Summary
이 프로토콜에서 포드는 phenyoxadiazolyl 메 틸 sulfone 기반 시 약 쓰이므로, 특히 항 체의 thiols 화물의 사이트 선택 첨부 파일에 대 한 종합을 설명 합니다. 또한, 합성 및 포드 베어링 bifunctional chelator 및 모델 항 체에의 활용의 설명 합니다.
Abstract
Maleimide 베어링 bifunctional 프로브는 생체, 특히 항 체에서에서 thiols의 사이트 선택 수정에 대 한 수십 년 동안 고용 되었다. 아직 maleimide 기반 어원이 같은 말 표시 제한 안정성 vivo에서 succinimidyl thioether 연계 역-마이클 반응을 받 다 수 있습니다. 이것, 물론, 방사성 페이로드 또는 순환에 thiol 베어링 쓰이므로 그 교류의 출시 발생할 수 있습니다. 이러한 프로세스의 둘 다 건강 한 장기에 높은 활동 농도 생산할 수 있는 뿐만 아니라 대상 조직, 감소 된 이미징 대비 하 고 낮은 치료 비율 활동 농도 감소. 2018, 우리 보고 모듈, 안정, 그리고 쉽게 접근할 수 있는 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 시 약의 창조-불리는 '포드'-bioconjugations thiol 기반 플랫폼으로. 우리는 명확 하 게 그 사이트 선택 bioconjugations 포드 기반 reproducibly 튼튼하게 만들 균질 성, 잘 정의 된, 높은 immunoreactive, 그리고 매우 안정적인 radioimmunoconjugates 증명 하고있다. 또한, 대 장 암의 murine 모델에서 전 임상 실험 보여주었다는 이러한 사이트에 선택적으로 표시 된 radioimmunoconjugates 전시까지 우수한 vivo에서 성능 maleimide 기반을 통해 합성 방사선된 항 체에 비해 활용형입니다. 이 프로토콜에서 포드, DOTA (포드-DOTA), 유비 쿼터 스 chelator의 bifunctional 포드 베어링 변형 및 항 HER2 타겟팅 trastuzumab 포드 DOTA의 활용의 창조의 4 단계 합성을 설명 합니다.
Introduction
Radiopharmaceutical 화학자 긴 선택도 및 두 핵 영상에 대 한 질병의 생체에 대 한 항 체의 특이성을 악용 하 고 방사선 치료1대상. 멀리 떨어져 가장 일반적인 접근 radiolabeling 항 체의 아미노산을 방사선된 prosthetic 그룹 또는 radiometal chelators 무차별 부착에 입각 한-가장 자주 lysines-면역 글로불린 ( 의 구조 내에서 그림 1A)2. 이 전략은 확실히 효과적인, 무작위, 사이트 일반적인 자연의 문제를 만들 수 있습니다. 특히, 전통적인 bioconjugation 접근 생산 제대로 정의 하 고 이기종 immunoconjugates 생물학과 약리학 속성3의 그것의 자신의 세트에 각각 다른 regioisomers의 수천의 혼합물의 구성. 또한, 임의의 bioconjugation 화물 면역 글로불린의 항 원 묶는 도메인을 추가 하는 경우 항 체의 immunoreactivity를 방해 수 있습니다.
년 동안, 다양 한 사이트 및 사이트 선택 bioconjugation 전략 문제4,5를 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 접근의 가장 일반적인 maleimide 베어링 프로브 시스테인 (그림 1B)의 sulfhydryl 그룹의 결 찰 의존합니다. IgG1 항 체는 자연스럽 게 4 간 체인 이황화 다리, 선택적으로 무료 thiols succinimidyl thioether 채권 형태로 maleimides와 마이클 추가 반응 진행의 수를 줄일 수 있는 관계를 포함 합니다. Thiols 및 maleimides의 사용은 확실히 전통적인 방법에 비해 개선 및 다양 한 maleimide 베어링 synthons와 bifunctional chelators 현재 수 있습니다. 그러나,이 방법론 뿐만 아니라 심각한 한계는 중요 하다. Maleimide 기반 immunoconjugates thioether 연계 역-마이클 반응 (그림 2)6,7,,89, 를 받을 수 있기 때문에 제한 된 안정성 vivo에서 전시 10.이, 물론, 방사성 페이로드 또는 thiol 베어링 생체 순환 (예를들면, 티 또는 혈 청 알 부 민)에 그것의 교류의 릴리스를 이어질 수 있습니다. 이러한 프로세스의 둘 다 수 건강 한 기관에서 활동 농도 증가 시킬 뿐 아니라 대상 조직, 감소 된 이미징 대비 하 고 낮은 치료 비율 활동 농도 감소. 여러 대체 thiol 반응 시 약 tosylates, 브로 모 및 요오드 독점, 그리고 비닐 sulfones11,12,13, 를 포함 하 여 이러한 문제를 회피 하기 위해에서 개발 되었습니다. 14 , 15 , 16 , 그러나 17., 이러한 접근의 제한이 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 방해 하는.
