Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Detaljert protokoller for både in vitro og i celle selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer forlengelsen (SHAPE) eksperimenter for å finne den sekundære strukturen i pre-mRNA sekvenser av interesse i nærvær av et RNA målretting små molekyl er presentert i denne artikkelen.

Abstract

Under stoffet utviklingen av RNA målretting små molekyler, er Klargjørende strukturelle endringer på deres samhandling med målet RNA sekvenser ønsket. Vi gi her et detaljert i vitro og i celle selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer (SHAPE) protokollen for å studere RNA strukturelle endringen i nærvær av en eksperimentell narkotikabruk for spinal muskel atrofi (SMA), overlevelse av motoriske nervecellen (SMN)-C2, og i ekson 7 av pre-mRNA av SMN2 genet. I vitro form, er en RNA sekvens av 140 nukleotider inneholder SMN2 ekson 7 transkribert av T7 RNA polymerase, foldet i nærvær av SMN-C2 og senere endret av en mild 2-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Denne 2-OH-NAI adduct er videre undersøkt av en 32P-merket primer utvidelse og løses av polyakrylamid gel geleelektroforese (side). Omvendt, 2-OH acylation i i celle form foregår i situ med SMN-C2 bundet mobilnettet RNA i levende celler. Pre-mRNA sekvensen av ekson 7 i SMN2 genet, sammen med form-indusert mutasjoner i primer forlengelsen, ble deretter forsterkes av PCR med neste generasjons sekvensering. Sammenligne de to metodikkene, i vitro FIGUREN er en mer kostnadseffektiv metode og krever ikke kraften til å visualisere resultatene. Men avviker i vitro figur-avledet RNA modellen noen ganger fra den sekundære strukturen i en mobilnettet sammenheng, sannsynligvis på grunn av alle interaksjoner med RNA-bindende proteiner. I celle FIGUREN trenger ikke en radioaktivt materiale arbeidsplass og gir en mer nøyaktig RNA sekundære struktur i mobilnettet sammenheng. Videre i celle FIGUREN er vanligvis tilgjengelig for et større utvalg av RNA sekvenser (~ 1000 nukleotider) ved å benytte neste generasjons sekvensering, sammenlignet med i vitro form (~ 200 nukleotider) som vanligvis er avhengig av side analyse. I tilfelle av ekson 7 i SMN2 pre-mRNA, in vitro og i celle FIGUREN avledet er RNA modeller lik hverandre.

Introduction

Selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer (SHAPE) er en metode for å måle the kinetics av hver nucleotide i en RNA sekvens av interesse og Klargjørende sekundære strukturen på enkelt-nukleotid løsning1. FIGUR metoder, begge i i vitro forhold2,3,4 (renset RNA i et definert buffer system) og i levende pattedyrceller5,6, er utviklet for å undersøke sekundære strukturen til middels lengde RNA sekvenser (vanligvis < 1000 nukleotider for i celle figur og < 200 nukleotider for i vitro figur). Det er spesielt nyttig å evaluere strukturelle endringer i reseptor RNA ved binding til RNA-samspill små molekyl metabolitter2,4,7,8 og studere mekanistisk handlinger målretting RNA molekyler i narkotika utvikling9,10.

RNA målretting stoffet funnet har nylig trukket oppmerksomheten i akademiske laboratorier og farmasøytisk industri11,12 via ulike tilnærminger og strategier13,14,15 ,16. Siste eksempler RNA målretting små molekyler for klinisk bruk på to strukturelt distinkte eksperimentelle narkotika, LMI-07017 og RG-791618,19, for spinal muskel atrofi (SMA), som viste lovende resultater i fase II kliniske studier20. Begge molekyler ble demonstrert for målet overlevelse av motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA og regulere skjøting prosessen SMN2 genet6,17,21. Vi viste tidligere anvendelse av i vitro og i celle figur i en undersøkelse av målet RNA strukturelle endringer i nærvær av en analog av RG-7916 kjent som SMN-C26.

I prinsippet måler figur 2-OH acylation hver nucleotide i en RNA sekvens i nærvær av overflødig mengder en selv slukke acylation reagens på en saklig måte. Acylation reagensen er ikke stabil i vann, med en kort halveringstid av (f.eks T1/2 = 17 s 1-methyl-7-nitroisatoic anhydride; eller 1 M 7 ~ 20 min til 2-methylnicotinic acid imidazolide eller NAI)22 og insensitivitet identitet baser23. Dette resulterer i en mer gunstige acylation av 2-OH gruppene med fleksible baser, som kan forvandles til en nøyaktig vurdering av dynamikken i hver nucleotide. Spesielt er en nucleotide i en base-par vanligvis mindre reaktiv enn et kort til en 2-OH endring reagens, som NAI og 1 M 7.

Ser på kilden til malen RNA og hvor 2-OH acylation foregår, kan figur generelt kategoriseres i in vitro og i celle form. I vitro FIGUREN bruker renset T7 transkribert RNA og mangler en mobilnettet sammenheng i eksperimentell design. I celle form forekommer både RNA mal transkripsjon og 2-OH acylation i levende celler. resultatene kan derfor recapitulate RNA strukturelle modellen i en mobilnettet sammenheng. I celle FIGUREN har blitt referert til som vivo form for FIGUREN i levende celler i litteratur24. Siden dette eksperimentet ikke utføres i en dyr, kalte vi dette eksperimentet som i celle figur for nøyaktighet.

Strategier for primer forlengelsen stadium av in vitro og i celle FIGUREN er også forskjellig. I vitro form stopper omvendt transkripsjon på 2-OH acylation posisjon i nærvær av Mg2 +. Filtypen 32P-merket primer derfor vises som et band i polyakrylamid gel geleelektroforese (side) og intensiteten av bandet er proporsjonal med den acylation rate1. I celle form, omvendt transkripsjon genererer tilfeldige mutasjoner på 2-OH adduct posisjon i nærvær av Mn2 +. Mutational frekvensen av hver nucleotide kan bli slått av i dybden neste generasjons sekvensering, og FIGUREN reaktivitet med enkelt-nukleotid oppløsning kan deretter beregnes.

Et problem for i celle figur er lav signal-til-støy forholdet (dvs. et flertall av de 2-OH er uendret, mens uforandret sekvensene opptar mesteparten av lese i neste generasjons sekvensering). Nylig en metode for å berike 2-OH endret RNA, referert til som vivo klikker figur (icSHAPE), ble utviklet av Chang laboratorium25. Denne berikelse metoden kan være en fordel i å studere svak små molekyler som RNA samspill, spesielt i en transcriptome hele avhør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. i Vitro figur

Merk: Protokollen er endret fra den publiserte protokollen1.

  1. Forbereder malen RNA
    Merk: Malen for T7 transkripsjon ble bestilt som en syntetisk double-strandet DNA (dsDNA) og forsterket av enten innsetting en E. coli vektor som bærer en unik par av EcoRI/BamHI begrensning endonuclease nettsteder, som pET28a eller PCR. Protokollen for PCR forsterkning er illustrert nedenfor.
    1. Bland deg: 50 μL av PCR blande (se Tabell for materiale), 2 μL for hver innføring i 10 μM (se tabell 1 for sekvenser), 200 ng dsDNA mal i 2 μL 3 μL dimethyl sulfoxide (DMSO) og 41 μL H2O. Aliquot i to PCR rør (hver rør inneholder 50 μL av reaksjonsblandingen).
    2. Definere den termiske cycler som følger: trinn 1) 95 ° C for 30 s; scene 2) 95 ° C for 20 s; scene 3) 56 ° C for 20 s; Stage 4) 72 ° C for 20 s; Trinn 5) sløyfe tilbake til trinn 2 for 30 sykluser; Trinn 6) 72 ° C i 3 min; og 7) uendelig holder på 4 ° C til følgende trinn.
    3. Rense PCR-amplicon ved utvinning av gel skiver (se Tabell av materialer og bruker produsentens protokollen). Elute produktet DNA med 35 μL Tris-EDTA (TE) buffer, som inneholder 10 mM Tris (pH 8.0) og 1 mM EDTA, å gi en 0.1-0,5 μg/μL mal. Normalisere renset DNA malen i 0.10 μg/μL.
      Merk: Eventuelt kan kvaliteten på malen analyseres på en 1,8% agarose gel geleelektroforese med 0.10 μg DNA. Et enkelt band av ønsket mal DNA er forventet gel.
    4. Angi T7 transkripsjon reaksjonen (totalt volum 40 μL) ved å legge følgende materialer i et PCR-rør: 4 μL 10 x reaksjon buffer, 4 μL ATP, 4 μL CTP, 4 μL GTP, 4 μL UTP, 4 μL av T7 enzym (se Tabell for materiale) , 4 μL renset PCR-amplicon fra trinn 1.1.3 (0,4 μg) og 12 μL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann. Bland ved pipettering opp og ned 4 x. Ruge på 37 ° C 4-16 h i en termisk cycler eller en 37 ° C inkubator.
      Merk: Begynne å sette opp trinn 1.1.6 mens reaksjonen i trinn 1.1.4 pågår.
    5. Tilsett 2 μL av DNase blande av pipettering opp og ned 4 x og ruge på 37 ° C i 15 min. blanding med like volum 2 x Tris-borate-EDTA (TBE)-urea eksempel buffer (se Tabell for materiale). Varme på 70 ° C i 3 minutter å deaktivere.
    6. I en RNase-gratis flaske, bland 75 mL av 40% akrylamid/bisacrylamide løsning (29:1, se Tabellen for materiale), 180.2 g av urea, og 50 mL 10 x TBE buffer (RNase-fri, se Tabellen for materiale). Sette flasken på en orbital shaker (250 rpm) til alle krystaller av urea er oppløst (kan ta opptil 2 timer). Juster volumet til 500 mL med DEPC-behandlet vann. Filtrere løsningen med en 0,2 μm membran (se Tabell for materiale).
      Merk: I denne prosessen, unngå bruker speilende og rør-bar for å hindre RNase forurensning. Løsningen kan lagres på 4 ° C i opptil 1 år.
    7. Rengjør to glassplater som geleelektroforese riktig størrelse (16,5 cm x 24 cm) med deionisert vann og 70% EtOH med en tørke papir. Juster platene med en 2.0 mm avstandsstykker (platen med en silikoniserte overflate er vender innover) og forsegle kanten av platene med tape. Dobbelt-bånd hjørnet av plate å hindre lekker.
    8. I et beaker, bland 200 mL av akrylamid løsning fra trinn 1.1.6 2.0 mL 10% ammonium persulfate løsning og 100 μL tetramethylethylenediamine (TEMED) med en RNase-fri pipette tips ved røring raskt i 30 s. Tilt platene på et stykke Borstemmaskin dekselet og hell løsningen fra åpningen av platene. Trykk platen for å løfte bobler og Legg platen flatt på Borstemmaskin dekselet. Umiddelbart sett kammen og la gel danner minst 1t.
      Merk: Hvis gel skal brukes i neste dag, dekk toppen av gel med en våt papirhåndkle og brytes med et større stykke plast brytes. Plass den liggende flat på 4 ° C.
    9. Fjern båndet og klemme platen i en geleelektroforese stå. Fjerne kam og legger tilstrekkelig 1 x TBE buffer på toppen og bunnen av reservoaret. Pre kjøre gel i 30 min 20 W.
      Merk: Hvis innholdet i den ønskede RNA ~ 90% eller mer, kan eventuelt en mini gel brukes i erstatning av et skytevåpen gel.
    10. Vask hver av lasting av pipettering opp og ned to ganger med væske i reservoaret. Legg råolje RNA fra trinn 1.1.5 i brønnene. Kjøre gel på 20 W til xylen cyanol FF fargestoff (lys blå) passerer om lag to tredeler av gel er lengde (~ 60 minutter).
      Merk: Sikre for å laste mer enn en tredjedel av høyden av brønnen (bruk flere brønner hvis nødvendig).
    11. Fordype gel i 1 x TBE buffer med 1:10,000 fortynning av safen fargestoff (se Tabell for materiale) i en beholder stort nok for gel. Sette beholderen på en orbital shaker i 5 min på 80 rpm.
    12. Under UV-lys, identifisere ønsket RNA bandet og raskt kuttet en tynn gjeng gel med et rent barberblad. Sted 1-2 gel skiver i en 1,7 mL tube.
    13. Gjenopprette RNA fra gel stykket passiv elueringsrør. Legge til tilstrekkelig elueringsrør/nedbør mix (~0.3 mL per sektor) i hver retning: 0,3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% natrium sulfat dodecyl (SDS) i DEPC-behandlet vann. Rotere røret som inneholder gel splice(s) på 4 ° C 16 h.
      Merk: En typisk utvinningsgrad er ~ 75% i dette trinnet. For å øke avkastningen, fjerne og samle eluent og legge til den samme mengden elueringsbufferen deretter gjenta dette trinnet.
    14. Kombinere eluent i en ny 1,7 mL tube. Legge til 2,5 ganger iskald EtOH, invertere rør seks ganger for å blande væsken og plassere rør ved-80 ° C i minst 1 time.
    15. Sentrifuge for 10 min på 10.000 x g og 4 ° C. Fjern forsiktig nedbryting av pipettering. Vask RNA pellet ved å legge til 80% EtOH (1 mL per rør), vortex for 15 s og sentrifuge for 10 min på 10.000 x g og 4 ° C.
    16. Fjern nedbryting og air-dry RNA pellet for 5 min. legge 50 μL av RNase-fritt vann og bland av pipettering opp og ned 10 ganger. Normalisere RNA konsentrasjonen til 0,10 μg/μL. Lagre den renset RNA på-80 ° C.
      Merk: Ikke tørr RNA pellet over.
    17. Eventuelt for å analysere kvaliteten på RNA, fortynne 1 μL (100 ng) av fra trinn 1.1.16 av 5 μL av vann og bland med 5 μL 2 x TBE-urea eksempel buffer. Deretter varme på 70 ° C for 3 min og belastningen på en 6% TBE-urea mini gel.
      1. Kjør gel på 180 V for 1 h. Utfør den flekker som gjort i trinn 1.1.11. Visualisere gel med UV i en tenkelig system. Et enkelt band er ventet på ønsket lengde.
  2. Forbereder 32P-merket primer
    1. Definere reaksjonen ved å blande følgende materialer: 10 μL γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, se Tabellen for materiale), 2 μL omvendt transkripsjon (RT) primer (100 μM, sekvens se tabell 1), 2 μL 10 x T4 polynucleotide kinase (PNK) reaksjon buffer, 1 μL T4 PNK (se Tabell for materiale), og 5 μL RNase-fritt vann. Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
      Forsiktig: Riktig beskyttelse er behov for trinn 1.2-1.5 en autorisert arbeidsplassen for radioaktivt materiale.
    2. Varme-Deaktiver etter 20 min på 65 ° C. Legge til eksemplene på en avsalting kolonne og sentrifuger 1000 x g for 1 min. Bland eluent med 25 μL 2 x TBE-urea eksempel buffer. .
      Merk: Lagre merket råolje produktet på 20 ° C ikke å bli umiddelbart renset.
    3. Kjøre en 10% akrylamid gel på 20 W 1t.
      Forsiktig: Last 32P-merket primer fra trinn 1.2.1 på gel og unngå blødning radioaktiviteten i topp reservoaret. Ikke Legg mer enn en tredjedel av høyden på frisk å sikre en tynn bandet på gel (bruk flere brønner hvis nødvendig). Væsken i bunnen reservoaret kan være svært radioaktivt.
    4. Fjerne glassplater av gel kassetten og lå gel på et stykke plast brytes. Brett plastfolie å dekke toppen av gel å gjøre en lufttett sandwich. Plasser gel sandwich på en kalsium tungstate fosfor skjerm og utsette med et tenkelig. Bilde gel igjen med vanlige lys å vite hvor kantene av gel er.
    5. Bruk en bildebehandling for å overlappe to bilder. Juster gel på utskriften. Bruk en frisk barberblad til å kutte ønsket band av gel. Sted 1 til 2 gel skiver i en 1,7 mL tube.
      Merk: Kontroller det utskrevne bildet har samme størrelse som faktiske gel. Dobbeltsjekk justeringen av imaging leftover gel igjen etter kutte ut gel sektoren.
    6. Gjenopprette 32P-merket primer ved å følge trinn 1.1.13 til 1.1.16. Ta 1.0 μL løsning en 0,4 mL tube og fortynne primer med 1 x TE buffer å få radioaktiviteten på 1,0 μL på ~ 100.000 cpm. Lagre den rensede 32P-merket primer på-80 ° C til RNA 2-OH endring reaksjon, men i mer enn 4 uker.
  3. Små molekyl bindende og RNA 2-OH modifikasjon
    1. For å forberede fire prøver, kan du legge 8 pmol RNA i 32 μL 0.5 x TE buffer slik 1,7 mL varme ved 80 ° C i 2 minutter, og snapin-cool på is minst 1 min.
      Merk: Bruke denne formelen til å beregne den omtrentlige Molekylvekten av RNA: MW = (# baser) x 340 Da.
    2. Legge til 8 μL 5 x folding blanding som inneholder 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl2og 500 mM NaCl. Aliquot 9 μL RNA blandingen i hver av de fire PCR rør og etikettere dem #1-#4. Tilsett 1 μL av 10% DMSO til #1 røret, 1 μL konsentrert små molekyl løsning (10% DMSO) i #2, 1 μL utvannet små molekyl løsning (10% DMSO) i #3 og 1 μL vann i #4.
