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Chemistry

साइट-चुनिंदा संशोधित इम्यूनोकॉन्जूगेट्स के निर्माण के लिए थिओल-रिएक्टिव अभिकर्मकों का संश्लेषण और जैवसंयुग्मन

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/59063
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम फली के संश्लेषण का वर्णन करेंगे, एक phenyoxadiazolyl मिथाइल सल्फोने-आधारित अभिकर्मक के लिए कार्गोस की साइट चयनात्मक लगाव biomolecules के thiols, विशेष रूप से एंटीबॉडी. इसके अलावा, हम संश्लेषण और एक फली असर एक मॉडल एंटीबॉडी के लिए द्वि-क्रियात्मक chelator और इसके विकार के लक्षण वर्णन करेंगे ।

Abstract

maleimide असर bifunctional जांच जैव अणु, विशेष रूप से एंटीबॉडी में thiols के साइट चयनात्मक संशोधन के लिए दशकों के लिए नियोजित किया गया है । अभी तक maleimide आधारित संयुग्मों vivo में सीमित स्थिरता प्रदर्शन क्योंकि succinimidyl थायोएथर लिंकेज एक रेट्रो माइकल प्रतिक्रिया से गुजरना कर सकते हैं । यह, ज़ाहिर है, रेडियोधर्मी पेलोड की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं या संचलन में thiol असर जैव अणुओं के साथ इसके आदान-प्रदान. इन प्रक्रियाओं के दोनों स्वस्थ अंगों में ऊंचा गतिविधि सांद्रता उत्पादन के रूप में अच्छी तरह से लक्ष्य के ऊतकों में गतिविधि सांद्रता घटी हुई, कम इमेजिंग कंट्रास्ट और कम चिकित्सीय अनुपात में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं । २०१८ में, हम एक मॉड्यूलर, स्थिर, और आसानी से सुलभ phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone अभिकर्मक के निर्माण की सूचना दी ' फली '-thiol आधारित bioconjugations के लिए एक मंच के रूप में । हम स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि फली आधारित साइट चयनात्मक bioconjugations पुनरुद्भूत और robustly समरूप बनाने, अच्छी तरह से परिभाषित, अत्यधिक immunoreactive, और अत्यधिक स्थिर radioimmunoconjugates । इसके अलावा, कोलोरेक्टल कैंसर के murine मॉडल में पूर्व नैदानिक प्रयोगों से पता चला है कि इन साइट-चुनिंदा radioimmunoconjugates प्रदर्शित अब तक प्रदर्शन में बेहतर radiolabeled के माध्यम से संश्लेषित एंटीबॉडी की तुलना में वीवो कार्यक्षमता में सुपीरियर-आधारित conjugations. इस प्रोटोकॉल में, हम फली के चार कदम संश्लेषण का वर्णन करेंगे, सर्वव्यापी चेल्टर dota (फली-dota) के एक bifunctional फली-असर संस्करण का निर्माण, और HER2 के लिए फली-dota के विकार-एंटीबॉडी trastuzumab लक्ष्यीकरण ।

Introduction

रेडियोहारमास्यूटिकल कैमिस्टों ने लंबे समय से दोनों परमाणु इमेजिंग और लक्षित रेडियोथेरेपी1के लिए बीमारी के बायोमार्कर के लिए एंटीबॉडी की चयनात्मकता और विशिष्टता का दोहन किया है । दूर और दूर एंटीबॉडी के रेडियोलालिंग के लिए सबसे आम दृष्टिकोण रेडियोलेबल कृत्रिम समूहों या रेडियोमेट्रियल chelators के अमीनो एसिड के अंधाधुंध लगाव पर predicated है-सबसे अक्सर lysines-इम्युनोग्लोबुलिन की संरचना के भीतर ( चित्र 1a)2. हालांकि यह रणनीति निश्चित रूप से प्रभावी है, इसके यादृच्छिक, गैर-साइट-विशिष्ट प्रकृति समस्याएं पैदा कर सकती हैं । विशेष रूप से, पारंपरिक bioconjugation दृष्टिकोण खराब परिभाषित और विषम immunoconjugates अलग regioisomers के हजारों के मिश्रण से बना है, जैविक और औषधीय गुण3के अपने स्वयं के सेट के साथ प्रत्येक का उत्पादन । इसके अलावा, अगर कार्गो इम्युनोग्लोबुलिन के एंटीजेन-बाइंडिंग डोमेन में जोड़ा जाता है, तो यादृच्छिक जैवसंयुग्मन एंटीबॉडी के इम्यूनोएक्टिविटी में बाधा उत्पन्न कर सकता है ।

इन समस्याओं के समाधान के लिए इन वर्षों में, साइट-विशिष्ट और साइट-चयनात्मक जैवसंयुग्मन रणनीतियों का एक प्रकार विकसित किया गया है,4,5। इन दृष्टिकोणों में से सबसे आम है-साइस्टीन्स (चित्रा 1b) के सल्फहाइडरिल समूहों के लिए maleimide असर जांच के बंधाव पर निर्भर करता है । IgG1 एंटीबॉडी स्वाभाविक रूप से 4 अंतर-चेन डिसल्फाइड पुलों, लिंकेज कि चुनिंदा करने के लिए मुफ्त के लिए maleimidyl थायोईथर बांड फार्म के साथ माइकल इसके अलावा प्रतिक्रियाओं के दौर से गुजर करने में सक्षम thiols उपज को कम किया जा सकता है शामिल हैं । thiols और maleimides का उपयोग निश्चित रूप से पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार है, और maleimides असर synthons की एक विस्तृत विविधता और bifunctional chelators वर्तमान में उपलब्ध हैं । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि इस पद्धति के रूप में अच्छी तरह से गंभीर सीमाएं हैं । maleimide आधारित immunoconjugates विवो में सीमित स्थिरता प्रदर्शन क्योंकि थायोएथर लिंकेज एक रेट्रो माइकल प्रतिक्रिया से गुजरना कर सकते हैं (चित्रा 2)6,7,8,9, 10. यह, ज़ाहिर है, रेडियोधर्मी पेलोड की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं या संचलन में थियोल असर जैव अणुओं के साथ इसके आदान-प्रदान (जैसे, ग्लूटाथिओन या सीरम एल्ब्युमिन). इन प्रक्रियाओं के दोनों स्वस्थ अंगों में गतिविधि सांद्रता बढ़ाने के साथ ही लक्ष्य के ऊतकों में गतिविधि सांद्रता में कमी, कम इमेजिंग कंट्रास्ट और कम चिकित्सीय अनुपात में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं । कई वैकल्पिक thiol-प्रतिक्रियाशील अभिकर्मकों tosylates, bromo सहित इन मुद्दों को दरकिनार करने के प्रयास में विकसित किया गया है-और iodo-acetyls, और vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. हालांकि, इन सभी दृष्टिकोणों में ऐसी सीमाएं हैं जो उनके व्यापक अनुप्रयोग में बाधा डालती हैं ।

के बारे में पांच साल पहले, scripps अनुसंधान संस्थान में स्वर्गीय कार्लोस बारबास III की प्रयोगशाला thiols साथ अत्यधिक स्थिर संपर्क के चयनात्मक गठन के लिए अभिकर्मकों के रूप में phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfones के उपयोग का बीड़ा उठाया है (चित्रा 1c और चित्रा 3) 18 , 19. लेखकों को एक phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone-असर fluorescein के संस्करण के लिए कई मुक्त सिस्टीन अवशेषों को शामिल करने के लिए इंजीनियर एंटीबॉडी को संशोधित करने के लिए नियोजित, अंततः अनुरूप से उच्च स्थिरता के साथ immunoconjugates का उत्पादन maleimide आधारित जांच का उपयोग कर बनाया constructs । इस होनहार काम को देखने पर, हम कुछ हद तक हैरान थे कि इस तकनीक केवल रेडियोकैमिस्ट्री में शायद ही इस्तेमाल किया गया था और अभी तक नहीं किया गया था सब पर bifunctional चेल्टरों या radioimmunoconjugates के संश्लेषण में इस्तेमाल20,21 . आवेदनों की यह कमी, तथापि, जल्द ही अधिक समझ बनाने के लिए शुरू किया: सिग्मा से अभिकर्मक की खरीद में कई प्रयास-aldrich वांछित यौगिक के < 15% के साथ क्षरण उत्पादों के जटिल मिश्रण की प्राप्ति में हुई । इसके अलावा, रिपोर्ट अभिकर्मक सिंथेसाइज़िंग खुद को एक यथार्थवादी विकल्प भी नहीं था, के रूप में प्रकाशित सिंथेटिक मार्ग कुछ हद तक बोझिल है और परिष्कृत कार्बनिक रसायन विज्ञान उपकरण की आवश्यकता है कि ज्यादातर रेडियोकेमिस्ट्री और आणविक इमेजिंग प्रयोगशालाओं-हमारे सहित-बस अधिकारी नहीं है ।

इन बाधाओं के जवाब में, हम एक मजबूत और यथोचित सतही सिंथेटिक मार्ग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि एक आसानी से सुलभ और अत्यधिक स्थिर phenyloxadiazolyl मिथाइल सल्फोने अभिकर्मक बनाने के लिए बाहर सेट. इस साल के शुरू में, हम एक मॉड्यूलर, स्थिर, और आसानी से सुलभ phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone अभिकर्मक के निर्माण की सूचना दी '-डब ' फली-thiol आधारित bioconjugations के लिए एक मंच के रूप में (चित्रा 1c और चित्रा 3)22। फली और अभिकर्मक के बीच प्रमुख अंतर बारबास द्वारा रिपोर्ट, एट अल. यह है कि पूर्व में एक ऐनिलीन अंगूठी को रोजगार phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfone मोइटी से जुड़ी, जबकि उत्तरार्द्ध एक ही स्थिति में एक phenol सुविधाएँ (चित्रा 4). यह परिवर्तन एक अधिक सरल और सुलभ सिंथेटिक मार्ग के रूप में अच्छी तरह से की सुविधा-अगर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यौगिक के साथ हमारा अनुभव द्योतक है-एक अधिक स्थिर अंतिम अभिकर्मक । इस काम में, हम भी फली की एक जोड़ी संश्लेषित-बिकार्यात्मक chelators असर-फली-dfo और फली-chx-' '-dtpa- ८९zr के निर्माण की सुविधा के लिए-और १७७Lu-लेबल radioimmunoconjugates, क्रमशः । जैसा कि हम चर्चा करेंगे, हम का प्रदर्शन किया है कि फली आधारित साइट चयनात्मक bioconjugations पुनरुद्भूत और robustly समरूप, अच्छी तरह से परिभाषित, अत्यधिक immunoreactive, और अत्यधिक स्थिर radioimmunoconjugates बनाने । इसके अलावा, कोलोरेक्टल कैंसर के murine मॉडल में पूर्व नैदानिक प्रयोगों से पता चला है कि इन साइट-चुनिंदा radioimmunoconjugates प्रदर्शन में बेहतर लेबल radiolabeled के माध्यम से संश्लेषित एंटीबॉडी की तुलना में विवो कार्यक्षमता conjugations.

इस काम का ओवर-आर्चिंग लक्ष्य के लिए अच्छी तरह से परिभाषित, सजातीय, अत्यधिक स्थिर है, और इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में के लिए अत्यधिक immunoreactive immunoconjugates के निर्माण की सुविधा है । सिंथेटिक दृष्टिकोण काफी सरल है लगभग किसी भी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने के लिए, और माता पिता फली अभिकर्मक विभिन्न chelators के एक बहुतायत के साथ संशोधित किया जा सकता है, fluorophores, या कारगो. इस प्रोटोकॉल और साथ में वीडियो, हम फली के सरल, चार कदम संश्लेषण का वर्णन करेंगे (चित्रा 5); dota, ६४घन, ६८Ga, १११में, १७७Lu, और २२५एसी (चित्रा 6) के समंवय के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया chelator के एक फली-असर संस्करण का निर्माण; और फली-dota के एक मॉडल एंटीबॉडी को bioconjugation, HER2-लक्ष्यीकरण IgG1 trastuzumab (चित्रा 7) ।

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Protocol

1.4-[5-(methylthio) का संश्लेषण-1, 3, 4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

नोट: यौगिक की प्रकाश-संवेदनशीलता के कारण, पंनी से ढके जहाजों में सभी प्रतिक्रियाओं को रखें ।

  1. एक 10 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क में, भंग १०० मिलीग्राम (०.५१७ mmol, 1 बराबर) की 5-(4-aminophenyl)-1, 3, 4-oxadiazole-2-मेथनॉल के 3 मिलीलीटर में thiol ।
  2. इस समाधान के लिए, जोड़ें ३६० μl के diisopropylethylamine (dipea; २.०७ mmol; 4 समकक्ष; anhydrous) और एक छोटे चुंबकीय हलचल बार । एक रबर डाट के साथ फ्लास्क कवर और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए समाधान हलचल ।
  3. एक 1 मिलीलीटर गिलास सिरिंज का उपयोग कर, रबर डाट के माध्यम से एक छेद प्रहार और जल्दी से इस मिश्रण को आयोमेथेन के ३२ μl (०.५१७ mmol, 1 समकक्ष) जोड़ें । कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए मिश्रण की अनुमति दें ।
    नोट: आयोदोमेथेन के संभावित हानिकारक प्रभावों के कारण, यह प्रतिक्रिया एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए ।
  4. ४० डिग्री सेल्सियस के लिए एक रोटरी वाष्पकार के जल स्नान सेट और धीरे से एक सफेद ठोस वहन करने के लिए विलायक हटाने के लिए दबाव को कम ।
  5. एथिल एसीटेट के 3 मिलीलीटर में ठोस को भंग करें और एक पृथक्कारी कीप का उपयोग करके ०.१ मीटर सोडियम कार्बोनेट के 5 मिलीलीटर समाधान के साथ कम से तीन बार धोएं ।
    नोट: आवधिक एक यूवी लैंप के तहत जलीय चरण के परीक्षण के स्थान ले लो; एक बार दीपक के नीचे कुछ भी नहीं देखा है, आप washes बंद कर सकते हैं ।
  6. एक पृथक्कारी कीप में कार्बनिक चरण लीजिए और यह पानी से धो जब तक जलीय चरण के पीएच तक पहुंचता है 6.8-7.0 (पीएच कागज का उपयोग कर) ।
  7. कार्बनिक चरण लीजिए और पानी के किसी भी निशान को हटाने के लिए मैग्नीशियम सल्फेट जोड़ें ।
    नोट: मैग्नीशियम सल्फेट एक छोटे से spatula के साथ जोड़ा जाना चाहिए, जिसके बाद समाधान घूमता होना चाहिए । यदि सुखाने एजेंट के ठीक कणों को अभी भी देखा जाता है, तो समाधान शुष्क होता है । यदि नहीं, तो महीन कणों को देखा जा सकता है जब तक मैग्नीशियम सल्फेट की छोटी मात्रा में जोड़ें ।
  8. एक मध्यम कांच frit या फिल्टर कागज का उपयोग कर मिश्रण फ़िल्टर ।
  9. एक रोटरी वाष्पीकार, एक प्रक्रिया है जो सफेद सुई के रूप में वांछित उत्पाद का उत्पादन करना चाहिए का उपयोग कर वाष्पशील लुप्त हो जाना ।

2. tert-butyl का संश्लेषण [18-({4-[5-(methylthio)-1, 3, 4-oxadiazol-2-yl] phenyl} एमिनो)-15, 18-डाइऑक्सो-4, 7, 10-trioxa-14-azaoctadecyl] कार्बामेट (2)

नोट: यौगिक की प्रकाश-संवेदनशीलता के कारण, पंनी से ढके जहाजों में सभी प्रतिक्रियाओं को रखें ।

  1. एक में 25 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क, भंग ३८७ मिलीग्राम (०.९२ mmol, १.० समतुल्य) nboc-n′-succinyl-4, 7, 10-trioxa-1, 13-tridecanediamine के 10 मिलीलीटर में डाइक्लोरोमेथेन.
  2. इस समाधान के लिए, जोड़ें ४८० μl (२.७६ mmol, 3 समकक्ष) का dipea, २६४ एमजी (१.३८ mmol; १.५ समकक्ष) of n-ethyl-n '-[3-(dimethylamino) propyl] कार्बोडाइआईमाइड हाइड्रोक्लोराइड (edci), और २०० मिलीग्राम (०.९७ mmol, १.१ समकक्ष) 1. एक गिलास डाट के साथ पोत सील और प्रतिक्रिया दो कमरे के तापमान पर 5 दिनों के लिए हलचल ।
    नोट: डाइक्लोरोमेथेन के वाष्पीकरण के प्रति सचेत रहें । यदि आवश्यक हो, तो सप्ताह भर में अधिक जोड़ें ।
  3. मिश्रण को एक पृथक्कारी कीप में 1 मीटर हाइड्रोक्लोरिक एसिड (3 x 5 मिलीलीटर) के घोल से धो लें ।
  4. कार्बनिक चरण लीजिए और इसे एक पृथक्कारी कीप में धोने के लिए जारी, 1 एम ना2सह3 (2 x 5 मिलीलीटर) और फिर पानी के साथ (3 x 5 मिलीलीटर) के समाधान के साथ पहले ।
  5. कार्बनिक चरण लीजिए और पानी के किसी भी निशान को हटाने के लिए मैग्नीशियम सल्फेट जोड़ें (चरण १.७ देखें) । एक मध्यम कांच frit या फिल्टर कागज का उपयोग कर मिश्रण फ़िल्टर ।
  6. एक रोटरी वाष्पकर्ता का उपयोग, कम दबाव के तहत अस्थिर सॉल्वैंट्स को दूर करने के लिए एक बंद सफेद ठोस बर्दाश्त ।
  7. एथिल एसीटेट के 10 मिलीलीटर में इस ठोस को फिर से भंग करें और उत्पाद को क्रमिक रूप से (उदा., 2 मिलीलीटर एक समय में) के अलावा 30 मिलीलीटर साइक्लोहेक्सेन के साथ हाला ।
  8. फिल्टर पेपर के साथ समाधान फ़िल्टर या एक सफेद पाउडर के रूप में उत्पाद प्राप्त करने के लिए एक मध्यम गिलास frit.

3. tert-butyl का संश्लेषण [18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1, 3, 4-oxadiazol-2-yl] phenyl} एमिनो)-15, 18-डाइऑक्सो-4, 7, 10-trioxa-14-azaoctadecyl] कार्बामेट (3)

नोट: यौगिक की प्रकाश-संवेदनशीलता के कारण, पंनी से ढके जहाजों में सभी प्रतिक्रियाओं को रखें ।

  1. 10 मिलीलीटर राउंड-बॉटम फ्लास्क में, डाइक्लोरोमेथेन के 4 मिलीलीटर में 2 के 30 मिलीग्राम (०.०५ mmol; 1 समतुल्य) को भंग करें ।
  2. धीमी गति से ४९ मिलीग्राम (०.२ mmol; 4 समकक्ष) के ७०% एम-chloroperbenzoic एसिड इस मिश्रण करने के लिए और एक गिलास डाट के साथ प्रतिक्रिया पोत को कवर में जोड़ें । समाधान कमरे के तापमान पर रात भर हलचल, अंततः एक पीला मिश्रण उपज ।
  3. एक पृथक्कारी कीप में पीले मिश्रण को धो लें, पहले naoh के ०.१ मीटर समाधान के साथ (3 x 5 मिलीलीटर) और फिर पानी के साथ (3 x 5 मिलीलीटर) ।
  4. मैग्नीशियम सल्फेट के साथ कार्बनिक चरण सूखी और एक मध्यम कांच frit या फिल्टर कागज का उपयोग कर मिश्रण फिल्टर ।
  5. एक रोटरी वाष्पकर्ता का उपयोग कर, कम दबाव के तहत सॉल्वैंट्स को एक पीला ठोस के रूप में उत्पाद प्राप्त करने के लिए निकालें ।

4. n1का संश्लेषण-(3-{2-[2-(3-एमिनोप्रोपोक्सी) एथॉक्सी]-ethoxy} propyl)-एन4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1, 3, 4-oxadiazol-2-yl] phenyl} succinamide (फली)

  1. एक 25 मिलीलीटर राउंड बॉटम फ्लास्क में, डिक्लोरोमेथेन के २.० मिलीलीटर में 3 में से 30 मिलीग्राम भंग करें ।
  2. trifluoroacetic एसिड की ४०० μl जोड़ें और एक गिलास डाट के साथ फ्लास्क मुहर ।
  3. 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ ।
  4. एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर, कमरे के तापमान पर कम दबाव के तहत वाष्पशील हटा, एक तेल अवशेषों को छोड़कर ।
  5. पानी की 7 मिलीलीटर में तेल अवशेषों को भंग करने और, एक पृथक्कारी कीप का उपयोग कर, एथिल एसीटेट (3 एक्स 4 एमएल) के साथ धो लें । जलीय परत रखो ।
  6. एक सफेद पाउडर के रूप में फली खरीद करने के लिए जलीय परत lyophilize ।
    नोट: २८० और २९८ एनएम पर फली के लिए मोलर अवशोषण गुणांक क्रमशः ९,९०० और १२,४०० सेमी-1एम-1हैं ।

5. फली का संश्लेषण-dota

  1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, डिमिथाइल sulfoxide के ३०० μl में फली के 10 मिलीग्राम भंग (०.०१८ mmol; 1 समकक्ष) और n के 26 μl जोड़ें, n-diisopropyleथाईलामाइन (०.१५ mmol; 8 समकक्ष).
  2. भंग १५.२ dota के मिलीग्राम-बीएन-ncs (०.०२ mmol; १.२ समकक्ष) में १०० μl dimethylsulfoxide और इस समाधान के साथ समाधान से गठबंधन चरण ५.१. microcentrifuge ट्यूब सील.
  3. कमरे के तापमान पर रात भर सेते करने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
  4. रिवर्स-फेज सी18 एचपीएलसी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके उत्पाद को शुद्ध करें ताकि कोई भी प्रतिक्रिया न देने वाला dota-Bn-ncs निकाल सके ।
    नोट: प्रतिधारण बार स्पष्ट रूप से उच्च प्रत्येक प्रयोगशाला के एचपीएलसी उपकरण पर निर्भर कर रहे हैं (पंपों, कॉलम, ट्यूबिंग, आदि), और उचित नियंत्रण शुद्धि करने से पहले चलाया जाना चाहिए. हालांकि, एक उदाहरण पेश करने के लिए, यदि एक ढाल 5:95 mecn/h2o (दोनों ०.१% tfa के साथ) 70:30 mecn/h2o करने के लिए (दोनों के साथ ०.१% tfa) 30 मिनट से अधिक, एक अर्द्ध तैयारी 19 x २५० मिमी सी18 कॉलम, और 6 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/ , फली, पी-SCN-बीएन-dota, और फली-dota के आसपास के प्रतिधारण समय होगा १४.४, १८.८, और १९.६ मिनट, क्रमशः. सभी तीन यौगिकों २५४ एनएम पर नजर रखी जा सकती है ।

6. फली का जैव संयुग्मन-dota को trastuzumab

नोट: इस कदम के लिए, हम trastuzumab के एक १६.४ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान के साथ शुरू कर दिया ।

  1. एक कम प्रोटीन बाध्यकारी १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, trastuzumab स्टॉक समाधान के पतला ६१ μl (1 मिलीग्राम; ६.६७ nmol, 1 समतुल्य) के साथ ८५९ μl फॉस्फेट buffered खारा (पीएच ७.४) ।
  2. इस मिश्रण करने के लिए, एच2ओ (६६.७ nmol, 10 समकक्ष) में tcep के एक ताजा बनाया 10 मिमी समाधान के ६.७ μl जोड़ें ।
  3. dmso में फली-dota के 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान तैयार करें और इस फली-dota समाधान के ७३ μl प्रतिक्रिया मिश्रण (६६.६७ nmol, 10 समकक्ष) को जोड़ें ।
  4. microcentrifuge ट्यूब सील और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए समाधान सेते ।
  5. 2 घंटे के बाद, एक पूर्व पैक डिस्पोजेबल आकार बहिष्करण डिसॉल्टिंग कॉलम का उपयोग कर immunoconjugate शुद्ध ।
    1. सबसे पहले, संग्रहण के दौरान स्तंभ में मौजूद किसी भी संरक्षकों को निकालने के लिए आपूर्तिकर्ता द्वारा बताए गए आकार बहिष्करण स्तंभ को equilibrate करें. एक ठेठ प्रक्रिया pbs कि कॉलम की मात्रा के अनुरूप है की एक मात्रा के साथ कॉलम 5 बार धोने शामिल है: 5 x २.५ मिलीलीटर पीबीएस की ।
    2. अगले, प्रतिक्रिया मिश्रण आकार बहिष्करण स्तंभ प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा टिप्पण के लिए जोड़ें ।
    3. प्रतिक्रिया मिश्रण स्तंभ में प्रवेश किया है के बाद, समाधान की कुल मात्रा २.५ मिलीलीटर तक कॉलम में जोड़ा लाने के लिए pbs की एक उचित राशि जोड़ें । उदाहरण के लिए, यदि संयुग्मन प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप १.३ मिलीलीटर की कुल मात्रा में, १.२ मिलीलीटर अतिरिक्त पीबीएस को कॉलम में जोड़ा जाना चाहिए ।
    4. अंत में, उत्पाद के रूप में ले लीजिए 2 एल्बी के रूप में पीबीएस की मिलीलीटर ।
  6. एक ५० केडीए आणविक वजन कट-ऑफ के साथ केन्द्रापसारक निस्पंदन इकाइयों के साथ अंतिम immunoconjugate ध्यान लगाओ ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के पहले चार कदम-फली के संश्लेषण को मजबूत और विश्वसनीय बनाया गया है । डिप्रोटोनेशन और 5 का प्रतिस्थापन-(4-एमिनोफेनिल)-1, 3, 4-ऑक्साडाज़ोल-2-थाओल को वांछित थियोएथर उत्पाद बनाने के लिए थायोएथर को > 99% उपज में सिर्फ ४५ मिनट के बाद । अगले, 1 और N-boc-n'-succinyl-4, 7, 10-trioxa-1, 13-tridecanediamine के बीच बंधाव एक मानक पेप्टाइड युग्मन प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया गया था, उत्पाद के संग्रह में जिसके परिणामस्वरूप (2) में ५५% उपज । फिर, 2 के ऑक्सीकरण एम-chloroperoxybenzoic एसिड का उपयोग किया गया था, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया oxidant । धोने के कदम के बाद, 3 ~ ९०% उपज में एक पीला ठोस के रूप में प्राप्त किया गया था । अंत में, 3 से tert-butyloxycarbonyl रक्षा समूह को हटाने के मानक प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था, dichloromethane के 4:1 अनुपात का उपयोग: trifluoroacetic एसिड. जलीय चरण के lyophilization के बाद, हमारे उत्पाद-फली-९८% उपज में एक सफेद पाउडर के रूप में प्राप्त किया गया था । प्रतिक्रिया की प्रगति पतली परत क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से पीछा किया गया था, और प्रत्येक उत्पाद की पहचान 1एच-एनएमआर, 13सी-एनएमआर, और hrms-ईएसआई (तालिका 1) के माध्यम से पुष्टि की गई थी ।

फली अभिकर्मक के प्रमुख लाभों में से एक इसकी प्रतिरूपकता है । chelators की एक किस्म, fluorophores, विषाक्त पदार्थों, या अन्य कारगो यौगिक के लटकन amine के लिए जोड़ा जा सकता है. हाथ में प्रोटोकॉल में, हम सर्वव्यापी चेल्टर dota का उपयोग कर रहे है (1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-टेट्राएसिटिक एसिड) एक प्रतिनिधि पेलोड के रूप में । dota, ज़ाहिर है, ६८Ga, ६४घन, १११में, ९०Y, १७७Lu, और २२५एसी सहित रेडियोमेटिकल्स के लिए एक chelator के रूप में biomolecular रेडियोहारमास्यूटिकल की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है । इस अंत करने के लिए, dota (पी-SCN-बीएन-dota) के एक आइसोथियोसिनेट असर संस्करण नियोजित और सीधा युग्मन शर्तों के माध्यम से फली के लटकन amine के लिए युग्मित किया गया था । परिणामी द्वि क्रियात्मक chelator तो रिवर्स चरण सी18 hplc के माध्यम से शुद्ध और ~ ७५% उपज में पृथक किया गया था । अन्य व्यापारियों के साथ के रूप में, प्रतिक्रिया की प्रगति पतली परत क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से पीछा किया गया था, और उत्पाद की पहचान के माध्यम से पुष्टि की गई थी 1ज-एनएमआर, 13सी-एनएमआर, और hrms-ईएसआई (तालिका 1).

प्रोटोकॉल के अंतिम चरण में, हम एक मॉडल इम्युनोग्लोबुलिन, HER2-लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी trastuzumab को फली-dota के साइट चयनात्मक bioconjugation पर चर्चा की । इस अंत करने के लिए, एंटीबॉडी काज क्षेत्र के डाइसल्फाइड लिंकेज को कम करने वाले एजेंट tcep के साथ चुनिंदा कम कर रहे हैं [tris (2-कार्बोक्जेथायल) फ़ॉस्फिने] । इस कमी कदम के बाद, एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए फली-डोटा के साथ इनसेब्टेड किया जाता है और बाद में आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से शुद्ध किया जाता है । इस मामले में, शुद्ध, dota-असर immunoconjugate में प्राप्त किया गया था ~ ८०% उपज, और माल्डी-tof विश्लेषण लेबलिंग की एक डिग्री का पता चला (DOL) के ~ १.८ dota/ आम तौर पर बोलते हुए, हमने पाया है कि tcep के 10 समकक्ष, फली अभिकर्मक के 10 समकक्ष, और एक 2 एच ऊष्मायन 2 फली/माब (तालिका 2) की एक दोल के साथ एक immunoconjugate उपज के लिए पर्याप्त हैं । यह परिणाम मानव की एक सीमा के पार लगातार रहता है, humanized, और चिमरी IgG1 एंटीबॉडी; हालांकि, एक ही शर्तों के एक डॉल के साथ immunoconjugates का उत्पादन केवल ~ १.५ जब murine IgG1 एंटीबॉडी के साथ काम कर. सभी ने कहा, शोधकर्ताओं को नए एंटीबॉडी और फली-असर कारगो के लिए इन रिएक्शन शर्तों को अनुकूलित करना चाहिए । अंत में, और महत्वपूर्ण बात, अंतिम उत्पाद के लिए संमान के साथ, हम और फिर से reproducibly पाया कि फली आधारित immunoconjugates प्रदर्शन immunoreactivities के बराबर या बेहतर अनुरूप का उपयोग कर बनाया constructs यादृच्छिक या maleimide आधारित संयुग्मन रणनीतियों ।

Figure 1
चित्रा 1: (A) amine-प्रतिक्रियाशील, (B) maleimide-असर, और (C) फली-असर कारगो का उपयोग कर bioconjugations के योजनाबद्ध चित्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक thiol असर biomolecule के माइकल इसके अलावा (हरा) और एक radionuclide असर maleimide (पीला) एक रेडियोलाबेल्ड bioconjugate फार्म करने के लिए, साथ ही अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं कि radionuclide निर्माण अंतर्जात की उपस्थिति में गुजरना कर सकते हैं थिओल-असर अणु (गुलाबी) । RT = कमरे का तापमान । चित्रा adumeau, पी, davydova, एम, zeglis, बी. एम. thiol से अनुमति के साथ reprinted-साइट के निर्माण के लिए सक्रिय स्थिरता के साथ चुनिंदा संशोधित रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेटर के लिए रिएक्टिव बायफंक्टर्स । जैवसंयुग्मी रसायन विज्ञान। 29, 1364-1372 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: फली और एक thiol के बीच प्रतिक्रिया का योजनाबद्ध । चित्रा adumeau, पी, davydova, एम, zeglis, बी. एम. thiol से अनुमति के साथ reprinted-साइट के निर्माण के लिए सक्रिय स्थिरता के साथ चुनिंदा संशोधित रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेटर के लिए रिएक्टिव बायफंक्टर्स । जैवसंयुग्मी रसायन विज्ञान। 29, 1364-1372 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: फली की संरचना (क) और साथ ही (ख) बारबास द्वारा सूचित अभिकर्मक, एट अल.18,19कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: फली के चार कदम संश्लेषण की योजना । चित्रा adumeau, पी, davydova, एम, zeglis, बी. एम. thiol से अनुमति के साथ reprinted-साइट के निर्माण के लिए सक्रिय स्थिरता के साथ चुनिंदा संशोधित रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेटर के लिए रिएक्टिव बायफंक्टर्स । जैवसंयुग्मी रसायन विज्ञान। 29, 1364-1372 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: फली के संश्लेषण की योजना-dota । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: फलियों-dota के साथ trastuzumab के bioconjugation की योजना है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: ८९zr के vivo व्यवहार में की तुलना-huA33 के रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेगेट्स लेबल फली-आधारित (८९zr-dfo-फली-huA33) और maleimide आधारित (८९zr-dfo-mal-huA33) बायोकॉन्जुगेशन रणनीतियों का उपयोग कर बनाया । planar (बाएं) और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (दाएं) athymic नंगा चूहों असर A33 antigen के पीईटी छवियां-SW1222 कोलोरेक्टल कैंसर xenografts (सफेद तीर) ८९zr-dfo-फली-huA33 और ८९ के इंजेक्शन के बाद व्यक्त zr-dfo-mal-huA33 (१४० μci, 60-65 μg) । कोरोनल स्लाइस ट्यूमर के केंद्र को काटना । चित्रा adumeau, पी, davydova, एम, zeglis, बी. एम. thiol से अनुमति के साथ reprinted-साइट के निर्माण के लिए सक्रिय स्थिरता के साथ चुनिंदा संशोधित रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेटर के लिए रिएक्टिव बायफंक्टर्स । जैवसंयुग्मी रसायन विज्ञान। 29, 1364-1372 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 9
चित्रा 9: ८९zr के vivo व्यवहार में की तुलना-huA33 के रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेगेट्स लेबल फली-आधारित (८९zr-dfo-फली-huA33) और maleimide आधारित (८९zr-dfo-mal-huA33) बायोकॉन्जुगेशन रणनीतियों का उपयोग कर बनाया । ८९zr-dfo-फली-huA33 और ८९zr-dfo-mal-huA33 (30 μci, 15-18 μg) के प्रशासन के बाद biodistribution डेटा के लिए athymic नग्न असर A33 antigen-चमड़े के नीचे SW1222 मानव कोलोरेक्टल कैंसर xenografts व्यक्त । पेट, छोटी आंत, और बड़ी आंत के लिए मूल्यों सामग्री शामिल हैं । चित्रा adumeau, पी, davydova, एम, zeglis, बी. एम. thiol से अनुमति के साथ reprinted-साइट के निर्माण के लिए सक्रिय स्थिरता के साथ चुनिंदा संशोधित रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़ेटर के लिए रिएक्टिव बायफंक्टर्स । जैवसंयुग्मी रसायन विज्ञान। 29, 1364-1372 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

यौगिक 1 एच-एनएमआर शिफ्ट 13 सी-एनएमआर शिफ्ट Hrms
1 (५०० MHz, cdcl3) ७.७९ (2h, d, j = ८.५ हर्ट्ज), ६.७२ (2h, d, j = ८.५ हर्ट्ज), ४.०४ (2h, br s), २.७५ (3h, s) (१२५ MHz, cdcl3) १६६.३, १६३.७, १४९.७, १२८.५, ११४.८, ११३.५, १४.८ m/z calcd for [C9h9N3OS + h]+: २०८.०५३९; पाया गया: २०८.०५३९; Δ: ०.० पीपीएम
2 (५०० MHz, CDCl3) ९.६८ (1h, s), ७.९१ (2h, d, J = ९.० हर्ट्ज), ७.७१ (2h, d, J = ८.५ हर्ट्ज), ६.८२ (1h, s), ४.९९ (1h, s), 3.70-3.45 (12h, m), ३.४१ (2h, q, j = ६.० hz), ३.२० (2h, q, j = ६.५ hz), २.७६ (3h, s), २.७१ (2h, m), २.६३ (2h , m), 1.80-1.70 (4h, m), १.४२ (9h, s) (१२५ MHz, CDCl3) १७२.६, १७१.३, १६५.८, १६४.६, १५६.२, १४१.८, १२७.७, ११९.६, ११८.६, ७९.२, ७०.६, ७०.५, ७०.३, ७०.१, ६९.६, ३८.८, ३८.५, ३३.५ m/z calcd for [C28H४३N5O8S + ना]+: ६३२.२७२५; पाया गया: ६३२.२७२२; Δ:-०.४७ पीपीएम
3 (५०० MHz, cdcl3) ९.९९ (1h, s), ७.९८ (2h, d, J = ९.० हर्ट्ज), ७.७५ (2h, d, J = ८.५ हर्ट्ज), ६.८८ (1h, s), ४.९९ (1h, s), 3.66-3.50 (15h, m), ३.४१ (2h, q, j = ६.० हर्ट्ज), ३.२० (2h, q, j = ६.५ हर्ट्ज), २.७१ (2h, m), २.६५ (2h, m) , 1.80-1.70 (4h, m), १.४३ (9h, s) (१२५ MHz, cdcl3) १७२.६, १७१.५, १६६.५, १६१.६, १५६.१, १४३.४, १२८.७, ११९.६, ११६.४, ७९.१, ७०.५, ७०.४, ७०.२, ७०.०, ६९.४, ४३.०, ३८.८, ३८.४, ३३.२, ३१.३ एम जेड/  calcd for [C28H४३N5O10S + h]+: ६४२.२८०३; पाया गया: ६४२.२७९७; Δ:-०.९३ पीपीएम
फली (५०० MHz, d2O) ७.८५ (2h, d, J = ९.० Hz), ७.५५ (2h, D, J = ८.५ हर्ट्ज), 3.60-3.45 (15h, m), ३.४५ (2h, t, j = ६.५ हर्ट्ज), ३.२० (2h, t, j = ६.५ हर्ट्ज), ३.०४ (2h, t, j = ७.० हर्ट्ज), २.६७ (2h, t, j = ६.५ हर्ट्ज), २.५४ (2h , टी, जे = ६.५ हर्ट्ज), १.८७ (2h, क्यूटी, जंमू = ६.५ हर्ट्ज), १.७० (2h, क्यूटी, जंमू = ६.५ हर्ट्ज) (१२५ MHz, D2O) १७४.५, १७३.२, १६६.८, १६१.४, १४२.२, १२८.६, १२०.३, ११६.६, ६९.४, ६९.४, ६९.३, ६९.२, ६८.२, ६८.२, ४२.५, ३७.६, ३६.२, ३१.९, ३०.७, २८.२, २६.४ एम जेड/  calcd for [C23H३५N5O8S + h]+: ५४२.२२७९; पाया गया: ५४२.२२८१; Δ: ०.३७ पीपीएम
फली-DOTA (६०० MHz, dmso-d6) १०.४६ (1h, s), ९.७४ (1h, bs), ८.०४ (2h, d, j = ८.६ हर्ट्ज), ७.९९ (1h, s), ७.९० (1h, t, j = ५.० हर्ट्ज), ७.८६ (2h, d, j = ६.५ हर्ट्ज), ७.४४ (2h, d, j = ७.९ हर्ट्ज), ७.२४ (2h, d, j = ७.१ हर्ट्ज), 4.35-2.41 (45h, m) , ३.७० (3h, s), १.७६ (2h, q, j = ६.३ हर्ट्ज), १.६१ (2h, q, j = ६.५ हर्ट्ज) (१२५ MHz, dmso-d6) १७१.८, १७१.४, १६६.१, १६२.२, १५८.८, १५८.६, १२९.८, १२९.०, १२७.६, १२३.३, ११९.५, ११८.५, ११६.५, ११६.४, ७०.२, ७०.१, ७०.०, ६८.७, ६८.५, ४३.४, ४१.८, ३६.३ एम जेड/  calcd for [C४७H६८N10O16S2+ H]+: १०९३.४३३४; पाया गया: १०९३.४३२७; Δ:-०.६४ पीपीएम

तालिका 1. सिंथेटिक मध्यवर्ती के रूप में अच्छी तरह से फली और फली-dota के लिए लक्षण वर्णन डेटा ।

एंटीबॉडी प्रकार अचर क्षेत्र फली का अनुपात: mab
मानव प्लाज्मा आईआईजी मानव मानव igg २.१ ± ०.१
Trastuzumab Humanized मानव IgG1 २.० ± ०.१
huA33 Humanized मानव IgG1 २.१ ± ०.१
सीटुक्जीमैब चिमेरिक मानव IgG1 २.२ ± ०.१
AR ९.६ मूर्तीने मुरीन IgG1 १.४ ± ०.१
माउस प्लाज्मा आईआईजी मूर्तीने मुरीन igg १.५ ± ०.१

तालिका 2. फली-बेयरिंग फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मन के बाद विभिन्न एंटीबॉडी के लेबलिंग की डिग्री । मान मानक विचलन दिखाए जाते हैं । तालिका adumeau, पी, davydova, एम, zeglis, बी. एम. thiol से अनुमति के साथ reprinted-साइट के निर्माण के लिए सक्रिय स्थिरता के साथ चुनिंदा संशोधित रेडियो immunoconjugates जैवसंयुग्मी रसायन विज्ञान। 29, 1364-1372 (२०१८). कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी ।

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Discussion

इस रिपोर्ट में, हमने रेडियोलाब्लिंग के लिए या vivo प्रयोग में किसी प्रोटोकॉल को शामिल नहीं करने के लिए चुना है । हमारे कारण स्पष्ट हैं । पूर्व के संबंध में, एक फली के रेडियोलाबलिंग-immunoconjugate आधारित एक immunoconjugate अन्य bioconjugation रणनीतियों का उपयोग कर संश्लेषित से बिल्कुल अलग नहीं है, और इन प्रक्रियाओं को व्यापक रूप से कहीं और की समीक्षा की गई है2 . उत्तरार्द्ध के संबंध में, विवो प्रयोगों (यानी, माउस मॉडल, खुराक, आदि) में पूर्व नैदानिक के विशेष रूप से दोनों आवेदन और एंटीबॉडी/प्रतिजन प्रणाली के अनुसार भिन्न हो सकते हैं ।

८९zr के साथ हमारी पिछली जांच-huA33 के वेरिएंट लेबल फली के फायदे का एक संमोहक उदाहरण प्रदान bioconjugations आधारित । HuA33 एक humanized IgG1 एंटीबॉडी है कि A33 antigen, एक ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन कोलोरेक्टल कैंसर23,24के > 95% पर व्यक्त लक्ष्य है । हमारी पिछली पांडुलिपि22में, हम ८९zr-dfo-huA33 रेडियोइम्यूनोकोजुगेट दोनों फली का उपयोग कर संश्लेषण की रिपोर्ट-और maleimide आधारित bioconjugation रणनीतियों. दो radiolabeled एंटीबॉडी- ८९zr-dfo-फली-huA33 और ८९zr-dfo-mal-huA33-लगभग समान उपज, शुद्धता, विशिष्टता गतिविधि, और immunoreactivity में उत्पादित किया गया । गंभीर रूप से, तथापि, दो रेडियोइम्यूनोकोज्गेट्स मानव सीरम में नाटकीय रूप से अलग stabilities प्रदर्शन: ३७ डिग्री सेल्सियस पर सात दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, ८९zr-dfo-फली-huA33 बनी ८६ ± 1% बरकरार है, जबकि इसके maleimide आधारित चचेरे भाई केवल ६१ ± था 5% बरकरार. vivo में पीईटी इमेजिंग और biodistribution प्रयोगों में athymic न्यूड चूहों असर A33 antigen-व्यक्त SW1222 मानव कोलोरेक्टल कैंसर xenografts में स्टार्क के मतभेद का पता चला दो रेडियोइम्यूनोकॉन्ज़गेट्स के vivo व्यवहार में (चित्र 8 और चित्रा 9). दोनों ८९zr-dfo-फली-huA33 और ८९zr-dfo-मल-huA33 ट्यूमर ऊतक में उच्च गतिविधि सांद्रता का उत्पादन: ५६.४ ± 6.9% आईडी/जी और ४९.६ ± 9.3% आईडी/जी, क्रमशः, ४८ एच प्रशासन के बाद । हालांकि, maleimide आधारित रेडियोइम्यूनोकोज्गेट फली-आधारित एजेंट की तुलना में स्वस्थ ऊतकों में काफी अधिक गतिविधि सांद्रता का उत्पादन किया । उदाहरण के लिए, ८९zr-dfo-mal-huA33 उत्पादित गतिविधि सांद्रता की ३.१ ± ०.५, २.७ ± ०.४, और १२.२ ± ०.४% आईडी/g गुर्दे, जिगर, और अस्थि में क्रमशः, १२० एच पोस्ट-इंजेक्शन, मूल्यों में जो नाटकीय रूप से गतिविधि सांद्रता से अधिक एक ही ऊतकों में ८९zr-dfo-फली-huA33 द्वारा उत्पादित (१.४ ± ०.१, १.२ ± ०.३, और ४.३ ± ०.६% आईडी/ दरअसल, ८९zr-dfo-फली-huA33 का उत्पादन कम गतिविधि सांद्रता में सभी गैर-लक्ष्य ऊतकों (बड़ी आंत को छोड़कर) १२० एच पोस्ट-इंजेक्शन की तुलना में ८९zr-dfo-mal-huA33. एक परिणाम के रूप में, ८९zr-dfo-फली-huA33 के लिए ट्यूमर-अंग गतिविधि एकाग्रता अनुपात आम तौर पर ८९zr-dfo-mal-huA33 के उन लोगों के लिए बेहतर कर रहे हैं; विशेष रूप से, ट्यूमर-टू-लिवर, ट्यूमर-टू-प्लीहा, ट्यूमर-टू-किडनी, और ट्यूमर-टू-बोन गतिविधि एकाग्रता अनुपात अपने maleimide व्युत्पन्न चचेरे भाई की तुलना में फली-आधारित इम्यूनोकॉन्जुगेट के लिए लगभग दोगुना है । यह देखते हुए कि दो रेडियोइम्यूनोकॉन्ज्गेट्स के बीच मुख्य अंतर chelator के bioconjugation संभाल रहा था, फली की वृद्धि की स्थिरता-thiol लिंकेज लगभग निश्चित रूप से इस vivo प्रदर्शन में सुधार के लिए जिंमेदार है ।

एक व्यापक विचार ले रही है, गैर-साइट एंटीबॉडी के भीतर lysines के लिए जांच के चयनात्मक bioconjugation बेशक है एक सीधा और प्रतिपिंड के संशोधन के लिए सतही दृष्टिकोण । हालांकि, इम्यूनोग्लोबुलिन की संरचना भर में वितरित कई lysines की उपस्थिति का मतलब है कि यह असंभव है पर नियंत्रण लागू करने के लिए सटीक साइट या डिग्री के bioconjugation2. एक परिणाम के रूप में, इस यादृच्छिक रणनीति अक्सर खराब परिभाषित और अत्यधिक विषम immunoconjugates कि कम immunoreactivity प्रदर्शन अगर ligations antigen-बाध्यकारी डोमेन3के भीतर हो सकता है पैदा करता है । जैव संयुग्मन के लिए साइट-चयनात्मक दृष्टिकोणों के लाभों को रेडियोइम्यूनोकॉंजूगेट्स और एंटीबॉडी-ड्रग कांजूगेट्स8,14,25,26, के लिए बार-बार सचित्र किया गया है । 27,28,29,30. संक्षेप में, न केवल साइट-चयनात्मक जैव संयुग्मन रणनीतियों पारंपरिक तरीकों से अधिक अच्छी तरह से परिभाषित और समरूप immunoconjugates का उत्पादन, वे भी इमेजिंग एजेंटों, रेडियोइम्यूनोथेरापीटिक्स बनाने, और vivo प्रदर्शन में सुधार के साथ adcs. फिर भी जहां फली आधारित ligations अंय साइट चयनात्मक संशोधन रणनीतियों की तुलना में खड़े हो? आम तौर पर, साइट के लिए दृष्टिकोण-एंटीबॉडी के चयनात्मक संशोधन चार श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: (1) सिस्टीन अवशेषों को ligations, (2) भारी श्रृंखला glycans के हेरफेर, (3) chemoenzymatic परिवर्तनों, और (4) का उपयोग जेनेटिक इंजीनियरिंग के4,5. बेशक, इस वर्गीकरण प्रणाली सही नहीं है, और कुछ दृष्टिकोण (जैसे, एंजाइमों के साथ भारी श्रृंखला glycans के संशोधन) अनिवार्य रूप से दो श्रेणियों के लिए अर्हता प्राप्त । प्रत्येक रणनीति के अपने फायदे और नुकसान है । जेनेटिक इंजीनियरिंग आधारित दृष्टिकोण संयुग्मन की साइट पर अति सुंदर नियंत्रण प्रदान करते हैं, फिर भी वे जटिल और महंगी31,३२,३३हैं । भारी श्रृंखला glycans करने के लिए ऑक्सीडेटिव कपलिंग सस्ती और सरल कर रहे हैं, अभी तक वे इम्युनोग्लोबुलिन३४,३५,३६,३७ की संरचनात्मक अखंडता के लिए ऑक्सीडेटिव नुकसान का खतरा ,३८.

thiol आधारित bioconjugations के मुख्य लाभ-फली शामिल है-उनकी सादगी और प्रतिरूपकता है । उनके प्रमुख सीमा, दूसरी ओर, एक एंटीबॉडी, एक विशेषता है जो विकार की साइट और एंटीबॉडी प्रति संशोधनों की संख्या दोनों पर नियंत्रण की डिग्री कम कर देता है के भीतर कई thiols की उपस्थिति से उपजी है । इस अर्थ में, thiol आधारित ligations और एंटीबॉडी कि आनुवंशिक रूप से मुक्त सिस्टीन अवशेषों के अधिकारी के लिए इंजीनियर किया गया है का संयोजन एक विशेष रूप से आकर्षक दृष्टिकोण है । जैसा कि हम उल्लेख किया है, maleimide आधारित थिओल ligations की एक और सीमा, vivo में रेट्रो माइकल परिवर्धन करने के लिए succinimidyl थायोएथर बांड की संवेदनशीलता है । लेकिन गंभीर रूप से, फली का उपयोग इस समस्या को दूर करता है ।

इससे पहले कि हम निष्कर्ष निकालते हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फली प्रौद्योगिकी की आपात प्रकृति अपनी बाधाओं का स्वयं का सेट बना सकती है । उदाहरण के लिए, कोई फली-असर बायफंक्शनल chelators (वर्तमान में) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और कोई नैदानिक औषधि, विष विज्ञान, या फली की immunogenicity-आधारित immunoconjugates को संबोधित डेटा नहीं है । हालांकि, हम मानते है कि फली आधारित bioconjugations को मौलिक तरीके immunoconjugates दोनों प्रयोगशाला और क्लिनिक में संश्लेषित कर रहे है बदलने की क्षमता है । वर्तमान में, हम केवल परमाणु इमेजिंग और रेडियोइम्यूनोथेरेपी के लिए radioimmunoconjugates के विकास के लिए इस रासायनिक प्रौद्योगिकी लागू किया है, हालांकि एंटीबॉडी के निर्माण के लिए इस दृष्टिकोण की उपयोगिता में जांच-दवा conjugates और फिलहाल अन्य बायोअणु दवाइयां चल रही हैं । अंत में, हम ईमानदारी से आशा है कि इस प्रोटोकॉल और विशेष रूप से सीधी और सरल रसायन है कि हम विकसित किया है-मदद sulfhydryl आधारित conjugations के लिए phenyloxadiazolyl मिथाइल sulfones के उपयोग को बढ़ावा देने और से क्षेत्र में एक बदलाव प्रेरणा अधिक स्थिर और अधिक विश्वसनीय विकल्प के लिए maleimides ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने सहायक बातचीत के लिए डॉ साईं किरण शर्मा का शुक्रिया अदा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol Sigma-Aldrich 675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube Eppendorf 925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube Fisherbrand 05-408-129
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore EN300000141G
Cyclohexane Fisher Scientific C556-4
Dichloromethane Fisher Scientific AC383780010
Diisopropylethylamine MP Biomedicals, LLC 150915
Dimethylsulfoxide Fisher Scientific 31-727-5100ML
Ethyl Acetate Fisher Scientific E145 4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566-100G
Magnesium Sulfate Acros Organics 413485000
m-chloroperbenzoic acid Sigma-Aldrich 273031
Methanol Fisher Scientific A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine Sigma-Aldrich 671401 Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 3450
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P5493 10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
TCEP ThermoFischer Scientific 20490
Triethylamine Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid Fisher Scientific A116-50

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References

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Davydova, M., Dewaele Le Roi, G.,… More

Davydova, M., Dewaele Le Roi, G., Adumeau, P., Zeglis, B. M. Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates. J. Vis. Exp. (145), e59063, doi:10.3791/59063 (2019).

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