Denne protokol beskriver en effektiv metode til at syntetisere en nanoemulsion af en oliesyre acids-platinum(II) konjugat stabiliseret med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptid. Nanoemulsion formularer på mild syntetiske betingelser via samlesæt af KYF og konjugation.
Vi beskriver en metode til at producere en nanoemulsion bestående af en oliesyre acids-Pt(II) kerne og en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) belægning (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE indkapsler Pt(II) på 10 wt. %, har en diameter på 107 ± 27 nm og en negativ overflade ladning. KYF-Pt-NE er stabilt i vand og i serum, og er biologisk aktive. Konjugation af en fluorophore til KYF tillader syntesen af en fluorescerende nanoemulsion, der egner sig til biologiske billeddannelse. Syntesen af nanoemulsion er udført i et vandigt miljø og KYF-Pt-NE former via samlesæt for en kort KYF peptid og en oliesyre acids-platinum(II) konjugat. Samlesæt proces afhænger af temperaturen af løsningen, det molære forholdet mellem substraterne, og strømningshastigheden af substrat tilsætning. Afgørende skridt omfatter opretholde den optimale omrøring sats under syntesen, tillader tilstrækkelig tid til samlesæt og pre at koncentrere nanoemulsion gradvist i en centrifugal koncentrator.
I de seneste år har der været en voksende interesse for Ingeniørvidenskab af nanopartikler til sådanne biomedicinske anvendelser som medicinafgivelse og bioimaging1,2,3,4. Landbrugets multifunktionalitet nanopartikel-baserede systemer kræver ofte inkorporerer flere komponenter inden for én formulering. De byggesten, der er baseret på lipider eller polymerer ofte adskiller sig med hensyn til deres fysisk-kemiske egenskaber samt deres biokompatibilitet og biologiske nedbrydelighed, som i sidste ende kan påvirke funktionen af nanostrukturer1, 5,6. Biologisk afledte materialer, såsom proteiner og peptider, har længe været anerkendt som lovende komponenter af multifunktionelle nanostrukturer på grund af deres sekvens fleksibilitet7,8. Peptider selv samle til stærkt bestilte Supramolekylær arkitekturer danner spiralformet bånd9,10, fibrøst stilladser11,12, og mange flere, dermed bane vejen til bygning biomolekyle-baserede hybrid nanostrukturer ved hjælp af en bottom-up tilgang13.
Peptider er udtømt for applikationer i medicin og bioteknologi, især til anticancer behandling14 og hjerte-kar-sygdomme15 såvel som for antibiotika udvikling16,17, metaboliske lidelser18, og infektioner19. Der er over hundrede af små-peptid therapeutics gennemgår kliniske forsøg20. Peptider er lette at ændre og hurtig til at syntetisere til en lav pris. Derudover er de biologisk nedbrydelige, som i høj grad letter deres biologiske og farmaceutiske anvendelser21,22. Brugen af peptider som strukturelle komponenter omfatter engineering af modtagelig, peptid-baserede nanopartikler og hydrogel depoter for kontrolleret frigivelse23,24,25,26 , 27, peptid-baserede biosensorer28,29,30,31, eller bio-elektroniske enheder32,33,34. Vigtigere, selv korte peptider med to eller tre amino-syre rester, der omfatter phenylalanin blev fundet til at guide den samlesæt behandler35,36,37 og oprette stabiliseret emulsioner38 .
Platinum-baserede lægemidler på grund af deres høje effekt, der anvendes i mange kræft behandlingsregimer, både alene og i kombination med andre agenter39,40. Platin forbindelser inducerer DNA-skader ved at danne monoadducts og intrastrand eller interstrand cross-links. Pt-DNA læsioner er anerkendt af den cellulære maskiner, og hvis ikke repareret, føre til cellulært apoptose. Den vigtigste mekanisme, hvorved Pt(II) bidrager til kræft celledød, er hæmning af DNA transkription41,42. Fordele ved platinum terapi er dog faldet med systemisk toksicitet af Pt(II), der udløser alvorlige bivirkninger. Dette fører til lavere kliniske dosering af Pt(II)43, hvilket ofte resulterer i sub terapeutiske koncentrationer af platin nå DNA’ET. Som følge heraf bidrager DNA reparation, der følger til kræft celle overlevelse og erhverve Pt(II) modstand. Platin kemo-modstand er et stort problem i anticancer terapi og den vigtigste årsag til behandling fiasko44,45.
Vi har udviklet en stabil nanosystem, der indkapsler Pt(II) agent for at give en afskærmning virkning i systemisk cirkulation og mindske bivirkninger Pt II-induceret. Systemet er baseret på en oliesyre acids-Pt(II) kerne stabiliseret med en KYF tripeptid til at danne en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggesten af KYF-Pt-NE, aminosyrer tripeptid samt oliesyre, har generelt anerkendt som sikre (GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE er udarbejdet ved hjælp af en nanoprecipitation metode47. Kort sagt, er oliesyre acids-Pt(II) konjugat opløst i et organisk opløsningsmiddel og derefter tilsættes dråbevis til en vandig KYF løsning (figur 1) ved 37 ° C. Løsningen rørte i flere timer at tillade samlesæt af KYF-Pt-NE. Nanoemulsion er koncentreret i 10 kDa centrifugal koncentratorer og vaskes tre gange med vand. Den kemiske ændring af KYF med en fluorophore tillader syntesen af fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE egnet til biomedicinsk billeddannelse.
Kritiske trin i nanoemulsion syntese omfatter justering kindtand forholdet mellem substraterne, vedligeholdelse temperatur og flow sats kontrol under oliesyre acids–Pt(II) tilsætning, giver tilstrækkelig tid til samlesæt og rensning af produktet ved hjælp af en centrifugal koncentrator kolonne. Disse parametre påvirke størrelse og morfologi af KYF-Pt-NE; således er det især vigtigt at fastholde de rette molære forhold og justere de syntetiske betingelser korrekt.
Forholdet mellem su…
The authors have nothing to disclose.
Vi taknemmeligt anerkender støtte fra National Cancer Institute, give SC2CA206194. Ingen konkurrerende finansielle interesser er erklæret.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |