Summary
I detta protokoll, kommer vi att beskriva syntesen av BALJOR, phenyoxadiazolyl metyl sulfon-baserade reagens för webbplats-selektiv fastsättning av laster till Tioler av biomolekyler, särskilt antikroppar. Dessutom kommer vi att beskriva syntes och karakterisering av en SKIDA räntebärande bifunktionell kelator och dess konjugering till en modell antikropp.
Abstract
Maleimide-bärande bifunktionell sonder har använts i decennier för webbplats-selektiv modifiering av Tioler i biomolekyler, särskilt antikroppar. Maleimide-baserade konjugat visas ännu begränsad stabilitet i vivo eftersom succinimidyl thioether kopplingen kan genomgå en retro-Michael reaktion. Detta kan naturligtvis leda till utgivningen av radioaktiva nyttolasten eller dess utbyte med thiol-bärande biomolekyler i omlopp. Båda dessa processer kan producera förhöjda aktivitetskoncentrationer i friska organ samt minskad aktivitetskoncentrationer i målvävnad, vilket resulterar i minskad imaging kontrast och lägre terapeutiska nyckeltal. 2018, rapporterade vi att skapa en modulär, stabil och lättillgängligt phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens — dubbade 'SKIDA' — som en plattform för thiol-baserade bioconjugations. Vi har tydligt visat att SKIDA-baserade webbplats-selektiv bioconjugations reproducibly och kraftfullt skapar homogena, väldefinierade, mycket immunreaktiva och mycket stabil radioimmunoconjugates. Prekliniska experiment i murina modeller av kolorektal cancer har dessutom visat att dessa webbplats-selektivt märkt radioimmunoconjugates utställning vida överlägsen Invivo prestanda jämfört med radiomärkt antikroppar syntetiseras via maleimide-baserade konjugationer. I detta protokoll, kommer vi att beskriva fyra steg syntesen av BALJOR, skapandet av en bifunktionell PODS-bärande variant av den allestädes närvarande kelator DOTA (PODS-DOTA) och konjugationen av SKIDA-DOTA till den HER2-targeting antikropp trastuzumab.
Introduction
Radiofarmaceutisk kemister har länge utnyttjas den selektivitet och specificitet av antikroppar för biomarkörer för sjukdom för både kärn avbildning och riktad strålbehandling1. Särklass vanligaste förhållningssätt till den radiolabeling av antikroppar bygger på urskillningslösa tillbehöret av radiomärkt prosthetic grupper eller radiometal kelater till aminosyror — oftast lysines — inom strukturen för immunglobulin ( Figur 1A)2. Denna strategi är säkert effektiv, kan dess slumpmässigt, icke-plats-specifika natur skapa problem. Specifikt, traditionella bioconjugation metoder producera dåligt definierat och heterogena immunoconjugates består av blandningar av tusentals olika lägesisomererna, alla med sin egen uppsättning biologiska och farmakologiska egenskaper3. Slumpmässiga bioconjugation kan dessutom hindra immunoreaktivitet antikroppar om lasten läggs till den immunglobulin antigen-bindande domäner.
Genom åren har en mängd platsspecifika och webbplats-selektiv bioconjugation strategier utvecklats för att hantera dessa problem4,5. Den vanligaste av dessa metoder bygger på ligering av maleimide-bärande sonder till sulfhydryl grupper av cysteines (figur 1B). IgG1 antikroppar innehåller naturligt 4 mellan kedjan disulfidbryggor, kopplingar som selektivt kan reduceras för att ge gratis Tioler kan genomgå Michael tillägg reaktioner med maleimides att bilda succinimidyl thioether obligationer. Tioler och maleimides är verkligen en förbättring jämfört med traditionella metoder, och ett brett utbud av maleimide-bärande synthons och bifunktionell kelater är tillgängliga. Det är dock viktigt att notera att denna metod har allvarliga begränsningar samt. Maleimide-baserade immunoconjugates uppvisar begränsad stabilitet i vivo eftersom thioether kopplingen kan genomgå en retro-Michael reaktion (figur 2)6,7,8,9, 10. detta, naturligtvis, kan leda till utsläpp av radioaktiva nyttolasten eller dess utbyte med thiol-bärande biomolekyler i omlopp (glutation eller serum albumin). Båda dessa processer kan öka aktivitetskoncentrationer i friska organ samt minska aktivitetskoncentrationer i målvävnad, vilket resulterar i minskad imaging kontrast och lägre terapeutiska nyckeltal. Flera alternativa thiol-reaktiva reagenser har utvecklats i ett försök att kringgå dessa frågor, inklusive tosylates, bromo - och Jodo-Acetexs, och vinyl sulfoner11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. alla dessa metoder har dock begränsningar som har hindrat deras utbredd tillämpning.
Ungefär fem år sedan, börjat laboratoriet för den sena Carlos Barbas III vid Scripps Research Institute använda sig av phenyloxadiazolyl metyl sulfoner som reagens för selektiv bildandet av mycket stabila kopplingar med Tioler (figur 1 c och figur 3) 18 , 19. författarna sysselsatt en phenyloxadiazolyl metyl sulfon-bärande variant av fluorescein att ändra flera antikroppar konstruerade för att innehålla rester av gratis Cystein, i slutändan producerar immunoconjugates med högre stabilitet än motsvarande konstruktioner som skapats med maleimide-baserade sonder. När han ser denna lovande arbete, var vi lite förvånad över att denna teknik hade endast använts knappt i radiokemi och hade ännu inte använts alls i syntesen av bifunktionell kelater eller radioimmunoconjugates20,21 . Denna brist på tillämpningar, men snart började mer meningsfullt: flera försök till koppleri reagensen från Sigma-Aldrich resulterade i mottagandet av komplexa blandningar av nedbrytningsprodukter med < 15% av den önskvärda föreningen. Dessutom syntetisera rapporterade reagensen oss var inte ett realistiskt alternativ heller, som den publicerade syntesväg är ganska ohanterlig och kräver avancerad organisk kemi utrustning som de flesta radiokemi och molekylär avbildning laboratorier — inklusive vår — helt enkelt inte besitter.
Svar på dessa hinder anges vi att skapa en lättillgänglig och mycket stabil phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens som kan erhållas via en robust och rimligen lättköpt syntesväg. Tidigare i år, rapporterade vi att skapa en modulär, stabil och lättillgängligt phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens — dubbade 'SKIDA' — som en plattform för thiol-baserade bioconjugations (figur 1 c och figur 3)22. Den viktigaste skillnaden mellan SKIDA och reagens rapporteras av Barbas, et al. är att den förstnämnda sysselsätter en anilin ring bifogas den phenyloxadiazolyl metyl sulfon biexponentiellt, medan det sistnämnda erbjuder en fenol i samma position (figur 4). Ändringen underlättar en mer enkel och lättåtkomlig syntesväg som — om vår erfarenhet med kommersiellt tillgängliga föreningen är symboliska — en stabilare slutliga reagens. I detta arbete, vi också syntetiseras ett par BALJOR räntebärande bifunktionell kelater — PODS-DFO och PODS-CHX-A''-DTPA — att underlätta skapandet av 89Zr- och 177Lu-märkt radioimmunoconjugates, respektive. Som vi kommer att diskutera, har vi visat att SKIDA-baserade webbplats-selektiv bioconjugations reproducibly och kraftfullt skapar homogena, väldefinierade, mycket immunreaktiva och mycket stabil radioimmunoconjugates. Prekliniska experiment i murina modeller av kolorektal cancer har dessutom visat att dessa webbplats-selektivt märkt radioimmunoconjugates uppvisar överlägsen Invivo prestanda jämfört med radiomärkt antikroppar syntetiseras via maleimide-baserade konjugationer.
Övergripande målet med detta arbete är att underlätta skapandet av väldefinierade, homogent, mycket stabil och mycket immunreaktiva immunoconjugates för in vitro- och in vivo-program. Den syntetiska metoden är enkel nog att utföras i nästan alla laboratorium och överordnade PODS reagens kan ändras med en uppsjö av olika kelatorer, fluorophores eller laster. I detta protokoll och medföljande videon, kommer vi att beskriva enkla, fyra steg syntesen av SKIDA (figur 5). skapandet av en SKIDA räntebärande variant av DOTA, en allmänt använd kelator för samordning av 64Cu, 68Ga, 111år, 177Lu och 225Ac (figur 6). och bioconjugation av SKIDA-DOTA till en modell antikropp, den HER2-targeting IgG1 trastuzumab (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. syntes av 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Obs: På grund av ljuskänslighet av föreningen, hålla alla reaktioner i folie-täckt fartyg.
- I en 10 mL runda botten mätkolv, Lös 100 mg (0.517 mmol, 1 motsvarande) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL metanol.
- Till denna lösning, tillsätt 360 μL av diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 motsvarigheter; vattenfri) och små magnetiska rör bar. Täcka kolven med en gummipropp och rör ner lösningen i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Använda en 1 mL spruta av glas, peta ett hål genom gummiproppen och snabbt lägga till 32 μL (0.517 mmol, 1 motsvarande) av Jodmetan i denna blandning. Låt blandningen reagera i 45 minuter i rumstemperatur.
Obs: På grund av de potentiella skadliga effekterna av Jodmetan, denna reaktion bör göras i dragskåp kemiska. - Inställt 40 ° C vattenbad i en rotationsindunstare och långsamt minska trycket att ta bort lösningsmedlet att ha råd med en vit solid.
- Lös upp fast i 3 mL etylacetat och tvätta minst tre gånger med en 5 mL lösning av 0,1 M natriumkarbonat med hjälp av en separatory tratt.
Obs: Regelbundet ta plats-tester av vattenfasen under en UV-lampa; När ingenting ses under lampan, kan du stoppa tvättarna. - Samla den organiska fasen i en separatory tratt och tvätta med vatten tills pH-värdet i vattenfasen når 6,8-7,0 (med pH-papper).
- Samla den organiska fasen och lägga till magnesium sulfate att avlägsna eventuella spår av vatten.
Obs: Magnesiumsulfat bör läggas med en liten spatel, varefter lösningen ska snurras. Om fina partiklar av torkmedel ses fortfarande, är lösningen torr. Om så inte är fallet, lägga till små mängder av magnesiumsulfat tills fina partiklar kan ses. - Filtrera blandningen med en medellång fritta eller filterpapper.
- Förångas flyktiga ämnen med en roterande indunstare, en process som ska producera önskad produkt som vita nålar.
2. syntesen av tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] karbamat (2)
Obs: På grund av ljuskänslighet av föreningen, hålla alla reaktioner i folie-täckt fartyg.
- I en 25 mL runda botten mätkolv, lös 387 mg (0.92 mmol, 1,0 motsvarande) NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine i 10 mL diklormetan.
- Till denna lösning, tillsätt 480 μL (2,76 mmol, 3 medel) av DIPEA, 264 mg (1,38 mmol; 1,5 medel) N-etyl - N′-[3-(Dimetylamin) propyl] carbodiimide hydroklorid (EDCI), och 200 mg (0.97 mmol, 1.1 medel) 1. Förslut kärlet med en propp av glas och låt reaktionen rör i 5 dagar vid rumstemperatur.
Obs: Var uppmärksam på avdunstning av diklormetan. Om det behövs, lägga till fler hela veckan. - Tvätta blandningen i en separatory tratt med en lösning av 1 M saltsyra (3 x 5 mL).
- Samla den organiska fasen och fortsätta att tvätta den i en separatory tratt, först med en lösning av 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) och sedan med vatten (3 x 5 mL).
- Samla den organiska fasen och lägga till magnesium sulfate att avlägsna eventuella spår av vatten (se steg 1,7). Filtrera blandningen med en medellång fritta eller filterpapper.
- Skruva loss de flyktiga lösningsmedel under reducerat tryck att ha råd med en benvit fast med rotationsindunstare.
- Lös åter upp denna fast i 10 mL etylacetat och fällningen produkten via gradvis (t.ex. 2 mL i taget) tillägg av 30 mL med cyklohexan.
- Filtrera lösningen med filterpapper eller en medellång fritta hämta produkten som ett vitt pulver.
3. syntesen av tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] karbamat (3)
Obs: På grund av ljuskänslighet av föreningen, hålla alla reaktioner i folie-täckt fartyg.
- I en 10 mL runda-botten mätkolv, lös 30 mg (0,05 mmol; 1 motsvarande) 2 4 ml diklormetan.
- Långsamt lägga till i 49 mg (0,2 mmol; 4 medel) 70% m-chloroperbenzoic syra i denna blandning och täcka reaktionskärlet med en propp av glas. Rör om lösningen över natten i rumstemperatur, vilket i slutändan ger en gul blandning.
- Tvätta gul blandningen i en separatory tratt, först med en 0,1 M lösning av NaOH (3 x 5 mL) och sedan med vatten (3 x 5 mL).
- Torka den organiska fasen med magnesiumsulfat och filtrera blandningen med en medellång fritta eller filterpapper.
- Loss med en rotationsindunstare lösningsmedlen under reducerat tryck att få produkten som en blek solid.
4. syntesen av N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] fenyl} succinamide (SKIDA)
- I en 25 mL runda botten mätkolv, lös 30 mg 3 i 2,0 mL diklormetan.
- Tillsätt 400 μL av trifluorättiksyra och tillslut kolven med en propp av glas.
- Rör reaktionsblandningen i rumstemperatur i 3 timmar.
- Skruva loss flyktiga ämnen under minskat tryck i rumstemperatur, lämna en fet rester med en roterande indunstare.
- Lös upp det fet restmaterialet i 7 mL vatten och använder en separatory tratt, tvätta med etylacetat (3 x 4 mL). Hålla vattenskiktet.
- Lyophilize vattenskiktet att ha råd med PODS som ett vitt pulver.
Obs: Molar absorption koefficienterna för SKIDA vid 280 och 298 nm är 9900 och 12.400 cm-1M-1, respektive.
5. syntesen av SKIDA-DOTA
- Lös 10 mg av SKIDA i 300 μL av dimetyl sulfoxid (0,018 mmol; 1 motsvarande) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, och tillsätt 26 μL av N, N-diisopropylethylamine (0,15 mmol; 8 medel).
- Lös 15,2 mg DOTA-Bn-NCS (0,02 mmol; 1.2 medel) i 100 μL av dimetylsulfoxid och kombinera denna lösning med lösningen från steg 5.1. Försegla mikrocentrifug röret.
- Låt reaktionen på Inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Rena produkten med omvänd fas C18 HPLC kromatografi att ta bort eventuella oreagerad DOTA-Bn-NCS.
Obs: Retentionstiderna är naturligtvis starkt beroende av HPLC-utrustningen av varje laboratorium (pumpar, kolumner, slangar, etc.), och lämpliga kontroller bör köras före rening. Dock att presentera ett exempel, om en gradient av 5:95 MeCN/H2O (båda med 0,1% TFA) till 70:30 MeCN/H2O (båda med 0,1% TFA) under 30 min, en semi preparativ 19 x 250 mm C18 kolumn och en flödeshastighet av 6 mL/min används , SKIDA, p-SCN-Bn-DOTA och PODS-DOTA kommer ha retentionstiderna för runt 14,4 och 18,8 19,6 min, respektive. Alla tre föreningar kan övervakas vid 254 nm.
6. bioconjugation av SKIDA-DOTA till trastuzumab
Obs: I detta steg måste vi började med 16,4 mg/mL stamlösning av trastuzumab.
- I en låg protein bindande 1,5 mL mikrocentrifug rör, späd 61 μL av trastuzumab stamlösning (1 mg; 6,67 nmol, 1 motsvarande) med 859 μL av fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4).
- Till denna blandning, tillsätt 6,7 μL av en nybryggd 10 mM-lösning av TCEP i H2O (66,7 nmol, 10 medel).
- Förbereda en 1 mg/mL lösning av SKIDA-DOTA i DMSO och Lägg till 73 μL av denna SKIDA-DOTA lösning reaktionsblandningen (66.67 nmol, 10 medel).
- Försegla mikrocentrifug röret och inkubera lösningen i 2 timmar i rumstemperatur.
- Efter 2 timmar, rena den immunoconjugate använder en färdigförpackade disponibla utslagning avsaltning i kolumnen storlek.
- Först, temperera kolumnen storlek utslagning som beskrivs av leverantören att ta bort några konserveringsmedel som finns i kolumnen under lagring. En typisk förfarandet innebär att tvätta kolonnen 5 gånger med en volym av PBS som motsvarar volymen av kolumnen: 5 x 2,5 mL PBS.
- Lägg sedan till reaktionsblandningen kolumnen storlek uteslutning att notera volymen av reaktionsblandningen.
- När reaktionsblandningen har angett kolumnen, tillsätt en lämplig mängd PBS att föra den totala volymen av lösningen tillsätts kolumnen upp till 2,5 mL. Till exempel om konjugation reaktionen resulterade i en total volym på 1,3 mL, skulle 1,2 mL av ytterligare PBS behöva läggas till i kolumnen.
- Slutligen, samla produkten med 2 mL PBS som eluenten.
- Koncentrera sig den slutliga immunoconjugate med centrifugal filtrering enheter med en 50 kDa molekylvikt cut-off.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fyra första stegen i detta protokoll — syntesen av SKIDA — har utformats för att vara robust och tillförlitlig. Den deprotonation och substitution av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol att bilda den önska thioether-produkten ger thioether i > 99% avkastning efter bara 45 minuter. Nästa, uppnåddes ligering mellan 1 och N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine via en standard peptid koppling förfarande, vilket resulterar i samlingen av produkten (2) i 55% avkastning. Sedan, oxidation av 2 utfördes med hjälp av m-klorperoxibensoesyra syra, en allmänt använda oxidant. Efter tvätt steg, 3 erhölls som en blek solid i ~ 90% avkastning. Slutligen gjordes avlägsnande av tert-butyloxycarbonyl skydda gruppen från 3 enligt vanliga rutiner, med förhållandet 4:1 dichloromethane:trifluoroacetic syra. Efter att frystorka den av vattenfasen, vår produkt — PODS — erhölls som ett vitt pulver i 98% avkastning. Utvecklingen av reaktionen följdes via tunnskiktskromatografi, och varje läkemedlets identitet bekräftades via 1H-NMR, 13C-NMR och HRMS-ESI (tabell 1).