    3. Inkuber PCR rørene på 37 ° C i en termisk cycler i 30 min.
    4. Rett før 2-OH endring reaksjonen, fortynne 1 μL NAI lagerløsning (2 M) med 3 μL DEPC-behandlet vann til en 0,5 M fungerende løsning. Uten forsinkelse, Legg 1 μL NAI arbeider løsning i rør #1, #2 og #3 og 1 μL 25% DMSO i #4. Ruge på 37 ° C i en termisk cycler i 15 min.
    5. Legg 100 μL elueringsrør/nedbør blande (se trinn 1.1.13 for oppskrift), 2 μL glykogen (15 mg/mL) og overføre alle flytende inne hver PCR rør til en 1,7 mL tube. Legge til 0.34 mL iskald 200-bevis EtOH (3 x volum) i hver retning. Blanding av vortexing for 5 s og sted rør i-80 ° C fryser minst 1t.
      Merk: I denne perioden begynne å definere sekvensering gel brukes i trinn 1.5.1.
    6. Sentrifuger i 15 min på 14 000 x g og 4 ° C. Fjerne nedbryting uten å forstyrre RNA-pellets. Vask RNA pellet ved å legge til 80% EtOH (0,5 mL per rør), vortex for 15 s og sentrifuger i 15 min på 20.000 x g og 4 ° C. Fjerne nedbryting igjen.
      Merk: Alternativt kan du bruke en Geiger-teller for å sikre den radioaktive pellet beholde i røret.
    7. Air-Dry RNA pellet for 5 min. legge 9 μL RNase-fritt vann og bland av pipettering opp og ned 10 ganger.
      Merk: Ikke tørr RNA pellet over. Alle nedbør forventes å bli oppløst ved slutten av dette trinnet.
  4. Markør forberedelse og primer utvidelse
    1. Overføre den endrede RNA i 4 nye PCR rør og merke dem #1-#4 som tidligere. Legge 2 pmol kontrollen RNA i 7 μL DEPC-behandlet vann 4 ekstra PCR rør og etikettere dem #5-#8. Tilsett 2 μL av radiolabeled primer (trinn 1.2.6) i alle åtte rør. Varme å anneal ved 65 ° C i 5 minutter, og deretter umiddelbart kule ned 4 ° C i det termiske cycler.
    2. Tilsett 4 μL av 5 x RT buffer (se Tabell for materiale), 1 μL dithiothreitol (DTT, 0.1 M) og 1 μL dNTP blanding (10 mM hver) til hver av de åtte PCR-rør.
    3. Tilsett 2 μL av DEPC-behandlet H2O rør #1-#4. Legg 4 μL ddATP (5 mM), 4 μL ddTTP (5 mM) og 4 μL ddCTP (5 mM) inn i rør #5-#7, henholdsvis. Legge til 1 μL ddGTP (5 mM) og 3 μL DEPC-behandlet vann rør #8. Pipetter fire ganger for å blande.
    4. Varme på 52 ° C i 1 min i det termiske cycler. Tilsett 1 μL i revers transkriptase (se Tabell for materiale), deretter blande av pipettering opp og ned fire ganger. Inkuber reaksjonen på 52 ° C i 20 min.
    5. Tilsett 1 μL av 5 M NaOH til hver av rør for å hydrolyze RNA. Varme rør ved 95 ° C i 5 minutter.
    6. Tilsett 5 μL av 1 M HCl og gjenta etanol nedbør (trinn 1.3.5 og 1.3.6), men utelater glykogen og væske.
      Merk: Utelate trinn 1.4.6 resultater i en uskarphet region i gel kjent som "salt front".
    7. Air-Dry DNA pellet for 5 min. legge 10 μL av H2O og 10 μL 2 x TBE-urea smak lasting buffer og pipette opp og ned 10 ganger til redissolve. Varme på 70 ° C i 5 min. plassere rør på is før lasting på gel.
  5. SIDE analyse
    1. For å forberede en 8% polyakrylamid sekvensering gel, fremgangsmåten 1.1.6 til 1.1.10 med følgende modifikasjoner: Bruk 100 mL 40% akrylamid/bisacrylamide løsning (29:1) til å forberede en 8% akrylamid løsning, og sekvensering gel glassplater (f.eks46 x 57 cm) med en 0.4 mm avstand.
    2. Last 10 μL prøven fra trinn 1.4.7. Kjør gel på 65 W 2 h eller til bunnen fargestoff når 3/4 av gel.
      Merk: Lagre resten av prøvene ved-80 ° C for å gjenta om nødvendig.
    3. Fjerne topp silikoniserte glassplaten ved å fjerne avstandsstykket og forsiktig å sette inn en slikkepott. Sett store filter papir å dekke gel og trykk forsiktig for å tillate gel følge filter papir. Starter fra bunnen, løft filter papir og fjerne gel fra glassplaten sammen.
    4. Plass gel med filter papir på et stykke plast brytes som er stor nok til å dekke hele gel (filter papir vender). Overføre filter papir/gel/plast brytes sandwich til en gel tørrere med filter papir side ned.
      Forsiktig: For å unngå radioaktivt materiale forurensning, bruk 3 til 4 mer deler av store filter papir mellom gel sandwich og gel tørrere.
    5. Tørr gel på 70 ° C i 1 time med et vakuum. Overføre gel sandwich på en foto-bleket fosfor lagring skjermen kassett. Utsett radioaktiviteten av gel til skjermen for 4-16 h.
    6. Plass fosfor lagring skjermen på en tenkelig apparat og skanning med middels oppløsning (~ 30 min).
      Merk: Hvis et smil-lignende gjenstand finnes på gel bildet, bruk korrigerende programvare (f.eksSAFA) til å behandle bildet med Publiserbart kvalitet. Vær oppmerksom på at standard markør lane er 1 nukleotid lengre enn 2-OH endring kjørefelt.

