Høy gjennomstrømming og omfattende narkotika overvåkning bruker Multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese massespektrometri

Nåværende strategier for en urin narkotika screening er dyrt å utføre for rutinemessig analyse av stadig større paneler av narkotika misbruk som kreves for arbeid sted testing, samt terapeutiske narkotika overvåking applikasjoner. I tillegg er metoder basert på aminoanalyser utsatt for bias og er til slutt begrenset til målanalyse av kjente legemiddelpaneler. Den største fordelen med vår metode, som kalles MSI-CE-MS, er at det gjør det mulig for rask screening av et ubegrenset legemiddelpanel og deres metabolitter med høy nøyaktighet og minimal prøvearbeid.

Det er et presserende behov for en høy gjennomstrømning og rimelig screeningmetode for å forbedre pasientutfallet ved å bekrefte overholdelse og optimalisere narkotikadoseringsregimer, samtidig som det avslører ulovlig narkotikabruk. Denne multipleksede separasjonsplattformen kan brukes på en rekke andre forskningsområder knyttet til målrettet eller ikke-målrettet metabolittprofilering i komplekse biologiske prøver. Begynn med tining avidentifisert morgen urinprøver samlet inn fra pasienter med en kjent reseptbelagte stoffet historie for minus 80 grader Celsius lagring på is og vortexing de tinte prøvene i 30 sekunder.

Deretter sediment prøvene ved sentrifugering og kombinere tre 10 mikroliter aliquots av hver prøve med 10 mikroliter av deuterated interne standarder, fem mikroliter av en 4-fluor-L-fenylalanine og 3-klor-L-tyrosin løsning og 25 mikroliter av deionisert vann. Sentrifuger deretter blandingene i ett minutt og overfør 20 mikroliter av hver prøve til individuelle polypropylen hetteglass. For å stille inn de ubestrøkede, smeltede silikakapillærkondisjoneringsparametrene, kutt en 135 centimeter lang, 50 mikrometer indre diameter og 360 mikrometer ytre diameter kapillær fra en spole.

Bruk en kapillær vindusmaker til å fjerne ca 7 millimeter polyamidbelegg fra begge ender av hver kapillær. Deretter installerer kapillærinntakene i kapillærelektroforesen, eller CE-patronen, ved å loope hver kapillær i to 360 graders svinger, og vær forsiktig med å stikke ut omtrent to millimeter av kapillæruttakene ut av CE-sprøytenål. Når alle kapillærene er installert, må du forsiktig laste CE-kassetten inn i CE-systemet og oppbevar CE-sprøyten ut av i ionkilden.

Plasser flytende kromatografi, eller LC-sprøyter, i iionkilden og velg flush i systemets programvare for å sette opp kapillærkondisjoneringen. Still inn varigheten av metanol, en molarnatriumhydroksid, deionisert vann og bakgrunnselektrolytt i flukt til 30 minutter per flush og plasser isokratisk pumpe i standby i kapillærkondisjoneringsperioden. Etter siste flush, rengjør kapillær elektroforese massespektrometer, eller CE-MS sprøyter, og CE elektrode med metanol gjennomvåt kluter.

Rengjør CE-MS-grensesnittet med en en til en isopropanolvannsløsning for å fjerne eventuelle gjenværende saltavleiringer. Bytt ut LC-sprøyten med den rengjorte CE-MS-sprøyten og et nylig balsamert kapillær i det koaksiale hylsevæskegrensesnittet. Slå deretter på isokratisk pumpe og bruk en spenning på 30 kilovolt i 15 minutter for å sikre at en stabil CE-strømprofil oppnås før urinanalysen.

I systemprogramvaren velger du forutsetninger, angir flushen til 600 sekunder og angir en bakgrunnselektrolyttfilposisjon. Sett injeksjonen til hydrodynamisk injisere prøvene på 100 millibar i fem sekunder og å elektrokinetisk injisere bakgrunnen elektrolytt avstandsstang på 30 kilovolts i 75 sekunder. Still inn den påførte spenningen til 30 kilovolt, patrontemperaturen til 25 grader Celsius, og den totale kjøretiden til 40 minutter.

Deretter, ved hjelp av timeplanen, bruke en trykkgradient på to millibar per minutt fra null til 40 minutter under separasjonen. Når prøveoppkjøpet er fullført, skyll kapillæren ved 50 millibar trykk med bakgrunnselektrolytter over natten mens kapillæren er i CE-sprøyten i iionkilden. Angi at TOF-MS-positiviondeteksjon skal dekke et masse-til-lade-forhold på 50 til 1 700, med en datainnhentingshastighet på 500 millisekunder per spektrum, og bekreft at både profilen og centroid-dataene er lagret i D-filformat.

Sett elektrosprayioniseringsforholdene til kapillær og til dysespenninger på 2000 volt hver, forstøvergassen til 10 pounds per kvadrattomme, og tørking gassleveringen til åtte liter per minutt ved 300 grader Celsius med en kappegassstrøm på 3,5 liter per minutt ved 195 grader Celsius under oppkjøpet. Sett deretter MS-spenningsinnstillingene til fragmenteren, skimmeren og oktastangen én radiofrekvens til henholdsvis 120, 65 og 750 volt, og sett instrumentkontroll- og datainnsamlingsparametrene i henhold til utformingen av eksperimentet. Åpne CE-MS-dataene med flere segmenter i systemprogramvaren for dataanalyse.

Under kromatogrammer angir du ekstraksjonsdataene og kromatrammet og massespektraldataformatene til profilmodus. Under utjevning velger du kvadratisk kubikk Savitzky-Golay og setter funksjonsbredden til 15 poeng. Klikk deretter Integrer MS og sett integratoren til smidig.

Under toppfiltre setter du maksimalt antall topper til 11. Klikk på topplisten for integrering under visning, og velg toppnummer, oppbevaringstid, toppområde, topphøyde og signal-til-støy-forhold. Lagre deretter parameterne under et unikt metodenavn og bruk metoden på prosessen for tolkning av hvert datasett.

I denne representative analysen av ulike isobariske inoeiske legemidler av misbruk og deres metabolitter, ble 30 løste topper fra 10 uavhengige prøver av en legemiddelblanding oppdaget uten prøveoverføring. To andre isobariske opioider kan løses fullt ut som 20 forskjellige topper med full skanning datainnsamling. Tilsvarende ble to amfetaminposisjonelle isomer fullstendig løst i denne multi-segment CE-MS-analysen, for å skille ulovlig metamfetaminmisbruk fra potensiell misbruk av phentermine, et foreskrevet sentralstimulerende middel som brukes som en appetitt suppressant for vekttap.

I denne representative analysen av legemiddelscreening ble et positivt screeningtestresultat for metadon utledet ved påvisning av en stor signaltopp som gikk sammen med metadon-d3-toppen med lav massefeil. Ingen andre signaler ble påvist i andre urinprøver i samme løp, og den påviste metadonkonsentrasjonen oversteg 13 ganger den anbefalte cutoff-grensen sammenlignet med det målte ionresponsforholdet i prøven og korrigert av en fire ganger urinfortynningsfaktor, som bekrefter at pasientene overholder metadonvedlikeholdsbehandling. Her ble en seriell injeksjonskonfigurasjon i multisegment CE-MS, bestående av fem forskjellige legemiddelkalibranter, analysert i duplikat i løpet av ett enkelt løp sammen med den syntetiske urinen tom.

Stoffet metabolitter ble oppdaget som deres potenated molekylære ioner over deres screening cutoff grenser. Etter denne prosedyren kan et stort antall polare og ioniske metabolitter i urin også analyseres av MSI CMS til støtte for oppdagelsesbasert metabolsk forskning. I tillegg kan omfattende overvåking av et bredt spekter av eksogene stoffer og deres metabolitter oppnås, inkludert ikke-foreskrevne medisiner og ulovlige stoffer utsatt for misbruk.

Denne optimaliserte metoden kan også brukes til rutinemessig å screene andre stoffer av misbruk. Dette kan være cannabis eller alkohol metabolitter og vår metode kan også skille mellom en syntetisk eller en falsk urin matrise og en naturlig, ekte, autentisk donert urinprøve også. Husk å alltid være forsiktig når du arbeider med biologiske væsker.