Neuroscience
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荧光活化细胞分选建立纯化的 Gabaep 或谷胱甘肽神经元的原代细胞培养
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Summary June 6th, 2019
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该协议描述了一种基于细胞分选的方法, 用于从产后小鼠或大鼠的新皮层和海马中纯化和培养荧光 gabaep 或谷氨酸神经元。
Transcript
该协议描述了一种简单且可重复的方法，用于净化和培养特定类型的原神经元。这些培养物适用于电生理学、形态学和生存分析。纯化神经元的培养可用于研究神经元生理学的基本原理、突触的形成以及神经元网络如何发展。
虽然我们专注于皮质谷胱甘肽主细胞和GABAergic内腺，这个程序可以很容易地修改，以研究任何神经元线表达荧光蛋白。要准备玻璃盖玻片，首先解冻每毫升PLL溶液200微克的5毫升等分。通过添加 45 毫升纯注射级水，将这种库存溶液稀释至每毫升 20 微克。
然后过滤将溶液消毒成新的50毫升锥形管，并贴上PLL无菌标签。接下来，在无菌 PLL 溶液中放置 100 个无菌圆形 12 毫米玻璃盖玻片。每 5 到 10 分钟搅拌一次管，两到三分钟，以确保涂层均匀。
经过40分钟的PLL涂层，拿两片纸巾，平放在流程柜中。使用 70% 乙醇对纸张进行消毒，然后将其压平，以去除折痕并晾干。用 PLL 将玻璃盖玻片涂覆一小时后，去除多余的 PLL 溶液并加入无菌注射级水。
轻轻搅拌盖玻片两到三秒钟，以去除多余的 PLL。再重复两次此冲洗步骤。去除多余的水，然后将盖玻片转移到无菌纸巾上。
干燥后，将盖玻片转移到 24 井培养板。要准备细胞培养解决方案，测量出12毫升的细胞培养缓冲液到15毫升锥形管，并标注为BSA。测量出5毫升的细胞培养缓冲液到不同的15毫升管和标签作为木瓜。
随后，在37摄氏度下孵育两根管子15分钟。将 120 毫克 BSA 添加到标有 BSA 的管中。然后反转管子，帮助溶解溶液。
然后加入七毫克的木瓜到标有木瓜的管子里。将两根管子返回水浴 15 分钟。过滤器将 BSA 溶液消毒成新鲜的锥形管。
将无菌 BSA 溶液分成三管，将每个管标记为 BSA 无菌和一、二或三管。现在过滤灭菌的木瓜管和标签管作为木瓜无菌。将所有管子放回水浴，并在37摄氏度下继续孵育，直到使用。
要准备组织解剖，请布置解剖海马和皮层所需的手术刀、剪刀、钳子和铲子。将两个 35 毫米培养皿和一个 100 毫米培养皿放在流程柜中，内含无菌滤纸。收集转基因 NexCre;Ai9 或车辆 GABA 运输器维纳斯小鼠幼崽，使用荧光灯与适当的激发和发射过滤器进行解剖，以区分荧光幼崽与野生型升配合。
在解剖动物之前，请立即用冷冻无菌细胞培养缓冲液填充每个培养皿。解剖后，小心地将转基因幼崽的大脑转移到无菌滤纸中。首先，解剖小脑，分离两个半球。
然后小心地将海马和皮层从每个半球分离。将解剖组织转移到含有冷冻细胞培养缓冲液的35毫米培养皿中。然后将解剖的海马和皮层转移到另一个35毫米培养皿的盖子上。
使用手术刀刀片的扁平边缘，小心地在纵横交错的动作中切割组织，直到只剩下小块。接下来，用少量的木瓜溶液将切碎的组织从培养皿盖转移到无菌的木瓜管中。在37摄氏度下孵育组织25分钟。
木瓜孵育后，将无菌木瓜管和无菌BSA管转移到流柜。然后使用一毫升巴斯德移液器将仅皮质果状细胞组织从木瓜管转移到 BSA 管中。为了分解任何大团组织，使用一毫升巴斯德移液器将组织三分几段。
之后，使用细尖巴斯德移液器对组织进行三角化七次。30秒后，将一毫升的下部溶液和组织从BSA管一转移到BSA管二。使用细尖巴斯特移液器将 BSA 管中的组织三次三化两次。
三角化后，将一毫升的下部组织和溶液从BSA管一转移到BSA管三。在BSA管中三次三次缝合组织。三角化后，将二管和三管的所有溶液和组织转移到BSA管一中。
三次三次，以3000次g离心，三分钟。离心后，小心地从颗粒组织中去除上流液，并使用 P1000 移液器在两毫升完全冬眠的低荧光介质中重新挂起细胞。然后三化组织20次，以确保组织溶液的完全再吸收。
随后，将细胞悬浮液通过30微米细胞筛入聚苯乙烯样品管。通过将 300 微升完全休眠的 300 微升介质移液到所需数量的聚丙烯管来准备细胞分拣收集管。对于要排序的每个荧光细胞类型，选择适当的激发和发射过滤器。
使用 488 纳米激发波长激发金星蛋白，并通过 530/40 发射滤波器组检测发射光。使用 531 纳米激励波长激发 TdTomato 蛋白，并通过 575/30 发射滤波器组检测发射光。对于高纯度，对标记明亮的荧光细胞进行排序。
在细胞分选后，将收集的细胞转移到两毫升圆形底部离心管。然后将3000次g的细胞离心3分钟，形成细胞颗粒。将细胞颗粒重新以所需的预加热完整 NBA 介质进行，以实现每微升 1，000 个细胞的细胞密度。
要确认是否存在分离细胞，请在显微镜下使用 4X 或 10 倍的客观透镜检查细胞溶液。在电镀细胞之前，以中等速度涡流两到三秒钟，以确保细胞均匀悬浮。在涡旋后，快速移液器10微升的细胞悬浮到每个盖玻片的中心。
一小时后，用500微升预加热完整的NBA介质给细胞喂食，并在37摄氏度时返回孵化器。为了共同培养纯化的神经元和胶质细胞，将胶质细胞传递到所需数量的细胞培养插入物。这是通过电镀4万个胶质细胞在500微升滴完整的NBA介质。
一小时后，将胶质细胞培养物转移到纯化神经元。从培养物刀片中取出多余的介质，并将板返回培养箱进行培养。成功排序后，镀层神经元应以光滑的膜出现圆形，在大约一小时的体外后应看到可消除神经性。
到体外七天，虽然一些细胞死亡可能是明显的，可行的细胞应该存在于所有培养条件。对纯化培养物的分析表明，谷氨酸和GABAergic神经元都能够从细胞体中延伸轴突和树突，并保留产生作用潜力的能力，以应对超阈值去极化电流注射。值得注意的是，在纯化之后，只有GABAergic神经元接受大量的自发突触传输，而谷胱甘肽神经元在没有胶质细胞的情况下接受很少的突触传输。
重要的是，用胶质细胞培养纯化神经元可改善神经元的生长和生存，并促进谷胱甘肽培养物中的突触传播。盖玻片的充分偏振涂层和在整个过程中保持培养基的生理 pH 值是确保优质细胞培养的关键。按照此协议，应该可以对纯化培养物进行RNA测序和蛋白质质谱，从而在特定的神经元类型中研究转化和转录过程。
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