2. i celle-FIGUREN

  1. Primer design
    Merk: I motsetning til i vitro form trenger i celle FIGUREN ikke å utforme et uttrykk kassett. Men en optimal primer sett bør brukes og må evalueres før figur eksperimentere.
    1. Generere minst tre unike primer par etter en BLAST-baserte primer design verktøyet (f.eksPrimer-BLAST). For å studere pre-mRNA i menneskelige celler, merker du det menneskelige genomet (ikke transcriptome) som en referansedatabase i Primer par spesifisitet sjekke parametere. Angi størrelsen på amplicon i området fra 200-1000 base-par (bp).
    2. Ekstra genomisk DNA fra ~ 106 celler rundt en spinn kolonne-basert metode med behandling av RNase A og protease K (se Tabell av materialer og bruker produsentens protokollen). Normalisere renset genomisk DNA inne 0.1 μg/μL TE buffer.
    3. PCR med protokollen utført i trinn 1.1.1 og 1.1.2.
      Merk: Ønsket primer settet skal gi et enkelt band på en 1,8% agarose gel.
  2. Forberedelse og 2-OH modifikasjon
    Merk: For å øke overflod av pre-mRNA rundt, en minigene med riktig rekkefølge under cytomegalovirus (CMV) arrangøren for grunnleggende uttrykk er transfekterte inn i verten cellene.
    1. Forvarm kultur medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1 x antibiotika blanding i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) på 37 ° C. Frø 293T celler på 50% confluency 24 timer før transfection kultur medium. Endre mediet til 2% FBS i DMEM uten antibiotika ~ 1 h før transfection.
    2. Legge til 10 μg av minigene plasmider i 100 μL redusert serum media (se Tabell for materiale) i 1 godt i en 96-brønns plate. Pipetter løsningen opp og ned fire ganger å blande.
    3. Legge til 40 μL transfection reagens (se Tabell for materiale) i 100 μL redusert serum medium i en brønn av platen. Pipetter opp og ned fire ganger for å blande. Inkuber ved romtemperatur for 5 min.
    4. Legge til hele plasmider løsningen transfection reagens suspensjon. Pipetter opp og ned fire ganger for å blande. Inkuber ved romtemperatur for 30 min.
    5. Legge hele DNA / transfection reagens blanding dropwise på overflaten av mediet gjennom parabolen. Ruge på 37 ° C for 6-12 h.
    6. Sug opp mediet og vask forsiktig når med 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS, pH 7.4, uten CaCl2 og MgCl2, se Tabellen for materiale). Trypsinize cellene med 3 mL trypsin. Inkuber ved romtemperatur for 5 min.
    7. Slå parabolen forsiktig å distansere cellene fra bunnen av parabolen. Nøytralisere trypsin med 6 mL kultur medium. Sentrifuge på 300 x g for 4 min og fjerne mediet.
    8. Resuspend ~ 106 celler for hvert utvalg i 199 μL reaksjon medium (1% FBS i DMEM) og overføre celle suspensjon i en 96-brønns plate. Inkuber cellene med 1 μL sammensatte fungerende løsning eller 1 μL DMSO i alle tre kontroller for 30 min på 37 ° C.
      Merk: Tre kontroll prøver som skal inkluderes: DMSO kontroll med NAI, denaturert RNA NAI og NAI negativ kontroll.
    9. Legge til 10 μL 2 M NAI hver prøve, bortsett fra denaturing kontroll (DC) RNA og NAI negative kontroller. Pipetter opp og ned fire ganger for å blande. Ruge på 37 ° C for 15 min. forsiktig risting platene re suspendere cellene hver 5 min.
    10. Overføre cellene til 1,7 mL rør og sentrifuger 400 x g i 2 minutter uten forsinkelse. Fjerne nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet.
    11. Legge til 0,4 mL av guanidinium thiocyanate (se Tabell for materiale). Vortex 15 s til homogenize. Inkuber prøvene ved romtemperatur for 5 min.
      Merk: Eksemplene kan lagres på 20 ° C før du fortsetter til neste trinn.
  3. RNA utvinning
    1. Legge til 0,2 mL kloroform hver guanidinium thiocyanate homogenisert prøvene. Vortex for 15 s. Incubate i romtemperatur i 2 minutter.
    2. Sentrifuge for 5 min på 12.000 x g og 4 ° C. Det øverste Fargeløse vandig laget inneholder RNA. Overføre ~ 380 μL vandig løsning til en ny 1,7 mL tube.
      Forsiktig: Ikke forstyrr interphase for å unngå forurensning.
    3. Legge til 1,5 x antall EtOH (~ 570 μL). Vortex 15 s å blande.
    4. Overføre 600 μL RNA blanding i en RNA isolasjon spin-kolonne (se Tabell for materiale). Sentrifuge 12.000 x g for 15 s. kast på eluent. Gjenta dette trinnet å passere all væsken i kolonnen for samme spinn.
    5. Vask kolonnen med 0,35 mL RW1 buffer (se Tabell for materiale) ved å spinne for 15 s. legge 80 μL RNase-free DNase jeg RDD buffer (se Tabell for materiale). Inkuber ved romtemperatur for 20 min.
      Merk: Det er viktig å fjerne alle DNA forurensning.
    6. Senere vasken kolonnen med 0,35 mL RW1 bufferen og 0,6 mL til 2 x RPE-bufferen (se Tabell for materiale) av snurrende 15 s på hvert trinn. Tørke kolonnen ved sentrifugering spinn kolonnen med en tom samling rør på 12.000 x g for 1 min.
    7. Legge til 32 μL RNase-fritt vann til midten av kolonnen. Inkuber for 1 min. sentrifuge 12.000 x g for 30 å få ~ 30 μL renset RNA løsning. Sett prøvene på 20 ° C stund bearbeiding denaturert prøven.
  4. Denaturert RNA kontroll forberedelse
    1. Sted 30 µL RNA utvalg for DC i en 1,7 mL plastrør på is. Legge til 50 μL av formamide og 15 μL DC buffer med 300 mM HEPES (pH 8.0) og 25 mM EDTA inn i røret.
    2. Varme til denature RNA 95 ° c i 1 raskt legge 5 μL NAI lagerløsning (2 M) og flick å mikse og legge røret på oppvarming blokk. Ruge på 95 ° C i en ekstra 1 min og umiddelbart legge røret på is.
    3. Legge til 0,4 mL av guanidinium thiocyanate. Gjenta trinn 2.3.1–2.3.4.
    4. Vask kolonnen med 0,6 mL til 2 x RPE-bufferen (se Tabell for materiale) av snurrende 15 s på hvert trinn. Tørke kolonnen ved sentrifugering spinn kolonnen med en tom samling rør på 12.000 x g for 1 min.
    5. Legge til 32 μL RNase-fritt vann til midten av kolonnen. Inkuber for 1 min. sentrifuge 12.000 x g for 30 å få ~ 30 μL gjenopprettede DC RNA løsning.
  5. Primer-utvidelse
    1. Normalisere RNA løsningen fra 2.3.7 og 2.4.5 i 0,5 μg/μL med RNase-fritt vann. Fersk forberede 30 mM MnCl2 løsning fra MnCl2∙4H2O pulver.
    2. Overføre 9 μL RNA løsning for hvert utvalg til en PCR stripe. Legg 1 μL 10 mM dNTP og 1 μL 2 μM gen-spesifikke primer (GSP) i hver retning. Pipetter opp og ned fire ganger for å blande. Ruge ved 65 ° C i 5 min med en termisk cycler og lagt på is for > 1 min.
      Merk: 1 μL en tilfeldig nonamer kan også brukes i substitusjon av GSP.
    3. I hver PCR tube, Legg en blanding av 2 μL 10 x RT buffer (se Tabell for materiale), 4 μL 30 mM MnCl2og 2 μL 100 mM DTT. Pipetter opp og ned 4 x å blande. Ruge på 42 ° C i 2 minutter.
    4. Tilsett 1 μL i revers transkriptase (se Tabell for materiale). Pipetter opp og ned 4 x å blande. Ruge på 42 ° C i en termisk cycler 3 h.
  6. Biblioteket forberedelse og neste generasjons sekvensering
    1. Definere en PCR reaksjon ved å legge 1 μL DNA polymerase, 5 μL 10 x DNA polymerase buffer (se Tabell for materiale), 2 μL DMSO 1,5 μL for hver primerne (10 μM), 34 μL H2O og 5 μL cDNA fra trinn 2.5.4.
    2. Definere den termiske cycler som følger: trinn 1) 95 ° C i 2 min; scene 2) 95 ° C for 30 s; scene 3) 60 ° C for 30 s; Stage 4) 68 ° C for 30 s; Trinn 5) sløyfe tilbake til trinn 2 for 30 sykluser; Trinn 6) 68 ° C i 3 min; og 7) uendelig holder på 4 ° C til følgende trinn.
    3. Rense amplicon ved hjelp av 1,8% agarose gel.
      Merk: PCR bandet skal vises som et enkelt band på gel.
    4. Konstruere biblioteket ved hjelp av standard fragmentering og ligatur metoder i litteratur6,26.
    5. Rekkefølge på en neste generasjons sekvensering utstyr med 1 x 75 single-end leser for å generere ca 10 millioner leser per prøve.
    6. Analysere resultatene med ShapeMapper og SuperFold programvare pakkene utviklet av ukene gruppe26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viste tidligere at en RNA skjøting modulator, SMN-C2, samhandler med AGGAAG motiv på ekson 7 av SMN2 genet pre-mRNA, og brukte FORMEN for å vurdere RNA strukturelle endringer i nærvær av SMN-C26. Binding området av SMN-C2 er forskjellig fra den FDA-godkjent antisense oligonucleotide (ASO) for SMA, nusinersen, som binder og blokkerer intronic skjøting lyddemper (ISS) på intron 727,28 (figur 1A). Mest kjente skjøting regulatorer av SMN2 ekson 7 er innen ~ 100 nukleotid ekson 7 i pre-mRNA29; derfor en 140 og 276 nukleotid lange RNA sekvenser ble brukt til in vitro og i celle form, representatively, som dekker ekson 7 og tilstøtende intron regionen (figur 1A).

I denne representant i vitro form analyse, er RNA sekvensen av interesse innebygd i en optimalisert kassetten utviklet av uker laboratory, som er kompatibel for de fleste RNA sekvenser1. Noen ganger sekvensen av interesse samhandler eller forstyrrer denne kassetten. I slike tilfeller kan en modifisert kassett brukes med de følgende tre karakteregenskaper: i) en 3-end bestemt primer binding området med en mer effektiv hybridisering affinitet til primer enn noen del av RNA sekvensen, ii) en svært strukturerte hårnål loop ligger direkte oppstrøms av primer binding området som viser bestemt og reproduserbar figur signal (dette vil fungere som både en intern kontroll for eksperimentet og metode for å justere signalet fra eksperimentet å eksperiment) og iii) en 5'-end hårnål struktur element, som angir slutten på FIGUREN signalet. FIGUR kassetten er ytterligere flankert med selv cleaving ribozyme sekvenser på begge 5'- og 3-ender for å generere en homogen RNA30. Vi fant at hammerhead og hepatitt delta virus ribozymes er kompatibel med FIGUREN kassetten og vanligvis gir høy avkastning av den ønskede. Den resulterende malen RNA har en 3-slutten av 2, 3-sykliske fosfat og en 5-slutten av hydroksyl gruppen som ikke forstyrrer primer forlengelsen. En 140-nukleosid lang sekvens dekker ekson 7 SMN2 og tilstøtende regionen i pre-mRNA ble syntetisert i form og ribozyme kassett som vist i ordningen 1.

Generelt bør sekvensen av interesse samskrevet i uttrykket kassetten være lenge nok til å dekke struktur potensielle sekundær eller høyere orden. Ved SMN2 ekson 7 inneholder en 140-nukleotid regionen to stilk-loop strukturer6,31. Strukturen i regionen rundt varierer sak-til-sak, og bør vurderes av prøving og feiling.

Polyakrylamid sekvensering gel med 32P-merket primer utvidelse produkter ble valgt å visualisere i vitro form profilen i dette representant eksperimentet. En alternativ visualisering metode er å bruke kapillært geleelektroforese med en fluorescently merket DNA primer32. Polyakrylamid sekvensering geleer, ~ 20 nucleosides nær 5'-slutten og ~ 10 nukleotider 3-slutten av RNA sekvensen av interesse vil ikke bli visualisert kvantitativt, grunn noen ganger stopper ved innvielsen trinnene omvendt transkripsjon og intense band på siden gels for full lengde transkripsjoner1.

En alternativ måte for skytevåpen gel utvinning av et RNA (trinn 1.1.6 til 1.1.12) er å overbelaste en mini gel hvis avkastningen av ønsket RNA mal > 90%. Det anbefales å fjerne overflødig NTP fra RNA produktet ved avsalte kolonnen og eluting RNA i 50 µL TE bufferen. Måle konsentrasjonen av RNA og laste 5.0 µg i hver brønn. Under rensingen trinn i T7 transkribert RNA mal, stopp siden da xylen cyanol FF fargestoff (lys blå) gikk to tredjedeler av de 6% denaturert TBE-urea gel. Self-cleavage RNA fragmentet (< 80 nucleosides) gikk gjennom gel, som forlot den ønskede RNA som det eneste store bandet i gel på flekker (figur 1B).

SMN-C2 (figur 1 c) ble syntetisert ifølge publiserte prosedyren33 og oppløst i 10 mM DMSO lagerløsning. Lager løsningen er mer utvannet til 500 og 50 µM i 10% DMSO løsning å oppnå siste konsentrasjoner av 50 og 5 µM, henholdsvis. Snapin-avkjølt RNA refolded til sine likevekt scenen i nærvær av DMSO eller SMN-C2 innen 30 min på 37 ° C. Lengre inkubasjon tid endre ikke resultatet av eksperimentet. To eksperimentelle prøver (50 og 5 µM SMN-C2), to kontroller (DMSO og NAI-kontroller) og fire markører (A, T, G, C) ble behandlet for primer forlengelsen. Etter utsette gel fosfor lagring skjermen, vises en vellykket figur eksperiment: i) en enkelt og mest intense band på toppen av gel og ii) band gjennom gel på enkelt-nukleotid oppløsning uten smøre (figur 1 d). Et vanlig problem i side analyse er at et smøre område kjent som "salt foran" kan vises i gel (figur 1E). Dette skyldes trolig høy konsentrasjon av salt, DMSO eller andre uønskede stoffet i lasting prøven som kan fjernes av etanol nedbør.

I i vitro FORMEN, en ren RNA mal er nøkkelen til en vellykket eksperiment. En uren RNA mal er vanligvis årsaken til uønskede resultater. Hvis side analyse viser tydelig et mønster av 2 markører, indikerer at malen RNA er ikke homogent og trenger å bli repurified av skytevåpen TBE-urea gel.

I celle form er nøkkelen til en vellykket eksperiment å utforme en optimalisert primer sett for forsterkning. Med 0.10 µg genomisk DNA-fri cDNA mal praktiseres et enkelt band i 25 PCR sykluser i agarose gel analyse. Repeterende intron sekvensene bør derfor unngås. For å studere strukturelle virkningen av SMN-C2 på SMN2 pre-mRNA, tre primer sett (tabell 2) ble testet, og alle var tilfredsstillende (figur 2A).

En lav kopien antall en mål RNA sekvens er generelt et problem for i celle figur. For å berike RNA rundt, en minigene som inneholder RNA sekvensen rundt under en sterk CMV promoter ble transfekterte i 293T celler. Fordi skjøting mønster av SMN2 minigene viser av endogene SMN2 med eller uten SMN-C219,34, vi ser at strukturen av SMN-C2 samspill RNA i den overexpressed SMN2 pre-mRNA sannsynlig var den samme som endogene gene produktet. Mens EF50 av SMN-C3 i skjøting analysen var ~0.1 µM6,19, brukte en konsentrasjon på høyere slutten (20 µM) å sikre bindende staten små molekyl og målet RNA sekvens.

På isolasjon av den, kan både gen-spesifikke og tilfeldig primere brukes for utvidelsen. Ved ekson 7 av SMN2 fant vi at SMN2E7-338-RV (tabell 2) gir en høyere kopi av ønsket cDNA enn en tilfeldig nonamer, dokumentert av en mer intens band i PCR forsterkning med SMN2E7-276 primer sett (tabell 2) etter 25 sykluser. I trinn 2-OH modifisering ble en 91 µM siste NAI konsentrasjon brukt for en inkubasjonsperiode 15 min. Hvis det brukes en annen celle type eller middels, være inkubasjon tiden nytt optimalisert. Hvis inkubasjon tiden er for lang, agarose gel analyse av amplicon noen ganger ikke viser et band.

En python-basert program, ShapeMapper, utviklet av ukene laboratorium35 ble brukt til å analysere dataene som genereres ved neste generasjons sekvensering [som rådata om SMN-C2 behandlet i celle form av SMN2 ekson 7 pre-mRNA, refererer til sekvens lese arkiv (SRA) database]. Hele amplicon, figur reaktivitet ikke vesentlig endrer (> 1), noe som indikerte at sekundære strukturen fortsatt i nærvær av SMN-C2 (figur 2B). Dette er bekreftet av arc tomter generert av SuperFold35. Tilkobling linjene angir mulig base sammenkoblingen basert på FIGUREN aktivitet av hver nucleotide. SMN-C2 - og DMSO-behandlet RNA modellering er i hovedsak det samme (figur 2C). Differensial i celle figur reaktivitet ble beregnet for hver nucleotide (figur 2B), og de fleste reaktivitet endringen skjedde på TSL-1 (5'-slutten av ekson 7) men ikke TSL-2 (3-slutten av ekson 7). Dette resultatet er enig med den i vitro figur. selv base sammenkoblingen flyttet fra i vitro Analyser figur RNA modellering i celle formet (figur 2D).

Et vanlig problem i celle figurtypen er lav Mutasjonshastigheten gjennom amplicon. Dette skyldes vanligvis genomisk DNA forurensning. DNA inneholder ikke 2-OH gruppen; Derfor er ingen acylation produkter dannet med NAI. PCR forsterkning dermed gjenspeiler bare lav Mutasjonshastigheten av DNA-utvalg. Isolasjon av ved guanidinium thiocyanate etterfulgt av-kolonne DNase fordøyelsen er tilstrekkelig å fjerne alle DNA i de fleste tilfeller. Hvis DNA forurensning vedvarer, gjentar du trinn 2.3 RNA isolering.

Scheme 1
Ordningen 1: DNA sekvensen for malen RNA transkripsjon. 12 bp sekvensen i Hammerhead virus ribozyme sekvensen i rødt er det omvendte supplement av 12 første bp av 5'-kassetten. RNA sekvensen rundt presenteres her er en 140 bp pre-mRNA sekvensen inneholder ekson 7 av menneskelig SMN2 genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell design og resultatet av i vitro form SMN2 ekson 7 pre-mRNA i nærvær av SMN-C2. (A) oversikt over sekvensen av interesse for in vitro og i celle figur studier av SMN2 genet. SMN-C2 binder til AGGAAG motiv på ekson 7, en adskilt beliggenhet fra webområdet nusinersen binding. (B) rensing av T7 transkripsjon produktet. Hver av de tre banene inneholder 5.0 µg av råolje. TBE-urea gel var farget med SYBR-Safe (1:10, 000) i 5 min 1 x TBE buffer. Røde stiplede boksen angir kanten av excision for RNA utvinning. (C) strukturen av SMN-C2. (D) In vitro figur eksperimenter med NAI og en 140 nukleotid lange RNA mal som inneholder ekson 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = mangler av NAI; 5-8 = stiger generert av tillegg av ddATP, ddTTP, ddCTP og ddGTP under primer forlengelsen. SIDEN ble båret ut på en TBE-urea sekvensering gel på 60 W for 3 h. røde stjernene indikerer økt bandet intensitet 50 µM SMN-C26. (E) et eksempel på en "salt front" region i den stiplede røde boksen fra en separat eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: I celle figur avledet RNA modellering for SMN2 ekson 7 pre-mRNA. (A) PCR forsterkning med alle tre primer sett (tabell 2) gitt et enkelt band i agarose gel analyse. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = DNA stigen. (B) differensial i celle figur reaktivitet i SMN2 minigene-transfekterte 293T celler for 10 µM SMN-C2 og DMSO i TSL1. FIGUR reaktivitet med enkelt-nukleotid oppløsning. Dens standardavvik ble beregnet av ShapeMapper programvare35. Grønn asterisk indikerer betydelig figur reaktivitet endring av 10 µM SMN-C2. Nummereringen av nukleotider i 276 bp amplicon vises på x-aksen. Feilfelt ble anslått av form-kartlegger programvare26. (C) Arc tomten generert av SuperFold35 for den mest sannsynlige RNA sekundære strukturen modeling av i celler figurdata. (D) In vitro og i celle figur-rettet modellering av ekson 7 og tilliggende regioner. For i vitro RNA modell vises FIGUREN stabilisere kassett (oransje) og nukleotider 1-19 (blå) i skisse. I celle RNA modellen justeres nukleotid nummerering i vitro form mal. Nukleotider 1-18 og 120-140 ble utelatt. Betydelig reaktivitet endringer er oppgitt i røde og grønne stjernene for in vitro og i celle figur, henholdsvis. De sekundære strukturene som var tidligere kalt TSL1 og TSL231 står i boksene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Primer navn 5 - 3' sekvens
Ribozyme-FW TAAAACGACGGCCAGTGAAT
Ribozyme-RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
RT primer GAACCGGACCGAAGCCCG

Tabell 1: Primer sekvenser i representant eksperimentet.

navn Sekvens (5 "-> 3")
SMN2E7-338-FW AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-FW AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-FW TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

Tabell 2: primer setter for forsterkning av pre-mRNA sekvensen interessepunkter. Alle tre primer sett gir en enkel amplicon i en PCR reaksjon med genomisk DNA-fri cDNA mal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vitro form er det avgjørende å bruke høykvalitets homogen RNA mal. T7 transkripsjon, men gir ofte heterogene sekvenser36. Spesielt er sekvenser med ±1 nukleotid på 3-terminus med ikke-ubetydelig gir36 vanligvis vanskelig å bli fjernet av polyakrylamid gel rensing. Heterogen RNA mal kan resultere i mer enn ett sett av signalet i sekvensering gel profilering av primer utvidelse produktet, som noen ganger gjør det vanskelig å tolke resultatet. Ribozyme på begge 5'- og 3-ender av RNA mal uttrykk kassetten vil gjøre begge ender homogen.

For både in vitro og i celle FIGUREN er inkubasjon tiden 2-OH endring reagenser en annen viktig faktor. Det ble foreslått av gruppen uker at minst fem ganger halveringstiden av vann-slukker 2-OH acylation reagensen skal brukes1. I våre hender, rugende med NAI (T1/2 = ~ 20 min) for > 30 min i både in vitro og i celle form fører til et overreagert resultat. Som vist i figur 1 d, gode i vitro form en profilering må > 50% totale signalet over gel som full transkripsjon, sikre at de fleste av endret RNA er bare acylated en gang. Overreaksjon gjengis dobbel-acylated produktet ikke-ubetydelig og profilering partisk til beriket korte utvidelse produkter. I celle form, skal amplicon for biblioteket bygging vises som et enkelt band i agarose gel analyse (trinn 2.6.3). Smøre bandet indikerer en overreaksjon, og incubate tiden skal reduseres. Representant eksperimentene var en 15 min incubation tid på 37 ° C optimal for in vitro og i celle figur. Dette bør brukes som utgangspunkt for NAI endring i lignende programmer.

Det er andre 2-OH endring reagenser22 mye brukt for figur, for eksempel 1 M 7. Sammenlignet med NAI, har 1M 7 en bedre reaktivitet 2-OH grupper og kortere half-life vann22. I våre hender dannet 1M 7 massive mengden gult nedbør i celle kultur medier i et i celle figur eksperiment som komplisert RNA isolasjon. For en sammenligning grunn brukes både in vitro og i celle FIGUREN NAI som 2-OH endring reagensen for en studie av SMN-C2 og SMN2 pre-mRNA interaksjoner. Hvis bare i vitro form kreves, er 1 M 7 et alternativ som demonstrert av ulike studier i riboswitch strukturelle besluttsomhet7,8.

Generelt, er i celle figur i vitro formen foretrukket, spesielt hvis molekylet handler antagelig i kjernen i en eukaryot celle. RNA-bindende proteiner i kjernen er rikelig, og det er nesten umulig å recapitulate mobilnettet sammenheng i vitro vilkår.

I det siste tiåret blir FIGUREN standardmetoden for å studere sekundære strukturen av. Sammenlignet med tradisjonelle RNA footprinting med RNase37, er det mer egnet til å studere små molekyl-RNA interaksjoner, som disse samhandling kan være svak og ufølsom RNase utfordringer.

Stor begrensning av bruk av FIGUREN små molekyl-indusert RNA strukturelle endringer er at resultatene ikke avslører binding området. I in vitro og i celle form for SMN-C2 bundet pre-mRNA, har figur reaktivitet ikke endret i det antatte bindende nettstedet (figur 1 d, finne 2B); snarere reaktivitet på 2 til 3 eksterne nettsteder på loop eller rikke regionen ble endret. SMN-C2 antagelig bindes til en RNA dobbel heliks region (figur 1 d, figur 2D), som vanligvis har en lav figur reaktivitet. Derfor vil videre stabilisere strukturen for å redusere figur reaktivitet trolig ikke være observerbare. Generere en antatte binding området, andre metoder som ChemCLIP38 bør brukes, der en crosslinking kjemiske sonde er involvert.

Et vanlig alternativ tilnærming til RNA sekundær eller høyere struktur og nukleotid dynamics er NMR massespektrometri39,40. Det har vist at RNA dynamics avledet fra kvantitative NMR analyse sterkt correlate med FIGUREN aktivitet39. I forbindelse med små molekyl bindende, kan kjemiske Skift forstyrrelser avsløre samspill nukleotider21.

Som RNA målretting små molekyler blir en ny modalitet narkotika utvikling11, ser vi at FIGUREN vil bli etablert standard metode å vurdere de strukturelle konsekvensene av målet i nærvær av små molekyler. I fremtiden, er en transcriptome hele avhør metode for RNA målretting små molekyl narkotika ønsket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble gjort mulig ved NIH R01 tilskudd (NS094721, K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

Denne måneden i JoVE problemet 143 små molekyl RNA målretting RNA struktur i vitro form form spinal muskel atrofi RG-7916 i celler
Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter