫升的彭斯特普。摇匀溶液, 然后过滤消毒和标签为 "NBA 完整的媒体" (日期和首字母)。返回到水浴, 直到需要。
- 离心后, 使用1毫升巴斯德移液器将上清液转移到不同的离心管 (在细胞颗粒受到干扰的情况下保留上清液).重新悬浮细胞颗粒所需数量的预热完整的 NBA 培养基, 以达到 1, 000 细胞密度, 通过用 P200 或 P1000 移液器上下移液重新悬浮细胞。
- 要确认是否存在离解细胞, 请使用4倍或10倍的物镜在显微镜下检查细胞溶液。或者, 将少量的细胞溶液输送到盖板上, 并在显微镜下进行检查。如果存在大量细胞, 则可以丢弃步骤4.3 中的上清液。
- 在电镀细胞之前, 以 2–3 s 的中等速度产生涡流, 以确保细胞的均匀悬浮。涡流后, 快速将细胞悬浮液10Μl 移至每个盖板的中心。移液细胞后, 迅速将每个细胞返回孵化器 (5% CO 2/37°c)并孵育1小时。
请注意:如果将细胞添加到多个24孔板, 则通过板之间的涡流单元确保细胞密度均匀。 - 1小时后, 用500μl 预热完整的 NBA 培养基喂养细胞, 然后返回孵化器。
请注意:在喂养细胞时, 重要的是将介质轻轻移入井口一侧, 以避免细胞脱离。对于短时间的实验 (和 lt;16 天), 不需要在上述密度下进食。当电镀更高密度的细胞时, 可能需要更频繁的进料间隔 (请参阅讨论)。
5. 星形胶质细胞丰富的胶质支持培养
请注意:胶质培养物的产生 14和细胞培养插入物的使用已在前面描述了12。简而言之, 富星形胶质细胞培养物来源于皮质-海马组织 (切除脑膜;P2–P5), 在血清中培养了一个星期的 20μgml pll 涂层6孔板, 在血清中补充了 DMEM 培养基。
- 要共同培养纯化的神经元和胶质细胞, 将胶质细胞融合到所需数量的细胞培养插入物 (0.4μm 的孔径--见材料表)。要通过细胞, 从孵化器中取出含有融合胶质细胞的6孔板, 用2毫升预热 (37°c) 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗2口井, 2次。
- 吸收 PBS 溶液, 并使用 P1000 移液器添加1毫升预热 (37°C) 胰蛋白酶 (1:250)/EDTA (0.02/0.02%)每个井的解决方案。
- 将6孔板返回孵化器, 每2-3分钟检查一次细胞脱离。
- 一旦发生明显的细胞分离, 使用细尖巴斯德移液器轻轻上下移液细胞和细胞溶液, 以帮助进一步分离和分离单个细胞。
- 将细胞溶液以 3, 000 x g 的速度转移到15毫升的锥形管和离心机上, 时间为3分钟。
- 在预热 (37°c) Nba 完整介质的5毫升中使用 P1000 移液器重新悬挂细胞, 通过轻轻向上和向下移液, 直到细胞颗粒在溶液中。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器执行细胞计数。
请注意:经过7天的培养, 大约750000–100000细胞可以从一个6井板的每口井中收获。 - 将 40, 000 胶质细胞贴在每个细胞培养中插入500Μl 液滴 (80 细胞-Μl)。
- 在允许细胞坚持1小时后, 使用无菌钳将胶质覆盖的细胞培养插入到含有纯化神经元的24口板。从细胞培养刀片表面去除多余的介质 (约 300Μl)。
请注意:由于气泡通常会被困在细胞培养插入物下方, 因此可能需要轻轻倾斜插入物以去除这些气泡。如果在细胞培养插入中添加更多的胶质细胞, 可能需要进一步的清洗和离心步骤来去除多余的胰蛋白酶, 这可能会损害细胞的存活。
Representative Results
转基因小鼠或大鼠皮质-海马组织荧光神经元的离解和细胞分选可在约3-4小时内进行。其结果是大量高度纯荧光神经元, 可以在培养中生长16天。
为了产生纯化的培养物, 首先使用带有适当滤光片集的荧光灯来鉴定转基因动物 (例如荧光新生儿 VGAT Venis 和 NexCre;Ai9 小狗如图 1a所示)。在鉴定转基因动物后, 分离解剖组织, 对最强烈的荧光神经元进行分类, 以产生纯化的细胞群。NexCre 荧光强度点图示例;在流式细胞仪中获得的 ai9 和 VGAT 金星小鼠神经元如图 1 b所示。优化后, 可从单个 P0-2 NexCre 的皮层和海马中采集50万至 800, 000 细胞;Ai9 或 VGAT 金星老鼠。细胞的分类速度可以超过600个事件, 细胞纯度的估计是用 DAPI 作为核标记 (图 1c)。通过对强阳性细胞进行分类, 可以通常达到97% 以上的纯度.
经过成功的分选, 镀金神经元应出现圆形, 有一个光滑的膜, 并应看到发芽神经元约1小时的体外 (图 2a, b)。在体外 7天, 虽然一些细胞死亡可能是显而易见的, 但在所有培养条件下都应该存在活细胞 (图 2C, d)。在体外 12-16天, 使用全细胞膜片夹片记录和生物环素填充 15, 有可能研究纯化神经元的形态和电生理发育 (图 3)。对纯化培养物的分析表明, 谷氨酸和 Gabaeép 神经元都能够从其细胞体中扩展轴突和树突 (图 3 a, b), 并保留产生动作电位的能力。超置化去极化电流注入 (图 3C, d)。然而, 值得注意的是, 在纯化之后, 只有 Gaba中西神经元接受了大量的自发突触传递, 谷氨酸神经元在没有胶质细胞的情况下接受的突触传递很少 (图 3E), F)7。
正如我们之前所报告的, 纯化培养物中的细胞往往比未分类培养物中的细胞存活得更差, 树突和轴突明显较小。为了克服这些缺陷, 我们采用了适应和应用的方法, 以支持与胶质细胞12,14的纯化培养物的发展。我们的胶质支撑培养物 (DIV7) 的细胞组成如图 4 a所示。这些培养物主要含有胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 阳性星形胶质细胞, 但也含有一些分化分子簇 (CD11b) 阳性微胶质细胞和髓鞘碱性蛋白 (MBP) 阳性少突胶质细胞。在 DIV 7 之后, 这些细胞可以被传递到细胞培养插入物, 以提供纯化神经元的非接触支持 (图 4b, c)。对胶质细胞共培养的分析表明, 约 40, 000个胶质细胞足以提高纯化谷氨酸和 Gabaegacy 神经元 (图 4D, e)7的长期生存和生长。此外, 电生理分析显示, 谷氨酸神经元与胶质细胞共同培养, 活性高, 网络活性增强 (胶质支持的谷氨酸神经元爆发的作用潜力: 62%;n = 28;图 4 f, G)。因此, 胶质支持不仅对促进神经元的生长和生存很重要, 而且对促进谷胱甘肽培养中的突触传递和网络活动的建立也很重要。
图 1: 谷氨酸和 Gabaeic 神经元的纯化.(A) 显示在 NexCre 中 TdTomato 转基因表达的荧光信号的图像;Ai9只老鼠 (上) 和金星在 VGAT 金星小鼠 (底部)。刻度条 = 5 毫米 (b) TdTomato 的强度散点图和核心海马离解细胞的金星荧光;Ai9只老鼠 (上) 和 VGAT 金星小鼠 (底部)。强荧光 TdTomato 或金星神经元被选择进行分类 (由门控盒指示)。(C, 左)分类 TdTomato (上图) 和金星 (底部) 阳性神经元的共聚焦图像。(C, 右)合并图像显示与 DAPI (蓝色伪彩色) 共染色的细胞。TdTomato 荧光是内源性的, 尽管固定 (品红色伪彩色) 仍保持强壮。金星表达是加强使用针对 GFP 和亚历克莎氟-888 共轭二级抗体 (绿色伪彩色) 的主要抗体的组合。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 纯化谷氨酸或 Gabaep 神经元的细胞培养.(A) 来自 TdTomato (左) 和 venus (右) 阳性神经元的红外 (明亮场) 联合图像和叠加荧光信号在体外培养1小时。白色箭头表示生长中的神经元的位置。(B) tdtomato (左) 和 venus (右) 阳性神经元体外培养1小时的共聚焦图像。(C, D)明亮的场 (顶部) 和结合明亮的领域和荧光图像 (底部) 的 TdTomato (c) 和金星阳性神经元 (D) 体外培养 7天 (DIV)。白色箭头显示死细胞中凝聚态细胞核的位置。彩色箭头识别荧光标记的神经元。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 纯化神经元的形态、电生理和突触特性.(A、B)分别在 DIV 13 和 DIV 14 上的 TdTomato (A) 和金星阳性神经元 (B) 的共聚焦图像。细胞以黑色显示使用倒置查找表, 以帮助神经元可视化。插入显示由识别的神经元所表达的荧光信号。(C, D)从 TdTomato (C) 和金星阳性神经元 (D) 到超极化 (200 至-20 pa, 在 20个 pA 步骤) 和去极化 (200 pA) 电流脉冲的电压响应, 通过全细胞膜片钳记录获得。插入显示相应的记录神经元。每个细胞的静止膜电位显示在记录痕迹的左侧。(英、法)代表性电压夹 (10秒) 从 TdTomato (E) 和金星阳性神经元 (F) 获得。自发性兴奋性突触后事件 (Epsc) 记录在 TdTomato 阳性神经元, 保持在 50 mV 的保持潜力。从金星阳性神经元中记录了自发发生的抑制突触后事件 (Ipsc), 其保持潜力为 0 mV。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 支持神经元发育与胶质共培养.(A) 神经胶质培养免疫标记的胶质纤维酸性蛋白 (gfap, 左), 分化分子簇 (cd11b, 中部) 和髓鞘碱性蛋白 (mbp, 右) 的共聚焦图像。为 DIV 7 培养胶质细胞。(B) 细胞培养图像插入用于在非接触安排中与纯化的神经元共培养胶质细胞。(C) 用于共培养神经元和胶质细胞的空间排列示意图。(D, E)TdTomato (D) 和金星阳性神经元 (E) 的共聚焦图像, 生长 14天, 在没有 (左) 或存在 (右) 的胶质支持。(F, G)在无 (上) 或存在 (底部) 胶质支撑的情况下, 来自 TdTomato (f) 和金星阳性神经元 (G) 的电流夹片记录 (60秒) 培养了14天。神经元在其静止膜电位处被记录 (呈现在每个记录痕迹的左侧)。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
我们在这里描述了一个方法, 结合分选和培养的初级神经元, 以产生纯化的神经元细胞培养。这种方法需要大约1小时比一个典型的主要离解神经元培养协议约 1小时, 但允许产生数百复制培养包含特定的神经元类型。纯化的神经元, 可以在隔离中生长至少 16天, 延伸轴突和树突, 并可以激发重复的动作电位训练 (图 2和图 3)。重要的是, 这些细胞可以接受与常规原代离解神经元培养相同的实验分析, 包括电生理、形态学和生存分析。使用这些纯化培养物的一个主要好处是, 可以孤立地研究特定细胞类型的发展。为了支持纯化培养物的发展, 我们还提出了一个方案, 共同培养纯化的神经元与胶质细胞。如前所示, 与胶质细胞共培养纯化的神经元可提高其存活率和生长性,并可促进网络形成 7 (图 4)。因此, 我们在这里提出了一个方法的组合, 应该进一步研究胶质神经元的相互作用, 并可能证明有助于研究发展和互动之间的其他细胞类型的兴趣。
对纯化谷氨酸神经元培养物的研究揭示了对胶质细胞分泌促进神经元网络发育和突触形成的方式的基本见解, 16、17、18.一般来说, 纯化特异性神经元类型的方法已更成功地应用于研究谷氨酸神经元的发展, 而不是 Gabaep 神经元。这导致了我们对这两种细胞类型如何发展的理解存在差异。鉴于 Gabaep 和谷氨酸神经元在解剖学、生理和发育来源方面存在显著差异, 因此, 我们必须研究 Gabaep 神经元本身, 以更好地了解其功能和生理。使用这里介绍的协议, 我们已经确定了重要的差异, 在如何 Gabae自身和谷氨酸神经元依赖于胶质分泌的因素建立突触传输7。通过发布这一协议, 我们希望其他人能够进一步深入了解神经元和胶质细胞之间的重要相互作用。
在这个协议中, 我们描述了一种流式细胞仪的细胞分选方法, 我们已经用来净化不同转基因啮齿类动物系的 Gabaep 或谷氨酸神经元。从 VGAT 金星小鼠13或大鼠8中对金星阳性 gabaep 神经元进行了分类, 从 NexCre 对 TdTomato 阳性谷氨酸神经元进行了分类;Ai9 老鼠 (最初来自 NexCre9和 ai9 记者队伍6, 见 turko 等人, 2018年7)。近年来, 由于技术的进步, 转基因动物的生成变得容易得多。因此, 在许多不同的细胞类型中, 表达荧光分子的动物的可用性迅速增长。这反过来又增加了荧光活化细胞分选的使用和适用性。虽然目前存在着分离感兴趣的细胞的替代方法 16、19、20, 但由于依赖自然产生的表面有合适的抗体, 这些细胞在一定程度上受到阻碍抗原。这限制了他们的多功能性相比, 基于荧光的细胞分选方法, 这已经可以用来排序细胞从许多细胞特定的转基因记者动物已经可用。然而, 当优化, 基于抗体的分选方法可以是快速和高产, 甚至可以更好地保存细胞解剖, 通过允许纯化细胞与他们的轴突和树突完整21。因此, 在决定排序策略时, 仍应考虑抗体排序方法。最终, 感兴趣的细胞类型、细胞分类的年龄、转基因动物或表面抗原的可用性以及所需细胞的数量将是选择最适合排序策略的决定因素。
虽然基于荧光的细胞分选是一种简单和可重复的方法来净化细胞, 但在协议的某些步骤中, 应注意保持细胞质量。例如, 在每个离心步骤之后, 重要的是要确保细胞颗粒尽快重新悬浮, 细胞已经成功回收。有时, 当去除上清液时, 细胞颗粒可能会受到干扰。因此, 建议在离心步骤之间检查显微镜下是否存在细胞, 以排除任何广泛的细胞损失。细胞电镀后, 细胞在喂养前应允许粘附至少1小时。如果细胞过早被喂养, 一些细胞可能会从覆盖液中脱落, 从而降低培养密度。培养1小时后, 评估细胞健康是谨慎的。如果细胞看起来不健康 (图2a 显示了健康细胞的示例), 或者存在明显的细胞死亡, 则这可能表明在分离或排序过程中出现了问题。在培养任何细胞类型时, 另一个重要的考虑因素是在管理细胞培养介质时要小心。NBA 培养基含有苯酚红, 它起到 pH 值22的作用。如果介质的颜色变得太黄, 则表示 pH 值太酸; 如果介质的颜色太黄, 则表示 pH 值太酸性; 如果介质的颜色太黄, 则表示 ph 值太酸性。如果介质变得太粉红色, 则表示溶液过于碱性。库存解决方案长期开放, 特别是介质外降到锥形管中, 往往会随着时间的推移变得更加碱性。因此, 建议每周制作新的完整的 NBA 媒体, 每两周制作完整的媒体 (大气条件下的介质缓冲器, 因此应更加稳定)。考虑到这些问题, 应该有可能在任何实验室建立纯化的细胞培养物, 并能获得细胞分选和细胞培养设备。
在我们的大多数实验中, 我们从一种动物身上产生了纯化的培养物。然而, 当净化细胞进行生化分析时, 可能需要将多个动物集中起来进行分类。我们已经成功地整理了多达8只胚胎小鼠 (胚胎日13只动物) 使用上述协议 (数据未显示)。但是, 如果要对更多的动物进行分类, 可能需要增加木瓜蛋白酶和 BSA 溶液的体积 (在步骤2.1.1 中描述– 2.1.4), 以适应组织量的增加。此外, 如果在培养中镀金更多的细胞, 则可能需要更频繁的喂养计划。作为起点, 细胞可以通过去除100μl 的条件介质和添加200μl 的新鲜完整的 NBA 介质, 每7天喂养一次细胞。为了神经元的活力, 如果对更多的动物进行分类, 就应该考虑尽量减少排序时间。这通常需要仔细优化下游分析, 以便有效地使用纯化的细胞。我们经常对老鼠神经元进行排序, 每只动物最多600例, 高达 5000-800, 000个细胞 (产后天下 0-2)。然而, 这并不是对排序速度和条件进行详尽的优化。因此, 应该有可能进一步改进分类速度和产量。
纯化的神经元需要有胶质条件的培养基来生存。这已经证明之前通过培养神经元和胶质细胞分开, 然后用胶质调节介质治疗神经元 10。在我们的实验中, 我们选择通过在半透性细胞培养插入物上培养胶质细胞来支持纯化的神经元, 这些细胞被放置在细胞培养板内。该方法已成功地应用于胶质细胞外基质蛋白及其与神经元12的相互作用。与细胞的单独培养相比, 这种方法提供的非接触式但持续的支持有很多优点。最值得注意的是, 胶质细胞与神经元的共培养允许细胞培养介质的持续调节和调节, 这更类似于体内的情况。此外, 细胞的连续共培养允许神经元和胶质细胞之间的潜在反馈信号, 这在分离的培养中是不可能的。在我们的协议中, 如果需要, 可以很容易地省略连续共培养方法, 并可以使用胶质调节介质对神经元进行经典治疗。
总之, 这里介绍的协议旨在为读者提供一个坚实的基础, 使他们能够建立自己的纯化细胞培养实验。我们预测, 在可预见的未来, 转基因动物和病毒结构的供应将继续增加。因此, 基于荧光的细胞分选技术可能会得到更广泛的应用和价值。
Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢 Jenny Kirsch 和 Ana Teichmüller 在柏林德意志 Rysema-forschungszentrum 的流式细胞术核心设施提供的出色技术支持。我们要感谢宋杰在生存分析方面的帮助。我们还要感谢丽塔·卢雷罗帮助捕捉荧光老鼠的图像, 并感谢克里斯蒂安·埃布纳对协议进行了批判解读。Vgat-vavus 转基因大鼠是由日本冈崎国立生理科学研究所 y. Yanagawa、M. hirabayashi 博士和 Y. Kawaguchi 博士使用宫崎博士提供的 pCS2----金星生成的。这项工作得到了德国研究理事会 (德国研究理事会、DFG EXC 257 至 IV) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
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