약 5 년 전, 스 크립 스 연구소에서 늦은 카를로스 Barbas III의 실험실 thiols (그림 1C 및 그림 3)와 매우 안정적인 연계의 선택적 형성에 대 한 시 약으로 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfones의 사용을 개척 18 , 19. 저자 고용 fluorescein 수정 설계 무료 시스테인 잔류물을 포함 하는 여러 항 체의 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 베어링 변종 궁극적으로 유사한 보다 높은 안정성과 immunoconjugates를 생산 maleimide 기반 프로브를 사용 하 여 만든 구조입니다. 우리가이 기술을 radiochemistry에서 거의 사용만 했 고 했다 사용 하지 않은 모든 bifunctional chelators 또는 radioimmunoconjugates20,21 의 합성에 다소 놀 랐 다이 유망한 작품을 보고, 시 . 그러나 응용 프로그램,,의이 부족은 곧 더 이해 하기 시작: 시그마 올드 리치에서 시 약 조달에 여러 번 시도 결과 저하 제품의 복잡 한 혼합물의 영수증에 < 원하는 화합물의 15%. 또한, 합성 보고 시 스스로 아니었다 현실적인 옵션, 게시 된 합성 경로 다소 복잡 하 고 정교한 유기 화학 장비를 필요로 하는 대부분 radiochemistry 및 분자 영상 실험실-우리를 포함 한-단순히가지고 있지 않습니다.
이러한 장애물에 대응, 우리는 쉽게 접근할 수 있는 만들고 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 시 강력 하 고 합리적으로 손쉬운 합성 경로 통해 얻을 수 있는 매우 안정적인 밖으로 설정 합니다. 올해 초, 우리 보고 모듈, 안정, 그리고 쉽게 접근할 수 있는 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 시 약의 창조-불리는 '포드'-thiol 기반 bioconjugations (그림 1C 및 그림 3)22에 대 한 플랫폼으로. 포드 시의 주요 차이점 Barbas에서 보고 외 전 고용 동안 후자 기능 같은 위치 (그림 4)에 페 놀 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone moiety에 연결 된 아닐린 반지입니다. 이 변경 용이 하 게 더 간단 하 고 접근 가능한 합성 노선 뿐만 아니라-만약 상용 화합물과 우리의 경험 상징 이다-더 안정적인 최종 시. 이 작품에서는, 우리는 또한 포드 베어링 bifunctional chelators의 쌍 합성-포드-돌연 사 했을까와 포드-CHX-A '-DTPA-각각 89Zr- 177루 라는 radioimmunoconjugates의 창조를 촉진 하기 위하여. 우리가 토론 하는 것입니다, 우리는 포드-기반 사이트 선택 bioconjugations reproducibly 튼튼하게 만들 균질 성, 잘 정의 된, 높은 immunoreactive, 그리고 매우 안정적인 radioimmunoconjugates 증명 하고있다. 또한, 대 장 암의 murine 모델에서 전 임상 실험 보여주었다는 이러한 사이트에 선택적으로 표시 된 radioimmunoconjugates 전시 우수한 vivo에서 성능 maleimide 기반을 통해 합성 방사선된 항 체에 비해 활용형입니다.
이 작품의 아치를 만들 목표는 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 정의 균질, 매우 안정적이 고, 높은 immunoreactive immunoconjugates의 생성을 촉진. 합성 접근은 거의 모든 실험실에서 아주 간단 하 고 부모 포드 시 다른 chelators, fluorophores, 또는 화물의 과다와 함께 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜에 동반 비디오, 포드 (그림 5);의 간단한, 4 단계 합성 설명 합니다. DOTA, 64Cu의 조화, 68가, 111에, 177Lu, 및 225Ac (그림 6);에 대 한 널리 chelator의 포드 베어링 변형 생성 그리고 모델 항 체, HER2 타겟팅 IgG1 trastuzumab (그림 7)에 포드 DOTA의 bioconjugation.
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Protocol
1. 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)의 합성
참고: 때문에 화합물의 빛 감도, 호 일 적용 선박에 모든 반응을 유지.
- 10 ml에서 둥근 바닥 플라스 크, 100mg (0.517 mmol, 1 해당) 3 ml 메탄올의 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol의 분해.
- 이 솔루션에 추가 diisopropylethylamine의 360 μ (DIPEA; 2.07 mmol; 4 등가물, 무수)와 작은 자석 저 어 바. 고무 스 토퍼와 플라스 크를 커버 하 고 실 온에서 10 분 동안 해결책을 저 어.
- 1 mL 유리 주사기를 사용 하 여, 고무 마 개를 통해 구멍을 신속 하 게이 혼합물에 iodomethane의 32 μ (0.517 mmol, 해당 1)를 추가 합니다. 실 온에서 45 분간 반응 혼합물을 허용 한다.
참고: iodomethane의 잠재적인 유해한 영향으로이 반응을 할 수 화학 증기 두건에. - 40 ° C 회전 증발 기의 물 목욕을 설정 하 고 천천히 여유 백색 고체 용 매를 제거 하는 압력을 줄일 수 있습니다.
- 에틸 아세테이트의 3 mL에 고체를 녹이 고 separatory 깔때기를 사용 하 여 0.1 M 탄산 나트륨의 5 mL 해결책으로 세 번 이상 씻어.
참고: 정기적으로 UV 램프; 아래 수성 단계의 자리-검사를 받아 일단 아무것도 램프에서 볼 수 있다는 세척을 중지할 수 있습니다. - Separatory 깔때기에 유기 단계를 수집 하 고 수성 단계의 pH 6.8-7.0에 도달할 때까지 물으로 그것을 씻어 (pH 종이 사용 하 여).
- 유기 단계를 수집 하 고 물의 모든 흔적을 제거 하려면 황산 마그네슘을 추가.
참고: 황산 마그네슘 후 솔루션 swirled 한다 작은 주걱으로 추가 되어야 합니다. 건조 용 대리인의 미세 입자 여전히 보인다면,이 솔루션은 건조. 그렇지 않은 경우에 미세 입자를 볼 수 있습니다 때까지 황산 마그네슘의 작은 금액을 추가. - 중간 유리 frit 또는 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 합니다.
- 로터리 증발 기, 흰색 바늘으로 원하는 제품을 생산 해야 하는 과정을 사용 하 여 휘발성 증발.
2. tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl의 합성] carbamate (2)
참고: 때문에 화합물의 빛 감도, 호 일 적용 선박에 모든 반응을 유지.
- 25 ml에서 둥근 바닥 플라스 크, 387의 밀리 그램 (0.92 m m o l, 1.0에 해당) NBoc-n ′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine dichloromethane 10 mL에 녹.
- 이 솔루션에 추가 480 μ (2.76 mmol, 3에 해당)의 DIPEA, N의 264 mg (1.38 mmol, 1.5 등가물)-에틸-n ′-[3-(dimethylamino) 틸] carbodiimide 염 산 염 (EDCI), 200 밀리 그램 (0.97 mmol, 1.1 등가물) 1. 유리 스 토퍼와 함께 용기를 밀봉 하 고 상 온에서 5 일 동안 저 반응.
참고: dichloromethane의 증발의 수 있습니다. 필요한 경우, 일주일 내내 더 추가. - 1 M 염 산 (3 x 5 mL)의 솔루션 separatory 깔때기에 혼합물을 씻어.
- 유기 단계를 수집 하 고 계속 separatory 깔때기, 먼저 1 M 나2CO3 (2 x 5 mL)의 해결책 그리고 물 (3 x 5 mL)에 그것을 씻어.
- 유기 단계를 수집 하 고 물의 모든 흔적을 제거 하려면 황산 마그네슘을 추가 (단계 1.7 참조). 중간 유리 frit 또는 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 합니다.
- 회전 증발 기를 사용 하 여 오프 화이트 솔리드 감당할 감압에서 휘발성 용 매를 제거 합니다.
- 다시이 고체의 에틸 아세테이트 10 mL에 녹이 고 침전 cyclohexane의 30 mL의 점진적 (예를 들어, 한 번에 2 mL) 추가 통해 제품.
- 필터 종이 또는 백색 분말으로 제품을 얻기 위해 중간 유리 릿 솔루션을 필터링 합니다.
3. tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl의 합성] carbamate (3)
참고: 때문에 화합물의 빛 감도, 호 일 적용 선박에 모든 반응을 유지.
- 10 mL 둥근 바닥 플라스 크에서 30 mg (0.05 m m o l, 1 해당) dichloromethane 4 mL에 2 의 분해.
- 천천히이 혼합물에 70 %m-chloroperbenzoic 산의 49 mg (0.2 m m o l, 4에 해당)에 추가 하 고 유리 스 토퍼와 함께 반응 배를 커버. 실내 온도에, 궁극적으로 저조한 노란색 혼합 솔루션 밤새 저 어.
- Separatory 깔때기, 먼저 솔루션과 0.1 M NaOH (3 x 5 mL)의 그리고 물 (3 x 5 mL)에 노란색 혼합물을 씻어.
- 마그네슘 황산 염과 유기 단계를 건조 하 고 중간 유리 frit 또는 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 합니다.
- 회전 증발 기를 사용 하 여, 창백한 솔리드로 제품을 감소 압력에서 용 매를 제거 합니다.
4. N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] 페 닐} succinamide (포드)의 합성
- 25 ml에서 둥근 바닥 플라스 크, 3 dichloromethane의 2.0 ml에서의 30 mg을 분해.
- Trifluoroacetic 산의 400 μ를 추가 하 고 유리 스 토퍼와 플라스 크를 밀봉.
- 3 시간 동안 실 온에서 반응 혼합물을 저 어.
- 회전 증발 기를 사용 하 여, 휘발성 기름 잔류물을 떠나 실내 온도에서 감소 된 압력 하에서 제거 합니다.
- 물 7 ml에서 기름 찌 꺼 기를 녹이 고, 에틸 아세테이트 (3 x 4 mL)로 씻어 separatory 깔때기를 사용 하 여. 수성 층을 유지.
- 백색 분말으로 포드 를 감당할 수성 층 lyophilize
참고: 280 298 nm에서 포드에 대 한 어 금 니 흡수 계수 각각 9,900 및 12400 c m-1M-1은.
5. 포드 DOTA의 합성
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 디 메 틸 sulfoxide (0.018 m m o l, 1에 해당)의 300 μ에 포드의 10mg을 녹이 고 26 μ N, N-diisopropylethylamine (0.15 mmol; 8 등가물)의 추가.
- Dimethylsulfoxide의 100 μ에 DOTA-Bn-NCS (0.02 m m o l, 1.2 등가물)의 15.2 mg를 녹이 고 단계 5.1에서 솔루션으로이 솔루션을 결합 하 여. Microcentrifuge 관 봉인.
- 하룻밤 실 온에서 품 어에 반응을 수 있습니다.
- 역 상 C18 HPLC 크로마토그래피를 사용 하 여 모든 unreacted DOTA Bn NCS를 제거 하는 제품을 정화.
참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브, 등), 각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 정화 하기 전에 적절 한 컨트롤을 실행 해야 합니다. 그러나, 만약과 MeCN/H2O의 그라데이션 예제를 제시 (모두 0.1 %TFA)과 MeCN/h 조2O를 (모두 0.1 %TFA) 30 분 이상 반 대리점 19 x 250 m m C18 칼럼 및 6 mL/min의 유량 사용 됩니다 포드, p-SCN-Bn-DOTA, 그리고 포드 DOTA 14.4, 18.8, 19.6 분 주위의 정체 시간을 각각 있을 것 이다. 모든 세 가지 화합물 254에 감시 될 수 있다 nm.
6 trastuzumab 포드 DOTA의 bioconjugation
참고:이 단계에 대 한 우리 trastuzumab의 16.4 mg/mL 재고 솔루션으로 시작 했다.
- 낮은 단백질 바인딩 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 인산 염 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)의 859 μ와 trastuzumab 재고 솔루션 (1 mg, 6.67 nmol, 1 해당) 61 μ 희석.
- 이 혼합물에 갓 만든된 10 mM의 솔루션 TCEP H2O (66.7 nmol, 10에 해당)의 6.7 μ를 추가 합니다.
- DMSO에 포드-DOTA의 1 mg/mL 해결책을 준비 하 고 반응 혼합물 (66.67 nmol, 10에 해당)에이 포드 DOTA 솔루션의 73 μ를 추가.
- Microcentrifuge 관을 밀봉 하 고 상 온에서 2 시간에 대 한 솔루션을 품 어.
- 2 시간 후, 사전 포장된 일회용 크기 제외 염 열을 사용 하 여 immunoconjugate 정화.
- 첫째, 어떤 방부 제는 열에 저장 하는 동안 제거 하는 공급자에 의해 설명 된 대로 크기 제외 열을 equilibrate. 전형적인 절차 포함 열 열의 볼륨에 해당 하는 PBS의 볼륨을 5 번 세척: 5 x 2.5 mL PBS의.
- 다음, 지적 반응 혼합물의 볼륨 크기 제외 열에 반응 혼합물을 추가 합니다.
- 반응 혼합물이 열을 입력 한 후 추가 열에 추가 솔루션의 전체 볼륨을가지고 PBS의 적절 한 금액 최대 2.5 mL. 예를 들어 활용 반응 1.3 mL의 전체 볼륨에 있는 경우, 추가 PBS의 1.2 mL 해야 열에 추가 합니다.
- 마지막으로,는 eluent로 PBS의 2 개 mL를 사용 하 여 제품을 수집 합니다.
- 마지막 immunoconjugate 50 kDa 분자량 컷오프로 원심 여과 단위로 집중.
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Representative Results
이 프로토콜의 처음 네 단계-포드의 합성-강력 하 고 안정 되도록 설계 되었습니다. Deprotonation 및 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol 원하는 thioether 제품의 대체 월급에서 thioether > 99% 수율 45 분 후. 다음, 결 찰 1 과 N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine 표준 펩 티 드 프로시저를 커플링, 55% 수율에서 (2) 제품의 컬렉션에서 결과 통해 달성 되었다. 다음, 2 의 산화 m-chloroperoxybenzoic 산, 널리 사용 되는 산화 제를 사용 하 여 수행 되었다. 세척 단계에 따라 3 ~ 90% 수확량에 창백한 솔리드로 얻은 했다. 마지막으로, 3 에서 tert-butyloxycarbonyl 보호 그룹의 제거 dichloromethane:trifluoroacetic 산의 4:1 비율을 사용 하 여 표준 절차에 따라 이루어졌다. 수성 단계, 우리의 제품의 동결은 후-포드-98% 수익률에 백색 분말으로 얻은 했다. 반응의 진행은 얇은 층 크로마토그래피를 통해 뒤 그리고 각 제품의 id 1H NMR, 13C NMR, HRMS-ESI (표 1)를 통해 확인 됐다.
포드 시의 주요 이점 중 하나는 모듈화입니다. Chelators, fluorophores, 독 소, 또는 다른 화물의 다양 한 화합물의 펜 던 트 아민에 추가 될 수 있습니다. 닥 프로토콜에서 대표 페이로드로 유비 쿼터 스 chelator DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic 산)을 사용 하는 우리. DOTA, 물론 사용 되었습니다 바이오 방사성 의약품의 넓은 범위에는 chelator로 68가 64Cu, 111에, 90Y, 177루를 포함 하 여 radiometals와 225Ac. 이 위해, DOTA (p-SCN-Bn-DOTA)의 isothiocyanate 베어링 변종 고용 되었고 간단 커플링 조건을 통해 포드의 펜 던 트 아민을 결합. 결과 bifunctional chelator 역 상 C18 HPLC를 통해 정화 그리고 ~ 75% 수확량에서 고립 되었다. 다른 선구자와 마찬가지로 반응의 진행은 얇은 층 크로마토그래피를 통해 뒤 그리고 제품의 id 1H NMR, 13C NMR, HRMS-ESI (표 1)를 통해 확인 됐다.
프로토콜의 마지막 단계 모델 면역 글로불린, 항 HER2 타겟팅 trastuzumab 포드 DOTA의 사이트 선택 bioconjugation을 다루겠습니다. 이 항 체의 경첩 지역의 이황화 결합은 TCEP 원제와 선택적으로 감소 한다 [tris(2-carboxyethyl) phosphine]. 이 감소 단계 항 체는 실 온에서 2 h에 대 한 포드 DOTA와 함께 알을 품 이며 이후 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제. 이 경우에, 순화, DOTA 베어링 immunoconjugate ~ 80% 수익률에서 얻은 고 MALDI ToF 분석 공개 ~1.8 DOTA/mAb (DOL) 라벨의 정도. 일반적으로 말하자면, 우리는 발견 TCEP, 포드 시 고 2 h 외피의 10 등가물의 10 등가물 2 포드/mAb (표 2)의 돌과 immunoconjugate를 생성 하기에 충분. 이 결과 다양 한 인간, 인간 답게, 그리고 공상 IgG1 항 체; 일관성 유지 그러나, 동일한 조건 murine IgG1 항 체를 작업할 때만 ~1.5의 돌과 immunoconjugates를 생산 합니다. 이 모든 연구는 새로운 항 체와 포드 베어링 화물에 대 한 이러한 반응 조건 최적화 해야 했다. 마지막으로, 그리고 중요 한 것은, 최종 제품에 관하여 우리는 반복적으로 그리고 reproducibly 발견 포드 기반 immunoconjugates immunoreactivities 동일 하거나 유사한 구문을 사용 하 여 만든 임의 또는 maleimide 기반 보다 더 나은 전시 활용 전략입니다.
그림 1: 베어링-아민 반응 (B) maleimide, (A) 및 (C) 포드-베어링 화물을 사용 하 여 bioconjugations의 구조 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Thiol 베어링 biomolecule (녹색)와 방사선된 구문 내 생의 면 전에 서 받을 수 있습니다 추가 반응 뿐 아니라 방사선된 bioconjugate를 형성 하기 위하여 방사성 핵 종 베어링 maleimide (황색)의 마이클 추가 thiol 베어링 분자 (분홍색)입니다. RT = 실내 온도. Adumeau, 피, Davydova에서 허가로 증 쇄 하는 그림, M. Zeglis, B. M. Thiol 반응 Bifunctional Chelators는 창조의 사이트에 선택적으로 수정 Radioimmunoconjugates 향상 된 안정성에 대 한. Bioconjugate 화학. 29, 1364-1372 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 포드는 thiol 사이 반응의 도식 Adumeau, 피, Davydova에서 허가로 증 쇄 하는 그림, M. Zeglis, B. M. Thiol 반응 Bifunctional Chelators는 창조의 사이트에 선택적으로 수정 Radioimmunoconjugates 향상 된 안정성에 대 한. Bioconjugate 화학. 29, 1364-1372 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 포드 (B) 로 서 (A) 의 구조 시 보고 Barbas, 외.18,19이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 포드의 4 단계 합성의 체계. Adumeau, 피, Davydova에서 허가로 증 쇄 하는 그림, M. Zeglis, B. M. Thiol 반응 Bifunctional Chelators는 창조의 사이트에 선택적으로 수정 Radioimmunoconjugates 향상 된 안정성에 대 한. Bioconjugate 화학. 29, 1364-1372 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 포드-DOTA의 합성의 체계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 포드-DOTA와 trastuzumab의 bioconjugation의 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 89huA33 포드 기반 (89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33) 및 maleimide 기반 (89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33) bioconjugation 전략을 사용 하 여 만든의 Zr 표시 된 radioimmunoconjugates의 vivo에서 행동의 비교. 평면 (왼쪽)와 athymic 누드 마우스 A33 항 원 표현 SW1222 대 장 암 xenografts (흰색 화살표) 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33 및 89 의 주입에 따라 베어링의 최대 강도 (오른쪽) 프로젝션 애완 동물 이미지 Zr-돌연 사 했을까-말-huA33 (140 µCi, 60-65 µ g). 종양의 센터를 교차 하는 코로나 조각. Adumeau, 피, Davydova에서 허가로 증 쇄 하는 그림, M. Zeglis, B. M. Thiol 반응 Bifunctional Chelators는 창조의 사이트에 선택적으로 수정 Radioimmunoconjugates 향상 된 안정성에 대 한. Bioconjugate 화학. 29, 1364-1372 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 89huA33 포드 기반 (89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33) 및 maleimide 기반 (89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33) bioconjugation 전략을 사용 하 여 만든의 Zr 표시 된 radioimmunoconjugates의 vivo에서 행동의 비교. 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33 및 athymic 누드 마우스 A33 항 원 표현 피하 SW1222 인간 대 장 암 xenografts 베어링 89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33 (30 µCi, 15-18 µ g) 관리 후 Biodistribution 데이터입니다. 위, 작은 창 자와 큰 창에 대 한 값 내용을 포함. Adumeau, 피, Davydova에서 허가로 증 쇄 하는 그림, M. Zeglis, B. M. Thiol 반응 Bifunctional Chelators는 창조의 사이트에 선택적으로 수정 Radioimmunoconjugates 향상 된 안정성에 대 한. Bioconjugate 화학. 29, 1364-1372 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 화합물 | 1 H NMR 교대 | 13 C NMR 교대 | HRMS | |||
| 1 | (500 MHz, CDCl3) 7.79 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 6.72 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 4.04 (2 H, br), 2.75 (3 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 166.3 163.7, 149.7, 128.5, 114.8, 113.5, 14.8 | m/z Calcd [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; 발견: 208.0539; Δ: 0.0 p p m | |||
| 2 | (500 MHz, CDCl3) 9.68 (1 H, s), 7.91 (2 H, d, J = 9.0 Hz), 7.71 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 6.82 (1 H, s), 4.99 (1 H, s), 3.70-3.45 (12 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6.0 Hz), 3.20 (2 H, q, J = 6.5 Hz), 2.76 (3 H, s), 2.71 (2 H, m), 2.63 (2 H m), 1.80-1.70 (4 H, m), 1.42 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.3, 165.8, 164.6, 156.2, 141.8, 127.7, 119.6, 118.6, 79.2, 70.6, 70.5, 70.3, 70.1, 69.6, 38.8, 38.5, 33.5, 31.6, 29.9, 28.6, 14.8 | [C28H43N5O8S + 나]에 대 한 m/z Calcd+: 632.2725; 발견: 632.2722; Δ:-0.47 ppm | |||
| 3 | (500 MHz, CDCl3) 9.99 (1 H, s), 7.98 (2 H, d, J = 9.0 Hz), 7.75 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 6.88 (1 H, s), 4.99 (1 H, s), 3.66-3.50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = 6.0 Hz), 3.20 (2 H, q, J = 6.5 Hz), 2.71 (2 H, m), 2.65 (2 H, m) 1.80-1.70 (4 H, m), 1.43 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172.6, 171.5, 166.5, 161.6, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 116.4, 79.1, 70.5, 70.4, 70.2, 70.0, 69.4, 43.0, 38.8, 38.4, 33.2, 31.3, 29.7, 28.4 | m/z Calcd [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; 발견: 642.2797; Δ:-0.93 ppm | |||
| 포드 | (500 MHz, D2O) 7.85 (2 H, d, J 9.0 Hz =), 7.55 (2 H, d, J = 8.5 Hz), 3.60-3.45 (15 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 3.20 (2 H, t, J = 6.5 Hz) 3.04, (2 H, t, J 7.0 Hz =), 2.67 (2 H, t, J = 6.5 Hz), 2.54 (2 H t, J = 6.5 Hz), 1.87 (2 H, qt, J = 6.5 Hz), 1.70 (2 H, qt, J = 6.5 Hz) | (125 MHz, D2O) 174.5, 173.2, 166.8, 161.4, 142.2, 128.6, 120.3, 116.6, 69.4, 69.4, 69.3, 69.2, 68.2, 68.2, 42.5, 37.6, 36.2, 31.9, 30.7, 28.2, 26.4 | m/z Calcd [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; 발견: 542.2281; Δ: 0.37 ppm | |||
| 포드-DOTA | (600mhz, DMSO d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1 시간, 학사), 8.04 (2 H, d, J = 8.6 Hz), 7.99 (1 H, s), 7.90 (1 H, t, J = 5.0 Hz), 7.86 (2 H, d, J = 6.5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7.9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7.1 Hz), 4.35-2.41 (45, 남) 3.70 (3 H, s), 1.76 (2 H, q, J = 6.3 Hz), 1.61 (2 H, q, J = 6.5 Hz) | (125 MHz, DMSO d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162.2, 158.8, 158.6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119.5, 118.5, 116.5, 116.4, 70.2, 70.1, 70.0, 68.7, 68.5, 43.4, 41.8, 36.3, 32.2, 30.4, 29.8, 29.1 | m/z [C47H68N10O16S2+ H] Calcd+: 1093.4334; 발견: 1093.4327; Δ:-0.64 ppm | |||
표 1. 포드, 포드-DOTA 특성 데이터 합성 중간체에 대 한 설명.
| 항 체 | 유형 | 일정 지역 | 포드: mAb의 비율 |
| 인간의 플라즈마 IgG | 인간의 | 인간 IgG | 2.1 ± 0.1 |
| Trastuzumab | 인간 답게 | 인간 IgG1 | 2.0 ± 0.1 |
| huA33 | 인간 답게 | 인간 IgG1 | 2.1 ± 0.1 |
| Cetuximab | 공상 | 인간 IgG1 | 2.2 ± 0.1 |
| AR 9.6 | Murine | Murine IgG1 | 1.4 ± 0.1 |
| 마우스 플라즈마 IgG | Murine | Murine IgG | 1.5 ± 0.1 |
표 2. 포드-베어링 fluorophore와 활용에 따라 서로 다른 항 체의 라벨의 정도. 값은 표준 편차를 표시 됩니다. 표 Adumeau, 피, Davydova에서 허가로 증 쇄 M., Zeglis, B. M. Thiol 반응 Bifunctional Chelators는 창조의 사이트에 선택적으로 수정 Radioimmunoconjugates 향상 된 안정성에 대 한. Bioconjugate 화학. 29, 1364-1372 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다.
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Discussion
이 보고서에서 우리는 하지 radiolabeling 또는 vivo에서 실험에 대 한 모든 프로토콜을 포함 하도록 선택 했습니다. 우리의 이유는 간단 합니다. 전에 관하여 radiolabeling 포드 기반 immunoconjugate의 차이가 하지 않는 전혀 다른 bioconjugation 전략을 사용 하 여 합성 하는 immunoconjugate의 그리고이 종합적으로 검토 하는 다른2 . 후자에 관해서는 전 임상 생체 조건 실험 (즉, 마우스 모델, 복용량, 등)의 구체적인 광범위 하 게 응용 프로그램 및 항 체/항 원 시스템에 따라 달라질 수 있습니다.
HuA33 89Zr 표시 된 변형 우리의 이전 조사 포드 기반 bioconjugations의 장점의 뛰어난 그림을 제공합니다. HuA33은 A33 항 원, 막 횡단 당단백질에 표현 대상 humanized IgG1 항 체 > 대 장 암23,24의 95%. 우리의 이전 원고22, 우리는 두 포드 및 maleimide 기반의 bioconjugation 전략을 사용 하 여 89Zr-돌연 사 했을까-huA33 radioimmunoconjugate의 합성을 보고 합니다. 2 방사선 항 체- 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33 및 89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33-거의 동일한 수율, 순도, 구체적 활동, 및 immunoreactivity에서 생산 되었다. 그러나 두 개의 radioimmunoconjugates 인간의 혈 청에 극적으로 다른 안정성을 전시 하는, 비판적,: 후 37 ° C에서 7 일 동안 부 화, 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33 86 ± 1%를 그대로 유지, 동안 그것의 maleimide 기반 사촌만 61 ± 5% 그대로. Vivo에서 애완 동물 이미징 및 athymic 누드 마우스 A33 항 원 표현 SW1222 인간 대 장 암 xenografts 밝혀 스 탁 동작에 차이 vivo에서 (그림 8 , 2 radioimmunoconjugates의 베어링에 biodistribution 실험 그림 9). 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33와 89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33 생산 종양 조직에 높은 활동 농도: 56.4 ± 6.9%ID/g와 49.6 ± 9.3%ID/g, 관리 후 48 h 각각. 그러나, maleimide 기반 radioimmunoconjugate 포드 기반 에이전트 보다 건강 한 조직에 상당히 높은 활동 농도 생성 한다. 예를 들어 89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33 생산 활동 농도 3.1의 ± 0.5, 2.7 ± 0.4, 그리고 12.2 ± 0.4 %ID / g 신장, 간, 뼈에 각각 120 h 후 주사 값 극적으로 활동 농도 초과 하는 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33 같은 조직에 의해 제작 (1.4 ± 0.1, 0.3, 그리고 4.3 1.2 ± ± 0.6 %ID / g). 실제로, 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33 120 h 후 주입 89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33에 비해 낮은 활동 농도 (대 장)를 제외 하 고 모든 비 표적 조직에서 생산. 그 결과, 89Zr-돌연 사 했을까-포드-huA33에 대 한 종양 기관 활동 농도 비율은 그 89Zr-돌연 사 했을까-말-huA33; 일반적으로 우수한 특히, 종양-간, 비장에 종양, 종양 신장, 및 종양 뼈 활동 농도 비는 maleimide에서 파생 된 사촌에 비해 포드 기반 immunoconjugate에 대 한 거의 두 배 있다. 두 radioimmunoconjugates의 주요한 차이 chelator의 bioconjugation 핸들을 고려, 포드 thiol 결합의 증가 한 안정성은 거의 확실히이 향상 된 vivo에서 성능에 대 한 책임.
광범위 한 보기를 받는, lysines 항 체 내에 프로브 사이트 선택-bioconjugation 보면 항 체의 수정에 대 한 간단 하 고 손쉬운 접근입니다. 그러나, 면역 글로불린의 구조를 통해 배포 하는 여러 lysines의 존재 정확한 사이트 또는 bioconjugation2의 정도 제어할 수 있다는 것을 의미 합니다. 그 결과,이 무작위 전략 종종 제대로 정의 생성 하 고 수 매우 이질적인 immunoconjugates 감소 immunoreactivity ligations3항 원 묶는 도메인 내에서 발생 하는 경우. Bioconjugation 사이트 선택 방법의 혜택을 모두 radioimmunoconjugates에 대 한 반복적으로 그림 되었습니다 있다 및 항 체 약물 변화8,,1425,26, 27,,2829,30. 즉, 뿐만 아니라 사이트 선택 bioconjugation 전략을 더 잘 정의 생산 할 하 고 전통적인 방법론 보다 동질적인 immunoconjugates, 그들은 또한 만들 이미징 에이전트, radioimmunotherapeutics, 및 Adc vivo에서 향상 된 성능. 아직 어디 ligations 포드 기반에 서 비교에 다른 사이트 선택 수정 전략? 일반적으로 말하자면, 항 체의 사이트 선택 수정에 접근 4 가지 범주로 분류 될 수 있다: (1) ligations 시스테인 잔류물, (2) 무거운 체인 glycans, (3) chemoenzymatic 변환, 그리고 (4) 사용의 조작 유전 공학4,5. 물론,이 분류 시스템이 완벽 하지 않습니다, 그리고 몇 가지 방법 (예: 효소와 무거운 체인 glycans의 수정) 필연적으로 두 가지 범주에 대 한 자격. 각 전략에는 그것의 자신의 장점과 단점 있다. 아직 그들은 복잡 하 고 비싼31,,3233유전 공학 기반 접근 활용의 사이트를 통해 절묘 한 컨트롤을 제공 합니다. 무거운 사슬 glycans 산화 커플링 저렴 하 고 간단, 아직 그들은 면역 글로불린34,,3536,37의 구조적 무결성을 산화 손상 위험 ,38.
Thiol 기반 bioconjugations의 최고 장점은-포드 포함-그들의 단순 하 고 모듈화입니다. 그들의 주요 제한, 다른 한편으로, 항 체, 항 체 당 수정 수와 컨트롤 모두의 사이트 활용의 정도 감소 시키는 특성 내에서 여러 개의 thiols의 존재에서 유래한 다. 이런이 의미에서 thiol 기반 ligations와 무료 시스테인 잔류물을 소유 하기 위하여 유전으로 설계 된 항 체의 결합은 특히 매력적인 접근 이다. 우리 듯이, maleimide 기반 thiol ligations의 또 다른 한계 역-마이클 추가 vivo에서 succinimidyl thioether 본드의 민감성입니다. 그러나 비판적으로, 포드를 사용 하 여가이 문제가 되어있습니다.
하기 전에 우리가 결론, 포드 기술의 응급 자연 장애물의 그것의 자신의 세트를 만들 수에 중요 하다. 예를 들어 아무 포드 베어링 bifunctional chelators (현재) 상업적으로 사용할 수 있으며 임상 약리학, 독물학, 또는 포드 기반 immunoconjugates의 immunogenicity 해결 데이터가 없습니다. 그러나, 우리는 포드 기반 bioconjugations 근본적으로 immunoconjugates는 실험실과 병원에서 합성 하는 방식을 바꿀 가능성이 있다 믿습니다. 현재, 우리는이 화학 기술에 적용 핵 이미징 및 radioimmunotherapy, radioimmunoconjugates의 개발 항 체 약물의 건설에 대 한이 접근의 유틸리티에 대 한 조사 변화 및 다른 바이오 의약품은 현재 진행. 결국, 우리가 진지 하 게 희망 하는이 프로토콜-와 특히 간단 하 고 단순한 화학 우리가 개발-sulfhydryl 기반 활용형에 대 한 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfones의 사용을 촉진 하 고에서 분야에 변화를 촉진에 도움이 될 것입니다 maleimides 보다 안정적이 고 믿을 수 있는 대안을.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 박사 사이 Kiran Sharma 도움이 대화 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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