En av de främsta fördelarna med PODS reagens är dess modularitet. En mängd kelater, fluorophores, gifter eller andra laster kan bifogas den förenings hänge amine. I protokollet till hands använder vi den allestädes närvarande kelator DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraacetic acid) som en representativ nyttolast. DOTA, naturligtvis, har använts i en lång rad biomolekylär radiofarmaka som en kelator för radiometals inklusive 68Ga, 64Cu, 111i, 90Y, 177Lu, och 225Ac. I detta syfte en Isotiocyanat-bärande variant av DOTA (p-SCN-Bn-DOTA) anställdes och kopplat till den hängande aminen baljor via enkel koppling villkor. Den resulterande bifunktionell kelator var sedan renas via omvänd fas C18 HPLC och isolerade i ~ 75% avkastning. Som med andra prekursorer, utvecklingen av reaktionen följdes via tunnskiktskromatografi, och produktens identitet bekräftades via 1H-NMR, 13C-NMR och HRMS-ESI (tabell 1).
I det sista steget i protokollet diskuterar vi den plats-selektiv bioconjugation av SKIDA-DOTA en modell immunglobulin, den HER2-targeting antikropp trastuzumab. I detta syfte disulfid kopplingarna av antikroppens gångjärnet regionen selektivt minskas med reducerande agent TCEP [tris(2-carboxyethyl) fosfin]. Efter denna minskning steg, är antikroppen inkuberas med PODS-DOTA för 2 h vid rumstemperatur och därefter renas via storlek utslagning kromatografi. I det här fallet den renade, DOTA-bärande immunoconjugate erhölls i ~ 80% avkastning och MALDI-ToF-analysen visade en viss märkning (DOL) av ~1.8 DOTA/mAb. Generellt sett har vi funnit att 10 medel av TCEP, 10 medel av SKIDA reagens och en 2 h inkubation är tillräcklig för att ge en immunoconjugate med en DOL av 2 BALJOR/mAb (tabell 2). Detta resultat fortfarande konsekvent över en rad mänskliga, humaniserad och chimära IgG1 antikroppar. dock ge samma villkor immunoconjugates med en DOL av endast ~1.5 när du arbetar med murin IgG1 antikroppar. Allt detta sagt, forskare bör optimera dessa reaktion villkor för nya antikroppar och PODS-bärande last. Slutligen, och viktigast, med avseende på den slutliga produkten, har vi upprepade gånger och reproducibly funnit att SKIDA-baserade immunoconjugates uppvisar immunoreactivities lika med eller bättre än liknande konstruktioner skapas med slumpmässiga eller maleimide-baserade Konjugation strategier.
Figur 1: Schematisk illustration av bioconjugations med (A) amine-reaktivt, (B) maleimide-bärande, och (C) SKIDA-bärande last. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Michael tillägg av en tiol-bärande biomolecule (grön) och en radionuklid-bärande maleimide (gul) att bilda en radiomärkt konjugationens, samt de ytterligare reaktioner som den radiomärkt konstruktionen kan genomgå i närvaro av endogen thiol-bärande molekyler (rosa). RT = rumstemperatur. Figur återges med tillstånd från Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktivt bifunktionell kelater för de skapandet av webbplatsen-selektivt modifierad Radioimmunoconjugates med förbättrad stabilitet. Konjugationens kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk bild av reaktionen mellan SKIDA och en tiol. Figur återges med tillstånd från Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktivt bifunktionell kelater för de skapandet av webbplatsen-selektivt modifierad Radioimmunoconjugates med förbättrad stabilitet. Konjugationens kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Strukturen för PODS (A) samt (B) reagens rapporteras av Barbas, et al.18,19vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Systematiken i fyra steg syntesen av SKIDA. Figur återges med tillstånd från Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktivt bifunktionell kelater för de skapandet av webbplatsen-selektivt modifierad Radioimmunoconjugates med förbättrad stabilitet. Konjugationens kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Systematiken i syntesen av SKIDA-DOTA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Ordningen av bioconjugation av trastuzumab med PODS-DOTA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Jämförelse av beteendet i vivo med 89Zr-märkt radioimmunoconjugates av huA33 som skapats med PODS-baserade (89Zr-DFO-PODS-huA33) och maleimide-baserade (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategier. Planar (vänster) och maximal intensitet projektion (höger) PET-bilder av atymiska naken möss med A33 antigen-uttryckande SW1222 kolorektal cancer xenograft (vit pil) efter injektionen med 89Zr-DFO-PODS-huA33 och 89 ZR-DFO-mal-huA33 (140 µCi, 60-65 µg). Koronalt skivor skär mitten av tumörer. Figur återges med tillstånd från Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktivt bifunktionell kelater för de skapandet av webbplatsen-selektivt modifierad Radioimmunoconjugates med förbättrad stabilitet. Konjugationens kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Jämförelse av beteendet i vivo med 89Zr-märkt radioimmunoconjugates av huA33 som skapats med PODS-baserade (89Zr-DFO-PODS-huA33) och maleimide-baserade (89Zr-DFO-mal-huA33) bioconjugation strategier. Biodistribution data efter administrering av 89Zr-DFO-PODS-huA33 och 89Zr-DFO-mal-huA33 (30 µCi, 15-18 µg) till atymiska naken möss med A33 antigen-uttryckande subkutan SW1222 mänskliga kolorektal cancer xenograft. Värdena för mage, tunntarmen och tjocktarmen innehålla innehåll. Figur återges med tillstånd från Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktivt bifunktionell kelater för de skapandet av webbplatsen-selektivt modifierad Radioimmunoconjugates med förbättrad stabilitet. Konjugationens kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förening | 1 H-NMR SKIFT | 13 C-NMR SKIFT | HRMS | |||
| 1 | (500 MHz, CDCl3) 7,79 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,72 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 4,04 (2 H, br s), 2,75 (3 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 166.3 163,7, 149,7, 128,5, 114,8, 113,5, 14,8 | m/z Beräknat årligt belopp för [C9H9N3OS + H]+: 208.0539; hittade: 208.0539; Δ: 0,0 ppm | |||
| 2 | (500 MHz, CDCl3) 9,68 (1H, s), 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,71 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6.82 (1H, s), 4,99 (1H, s) 3,45 3,70 (12H, m), 3,41 (2H, q, J = 6,0 Hz), 3.20 (2H, q, J = 6,5 Hz), 2,76 (3H, s), 2,71 (2H, m), 2,63 (2H m), 1,80-1,70 (4 H, m), 1,42 (9 H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172,6, 171,3, 165,8, 164,6, 156,2, 141,8, 127,7, 119,6, 118.6, 79,2, 70,6, 70,5, 70,3, 70,1, 69,6, 38,8, 38,5, 33,5, 31,6, 29,9, 28,6, 14,8 | m/z Beräknat årligt belopp för [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725; hittade: 632.2722; Δ:-0.47 ppm | |||
| 3 | (500 MHz, CDCl3) 9,99 (1 H, s), 7,98 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,75 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 6,88 (1 H, s), 4,99 (1 H, s), 3,66-3,50 (15 H, m), 3,41 (2 H, q, J = 6,0 Hz), 3.20 (2 H, q, J = 6,5 Hz), 2,71 (2 H, m), 2,65 (2 H, m) , 1,80-1,70 (4H, m), 1,43 (9H, s) | (125 MHz, CDCl3) 172,6, 171,5, 166,5, 161,6, 156,1, 143,4, 128,7, 119,6, 116,4, 79,1, 70,5, 70,4, 70,2, 70,0, 69,4, 43,0, 38,8, 38,4, 33,2, 31,3, 29,7, 28,4 | m/z Beräknat årligt belopp för [C28H43N5O10S + H]+: 642.2803; hittade: 642.2797; Δ: -0,93 ppm | |||
| SKIDA | (500 MHz, D2O) 7,85 (2 H, d, J = 9,0 Hz), 7,55 (2 H, d, J = 8,5 Hz), 3,60 3,45 (15 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.20 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 3.04 (2 H, t, J = 7,0 Hz), 2.67 (2 H, t, J = 6,5 Hz), 2,54 (2 H t, J = 6,5 Hz), 1,87 (2 H, qt, J = 6,5 Hz), 1.70 (2 H, qt, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, D2O) 174,5, 173, 2a, 166,8, 161,4, 142,2, 128,6, 120,3, 116,6, 69,4, 69,4, 69,3, 69,2, 68,2, 68,2, 42,5, 37,6, 36,2, 31,9, 30,7, 28.2, 26,4 | m/z Beräknat årligt belopp för [C23H35N5O8S + H]+: 542.2279; hittade: 542.2281; Δ: 0,37 ppm | |||
| PODS-DOTA | (600 MHz, DMSO-d6) 10,46 (1 H, s), 9,74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = 8,6 Hz), 7,99 (1 H, s), 7,90 (1 H, t, J = 5,0 Hz), 7,86 (2 H, d, J = 6,5 Hz), 7.44 (2 H, d, J = 7,9 Hz), 7.24 (2 H, d, J = 7,1 Hz), 4,35-2,41 (45 H, m) , 3,70 (3H, s), 1,76 (2H, q, J = 6,3 Hz), 1.61 (2H, q, J = 6,5 Hz) | (125 MHz, DMSO-d6) 171,8, 171,4, 166,1, 162,2, 158,8, 158,6, 129.8, 129,0, 127,6, 123,3, 119,5, 118,5, 116,5, 116,4, 70,2, 70,1, 70,0, 68,7, 68,5, 43,4, 41,8, 36,3, 32.2, 30,4, 29,8, 29,1 | m/z Beräknat årligt belopp för [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; hittade: 1093.4327; Δ: -0,64 ppm | |||
Tabell 1. Karakterisering data för de syntetiska intermediärer beskrivs liksom PODS och PODS-DOTA.
| Antikropp | Typ | Konstant Region | Förhållandet mellan SKIDA: mAb |
| Humanplasma IgG | Mänskliga | Mänskliga IgG | 2.1 ± 0,1 |
| Trastuzumab | Humaniserad | Humant IgG1 | 2,0 ± 0,1 |
| huA33 | Humaniserad | Humant IgG1 | 2.1 ± 0,1 |
| Cetuximab | Chimär | Humant IgG1 | 2.2 ± 0,1 |
| AR 9,6 | Murin | Murin IgG1 | 1,4 ± 0,1 |
| Mus plasma IgG | Murin | Murin IgG | 1,5 ± 0,1 |
Tabell 2. Graden av märkning av olika antikroppar efter konjugering med en SKIDA räntebärande fluorophore. Värden visas standardavvikelser. Tabell återges med tillstånd från Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reaktivt bifunktionell kelater för de skapandet av webbplatsen-selektivt modifierad Radioimmunoconjugates med förbättrad stabilitet. Konjugationens kemi. 29, 1364-1372 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport har vi valt att inte inkludera några protokoll för radiolabeling eller in vivo-experiment. Våra skäl är enkelt. Med avseende på förra, den radiolabeling av en SKIDA-baserade immunoconjugate skiljer sig inte alls från det av en immunoconjugate som syntetiseras med andra bioconjugation strategier, och dessa förfaranden har varit utförligt recenserade någon annanstans2 . Beträffande den senare kan detaljerna i prekliniska in vivo experiment (dvs musmodeller, doser, etc.) variera i stort sett enligt både ansökan och antikropp/antigen systemet.
Våra tidigare undersökningar med 89Zr-märkt varianter av huA33 ger en övertygande bild av fördelarna med PODS-baserade bioconjugations. HuA33 är en humaniserad IgG1-antikropp som riktar A33 antigen, ett transmembrana glykoprotein som uttrycks på > 95% av kolorektal cancer23,24. I vår tidigare manuskript22rapportera vi syntesen av 89Zr-DFO-huA33 radioimmunoconjugate med både SKIDA och maleimide-baserade bioconjugation strategier. Två radioaktivt antikroppar — 89Zr-DFO-PODS-huA33 och 89Zr-DFO-mal-huA33 — tillverkades i nästan identiska avkastning, renhet, specificitet aktivitet och immunoreaktivitet. Kritiskt, men de två radioimmunoconjugates uppvisade dramatiskt annorlunda stabiliteter i humant serum: efter inkubation under sju dagar vid 37 ° C, 89Zr-DFO-PODS-huA33 förblev 86 ± 1% intakt, medan dess maleimide-baserade kusin var endast 61 ± 5% intakt. In vivo PET imaging och biodistribution experiment i atymiska naken möss med A33 antigen-uttryckande SW1222 mänskliga kolorektal cancer xenograft avslöjade skarp skillnaderna i Invivo beteendet hos de två radioimmunoconjugates (figur 8 och Figur 9). Både 89Zr-DFO-PODS-huA33 och 89Zr-DFO-mal-huA33 producera hög aktivitetskoncentrationer i tumörvävnad: 56,4 ± 6.9%ID/g och 49,6 ± 9.3%ID/g, respektive 48 h efter administrering. Den maleimide-baserade radioimmunoconjugate produceras dock betydligt högre aktivitetskoncentrationer i friska vävnader än PODS-baserade agenten. Till exempel 89Zr-DFO-mal-huA33 framställda aktivitetskoncentrationer 3,1 ± 0,5 2,7 ± 0,4 och 12,2 ± 0,4% ID/g i njurar, lever och ben, respektive på 120 h efter injektion, värden som dramatiskt överstiger aktivitetskoncentrationen Producerad av 89Zr-DFO-PODS-huA33 i samma vävnader (1,4 ± 0,1, 1,2 ± 0,3 och 4,3 ± 0,6% ID/g). Faktiskt produceras 89Zr-DFO-PODS-huA33 lägre aktivitetskoncentrationer i alla icke-målorganismer vävnader (utom den stora inälvan) vid 120 h efter injektion jämfört med 89Zr-DFO-mal-huA33. Som ett resultat, är tumör-till-organ verksamhet koncentration kvoterna för 89Zr-DFO-PODS-huA33 generellt överlägsna de 89Zr-DFO-mal-huA33; i synnerhet, tumör-till-lever, tumör-till-mjälte, tumör-till-njure och tumör-till-ben aktivitetskoncentrationen är nyckeltal nästan dubbla för den SKIDA-baserade immunoconjugate jämfört med dess maleimide-derived kusin. Med tanke på att den huvudsakliga skillnaden mellan de två radioimmunoconjugates var kelator bioconjugation handtag, är SKIDA-thiol kopplingen ökad stabilitet nästan säkert ansvarig för detta förbättrad Invivo prestanda.
Tar ett bredare perspektiv, är den icke-plats-selektiv bioconjugation av sonder till lysines inom antikroppar visserligen en okomplicerad och lättköpt strategi för ändring av antikroppar. Förekomsten av flera lysines som distribueras i hela strukturen av immunglobuliner innebär dock att det är omöjligt att utöva kontroll över exakt platsen eller graden av bioconjugation2. Som ett resultat, denna slumpmässiga strategi ger ofta dåligt definierat och ytterst heterogen immunoconjugates som kan uppvisar minskade immunoreaktivitet om nering uppträder inom de antigen-bindande domäner3. Fördelarna med webbplats-selektiva metoder för att bioconjugation har illustrerats upprepade gånger för både radioimmunoconjugates och antikropp-drogen konjugat8,14,25,26, 27,28,29,30. Kort sagt, inte bara göra webbplats-selektiv bioconjugation strategier producera mer väldefinierad och homogen immunoconjugates än traditionella metoder, de också skapa imaging agenter, radioimmunotherapeutics och ADCs med förbättrad Invivo prestanda. Men var står PODS-baserade nering i jämförelse till andra plats-selektiv modifiering strategier? Generellt sett är metoderna för webbplats-selektiv ändring av antikroppar kan delas in i fyra kategorier: (1) nering till Cystein restsubstanser, (2) manipulation av den tunga kedjan glycans, (3) chemoenzymatic transformationer och (4) användning genteknik4,5. Naturligtvis, detta klassificeringssystem är inte perfekt, och vissa metoder (t.ex. ändring av den tunga kedjan glycans med enzymer) oundvikligen kvalificera för två kategorier. Varje strategi har sina fördelar och nackdelar. Genteknik-baserade metoder ger utsökta kontroll över platsen för konjugation, men de är komplexa och dyra31,32,33. Oxidativa kopplingar till den tunga kedjan glycans är billig och enkel, men ändå riskerar de oxidativa skador på den strukturella integriteten immunglobulin34,35,36,37 ,38.
Den främsta fördelen med thiol-baserade bioconjugations — PODS ingår — är deras enkelhet och modularitet. Deras främsta begränsning, däremot, härrör från förekomsten av flera Tioler inom en antikropp, ett drag som minskar graden av kontroll över både platsen för konjugation och antalet ändringar per antikropp. I denna mening är kombinationen av thiol-baserade nering och antikroppar som genetiskt har konstruerats för att äga gratis Cystein rester en särskilt attraktiv hållning. Som vi har noterat, är en annan begränsning av maleimide-baserade thiol nering känsligheten för den succinimidyl thioether bond till retro-Michael tillägg Invivo. Ännu kritiskt, upphäver användning av SKIDA detta problem.
Innan vi Avslutningsvis är det viktigt att notera att den framväxande naturen av SKIDA teknik kan skapa sin egen uppsättning av hinder. Exempelvis ingen PODS-bärande bifunktionell kelater är (för närvarande) kommersiellt tillgängliga, och det finns inga data som åtgärda klinisk farmakologi, toxikologi eller immunogeniciteten för PODS-baserade immunoconjugates. Vi anser dock att SKIDA-baserade bioconjugations har potential att fundamentalt förändra immunoconjugates syntetiseras i både laboratorium och klinik. Närvarande, vi har endast tillämpas detta kemisk teknologi till utvecklingen av radioimmunoconjugates för kärnkraft avbildning och radioimmunoterapi, att utredningar av verktyget med denna metod för byggande av antikropp-drogen konjugat och andra biomolekylär läkemedel pågår. I slutändan hoppas vi innerligt att detta protokoll – och särskilt det raka och enkla kemi som vi har utvecklat — hjälper främja användningen av phenyloxadiazolyl metyl sulfoner för sulfhydryl-baserade konjugationer och sporra en förskjutning i fältet från maleimides till stabilare och säkrare alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Sai Kiran Sharma för bra konversationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
References
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S.
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E.
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
