Summary
في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف توليف القرون، كاشف المستندة إلى [سولفون] فينيوكساديازوليل الميثيل للمرفق الموقع انتقائية من الشحنات إلى ثيولس الجزيئات الحيوية، لا سيما الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، سوف يصف لنا التوليف وتوصيف تشيلاتور بيفونكشونال الحاملة لقرون وفي التصريف لجسم نموذجي.
Abstract
تم توظيف المسابير بيفونكشونال ماليميدي الحاملة لعقود لتعديل موقع انتقائية ثيولس في الجزيئات الحيوية، لا سيما الأجسام المضادة. بعد عرض يصرف على أساس ماليميدي المجراة في محدودية الاستقرار نظراً لأن الربط ثيوثير سوكسينيميديل يمكن الخضوع لرد فعل الرجعية-مايكل. هذا، بطبيعة الحال، يمكن أن يؤدي إلى الإفراج عن الحمولة المشعة أو تبادلها مع الجزيئات الحيوية ثيول الحاملة في الدورة الدموية. كل من هذه العمليات يمكن إنتاج تركيزات مرتفعة من النشاط في الأجهزة الصحية، فضلا عن تناقص النشاط التركيزات في الأنسجة المستهدفة، مما أدى إلى انخفاض التباين التصوير وانخفاض نسب العلاجية. في عام 2018، أبلغنا بإنشاء وحدات ومستقرة، والوصول إليها بسهولة فينيلوكساديازوليل الميثيل [سولفون] كاشف – التي يطلق عليها اسم 'القرون' – كمنصة بيوكونجوجيشنز على أساس ثيول. نحن أثبتت بوضوح أن بيوكونجوجيشنز الموقع الانتقائي القائم على القرون تكاثر وقوة إنشاء راديويمونوكونجوجاتيس متجانسة، محددة تحديداً جيدا وإيمونوريكتيفي عالية ومستقرة جداً. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب الإكلينيكية في نماذج مورين لسرطان القولون والمستقيم هذه تسمية الموقع بشكل انتقائي راديويمونوكونجوجاتيس معرض الأداء المجراة في أعلى بكثير مقارنة بالأجسام المضادة راديولابيليد توليفها عبر المستندة إلى ماليميدي الاقتران. في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف التوليف أربع خطوات من القرون، إنشاء متغير قرون الحاملة بيفونكشونال من تشيلاتور في كل مكان DOTA (القرون-DOTA)، وتصريف القرون-DOTA إلى تراستوزوماب جسم استهداف HER2.
Introduction
منذ فترة طويلة وتستغل الانتقائية وخصوصية من الأجسام المضادة للمؤشرات الحيوية للأمراض لكلا التصوير النووي الكيمياء الصيدلانية واستهدف العلاج الإشعاعي1. ويستند نهج مشترك وبعيدا أكثر من راديولابيلينج الأجسام المضادة تمسك العشوائي راديولابيليد الاصطناعية المجموعات أو تشيلاتورس راديوميتال بالأحماض الأمينية – ليسينيس في أغلب الأحيان – داخل هيكل الغلوبولين المناعي ( الشكل 1A)2. أن هذه الاستراتيجية فعالة بالتأكيد، فطبيعتها العشوائية، غير محددة الموقع يمكن أن تخلق مشاكل. على وجه التحديد، إنتاج النهج التقليدي بيوكونجوجيشن سوء المعرفة وإيمونوكونجوجاتيس غير متجانسة تتألف من خليط آلاف ريجيويسوميرس مختلفة، كل مع مجموعتها الخاصة من الخصائص البيولوجية والدوائية3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تعوق بيوكونجوجيشن عشوائي إيمونوريكتيفيتي من الأجسام المضادة إذا كانت الشحنة يتم إلحاقها مستضد ملزمة المجالات جسم.
على مر السنين، وضعت مجموعة متنوعة من استراتيجيات بيوكونجوجيشن الخاصة بالموقع والموقع الانتقائي من أجل معالجة هذه المشاكل4،5. الأكثر شيوعاً من هذه النهج يعتمد على الربط المسابر ماليميدي الحاملة لمجموعات سلفهيدريل سيستينيس (الشكل 1B). وبطبيعة الحال تحتوي الأجسام المضادة IgG1 4 ثنائي كبريتيد سلسلة بين الجسور والروابط التي يمكن الحد بشكل انتقائي تؤتي ثيولس الحرة يمكن أن تمر بتفاعلات إضافة مايكل مع ماليميديس شكل سندات ثيوثير سوكسينيميديل. استخدام ثيولس وماليميديس بالتأكيد تحسنا في الطرق التقليدية، ومجموعة متنوعة واسعة من تحمل ماليميدي سينثونس وتشيلاتورس بيفونكشونال متوفرة حاليا. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه المنهجية قد القيود الخطيرة، فضلا عن. إيمونوكونجوجاتيس على أساس ماليميدي يحمل المجراة في محدودية الاستقرار للربط ثيويثير يمكن الخضوع لرد فعل الرجعية-مايكل (الشكل 2)6،،من78،9، 10-وهذا، بطبيعة الحال، يمكن أن يؤدي إلى الإفراج عن الحمولة المشعة أو تبادلها مع الجزيئات الحيوية ثيول الحاملة في الدورة الدموية (على سبيل المثال، الجلوتاثيون أو الزلال). كل من هذه العمليات زيادة تركيزات النشاط في الأجهزة الصحية فضلا عن انخفاض النشاط التركيزات في الأنسجة المستهدفة، مما أدى إلى انخفاض التباين التصوير وانخفاض نسب العلاجية. وقد وضعت العديد من الكواشف ثيول المتفاعلة بديلة في محاولة للالتفاف حول هذه المسائل، بما في ذلك توسيلاتيس وبروم وأسيتيلس عودة، وينيل سولفونيس11،،من1213، 14 , 15 , 16 , 17. غير أن جميع هذه النهج بالقيود التي أعاقت تطبيقها على نطاق واسع.
قبل حوالي خمس سنوات المختبر الثالث بارباس كارلوس مساء في معهد أبحاث سكريبس رائدة استخدام فينيلوكساديازوليل الميثيل سولفونيس كالمواد الكاشفة لتشكيل روابط مستقرة جداً مع ثيولس (الشكل 1 والشكل 3) انتقائية 18 , 19-يعمل الكتاب البديل [سولفون] الحاملة الميثيل فينيلوكساديازوليل من فلوريسسين لتعديل عدة أجسام هندسيا لتحتوي على بقايا سيستين مجاناً، المنتجة إيمونوكونجوجاتيس في نهاية المطاف مع الاستقرار أعلى من مماثلة الثوابت التي تم إنشاؤها باستخدام المسابر المستندة إلى ماليميدي. عند رؤية هذا العمل واعدة، وقد فوجئنا إلى حد ما أن هذه التكنولوجيا قد استخدمت إلا نادراً في الكيمياء الإشعاعية ولم لم تستخدم على الإطلاق في تركيب تشيلاتورس بيفونكشونال أو راديويمونوكونجوجاتيس،من2021 . ندرة في هذه التطبيقات، ومع ذلك، سرعان ما بدأت بمعنى أكثر: أدت إلى عدة محاولات لشراء الكاشف من سيغما ألدريتش في تلقي الخلائط المعقدة من نواتج تحلل مع < 15 في المائة المجمع المطلوب. وباﻹضافة إلى ذلك، توليف الكاشف عن أنفسنا لم يكن خياراً واقعيا، أما الطريق الاصطناعية المنشورة مرهقة إلى حد ما وتتطلب معدات متطورة في مجال الكيمياء العضوية أن معظم الكيمياء الإشعاعية والتصوير الجزيئي مختبرات – بما في ذلك بلدنا – ببساطة لا تملك.
واستجابة لهذه العقبات، حددنا إنشاء الوصول إليها بسهولة ومستقرة جداً فينيلوكساديازوليل الميثيل [سولفون] كاشف التي يمكن الحصول عليها عبر مسار اصطناعية قوية ومعقولة السطحية. وفي وقت سابق من هذا العام، أبلغنا بإنشاء وحدات ومستقرة، والوصول إليها بسهولة فينيلوكساديازوليل الميثيل [سولفون] كاشف – يطلق عليها اسم 'القرون' – كمنصة بيوكونجوجيشنز على أساس ثيول (الشكل 1 والشكل 3)22. الاختلاف الرئيسي بين القرون والكاشف عنها بارباس، et al. أن السابق توظف عصابة الانيليني يعلق على مجموعة [سولفون] الميثيل فينيلوكساديازوليل، في حين أن هذا الأخير يتميز فينول في نفس الموضع (الشكل 4). يسهل هذا التغيير طريقا اصطناعية أكثر وضوحاً وأيسر منالاً كذلك – إذا كانت تجربتنا مع المجمع المتاحة تجارياً دلالة – كاشف نهائي أكثر استقرارا. في هذا العمل، ونحن أيضا توليف زوج من القرون الحاملة بيفونكشونال تشيلاتورس – DFO القرون والقرون-التايوانية-أ ''-دتبا-لتسهيل إنشاء 89Zr-و 177لو المسمى راديويمونوكونجوجاتيس، على التوالي. ونحن سوف نناقش، لقد أظهرنا أن بيوكونجوجيشنز الموقع الانتقائي القائم على القرون تكاثر وقوة إنشاء راديويمونوكونجوجاتيس متجانسة، محددة تحديداً جيدا وإيمونوريكتيفي عالية ومستقرة جداً. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب الإكلينيكية في نماذج مورين لسرطان القولون والمستقيم هذه تسمية الموقع بشكل انتقائي راديويمونوكونجوجاتيس متفوقة الأداء المجراة في المعرض مقارنة بالأجسام المضادة راديولابيليد توليفها عبر المستندة إلى ماليميدي الاقتران.
والهدف الأسمى من هذا العمل تسهيل إنشاء إيمونوكونجوجاتيس محددة تحديداً جيدا ومتجانسة ومستقرة جداً وشديدة إيمونوريكتيفي للتطبيقات في المختبر والمجراه. النهج الاصطناعية بسيط يمكن أداؤها في أي مختبر، ويمكن تعديل الكاشف القرون الأصل مع عدد كبير من تشيلاتورس مختلفة أو فلوروفوريس أو الشحنات. في هذا البروتوكول والفيديو المصاحبة لها، ونحن سوف تصف توليف بسيطة من أربع خطوات من القرون (الشكل 5)؛ إنشاء متغير القرون الحاملة ليعطي، تشيلاتور تستخدم على نطاق واسع للتنسيق من 64Cu، 68Ga، 111، 177لو، و 225التيار المتردد (الشكل 6)؛ وبيوكونجوجيشن من القرون-DOTA على جسم نموذجي، استهداف HER2 IgG1 تراستوزوماب (الشكل 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تركيب 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
ملاحظة: نظراً لحساسية الضوء في المجمع، تبقى جميع ردود الفعل في سفن المغطاة بإحباط.
- في 10 مل الجولة أسفل قارورة، حل 100 مغ (0.517 ملمول، أي ما يعادل 1) من 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol في 3 مل ميثانول.
- لهذا الحل، قم بإضافة ميكروليتر 360 من دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا؛ ملمول 2.07؛ ومكافئات 4؛ لا مائي) وبار إثارة مغناطيسية صغيرة. تغطية قارورة مع سداده مطاطية وآثاره الحل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام المحاقن زجاجية 1 مل، كزة ثقب سداده المطاط وإضافة 32 ميكروليتر (0.517 ملمول، أي ما يعادل 1) من إيودوميثاني إلى هذا الخليط بسرعة. السماح الخليط أن تستجيب لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بسبب الآثار الضارة المحتملة إيودوميثاني، رد الفعل هذا وينبغي أن يتم في غطاء الأبخرة كيميائية. - تعيين حمام الماء من مبخر دوراني إلى 40 درجة مئوية وتقليل الضغط من أجل إزالة المذيب تحمل مادة صلبة بيضاء ببطء.
- حل الصلبة في 3 مل خلات الإيثيل وتغسل ثلاث مرات على الأقل بحل 5 مل من كربونات الصوديوم 0.1 متر باستخدام قمع سيباراتوري.
ملاحظة: يستغرق دورياً سبوت-اختبارات المرحلة المائية تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية؛ وبمجرد شيء يعتبر تحت المصباح، يمكنك التوقف عن يغسل. - جمع في مرحلة العضوية في قمع سيباراتوري وغسله بالماء حتى تصل درجة الحموضة المرحلة المائية إلى 6.8 7.0 (باستخدام ورقة الأس الهيدروجيني).
- جمع المرحلة العضوية وإضافة سلفات المغنيزيوم لإزالة أي آثار للمياه.
ملاحظة: تضاف سلفات المغنزيوم مع ملعقة صغيرة، بعد أن سرت الحل. إذا كانت تزال تعتبر الجسيمات الدقيقة من عامل التجفيف، الحل الجافة. إذا لم يكن الأمر كذلك، إضافة كميات صغيرة من سلفات المغنزيوم حتى يمكن رؤية الجسيمات الدقيقة. - قم بتصفية الخليط استخدام الزجاج المتوسطة أطل أو ورق الترشيح.
- تتبخر التطاير استخدام مبخر دوارة، هي عملية ينبغي أن تنتج المنتج المطلوب الإبر بيضاء.
2-تخليق tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] الكاربامات (2)
ملاحظة: نظراً لحساسية الضوء في المجمع، تبقى جميع ردود الفعل في سفن المغطاة بإحباط.
- في 25 مل الجولة أسفل قارورة، حل مغ 387 (0.92 ملمول، أي ما يعادل 1.0) من نبوك-N′-سوكسينيل-4,7,10-تريوكسا-1,13-تريديكانيدياميني في 10 مل الميثان.
- لهذا الحل، قم بإضافة 480 ميكروليتر (2.76 ملمول، مكافئات 3) من ديبا، 264 ملغ (1.38 mmol; مكافئات 1.5) ن-إثيل-N′-[3-(ديميثيلامينو) بروبيل] هيدروكلوريد كاربودييميدي (ادسي)، و 200 ملغ (0.97 mmol، مكافئات 1.1) من 1. ختم السفينة بسداده زجاجية وترك رد فعل إثارة لمدة 5 أيام في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: أن تضع في اعتبارها تبخر الميثان. إذا لزم الأمر، إضافة أكثر طوال الأسبوع. - أغسل الخليط في قمع سيباراتوري بمحلول حامض الهيدروكلوريك 1 م (3 x 5 مل).
- جمع المرحلة العضوية وغسله في قمع سيباراتوري، أولاً مع حل م 1 Na2CO3 (2 × 5 مل) ثم بالماء (3 x 5 مل).
- جمع المرحلة العضوية وإضافة سلفات المغنيزيوم لإزالة أي آثار للمياه (راجع الخطوة 1، 7). قم بتصفية الخليط استخدام الزجاج المتوسطة أطل أو ورق الترشيح.
- استخدام مبخر دوراني، إزالة المذيبات المتطايرة تحت ضغط انخفاض تحمل صلبة البيض.
- إعادة حل هذا الصلبة في 10 مل خلات الإيثيل ويعجل بالمنتج عن طريق إضافة 30 مل الحلقي تدريجيا (مثلاً، 2 مل في كل مرة).
- تصفية الحل مع ورق الترشيح أو أطل زجاج متوسطة الحجم للحصول على المنتج كمسحوق أبيض.
3-توليف tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] الكاربامات (3)
ملاحظة: نظراً لحساسية الضوء في المجمع، تبقى جميع ردود الفعل في سفن المغطاة بإحباط.
- في قارورة مستديرة قاع 10 مل، حل 30 ملغ (ميللي مول 0.05؛ ما يعادل 1) 2 في 4 مل الميثان.
- ببطء إضافة 49 ملغ (0.2 ميللي مول؛ مكافئات 4) حمض m-تشلوروبيربينزويك 70% إلى هذا الخليط وتغطية وعاء التفاعل مع سداده زجاجية. إثارة الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، مما أسفر في نهاية المطاف عن خليط أصفر.
- أغسل الخليط الأصفر في قمع سيباراتوري، أولاً مع حل م 0.1 من هيدروكسيد الصوديوم (3 x 5 مل) ثم بالماء (3 x 5 مل).
- جاف في مرحلة العضوية مع سلفات المغنزيوم وتصفية الخليط استخدام الزجاج المتوسطة أطل أو ورق الترشيح.
- استخدام مبخر دوراني، إزالة المذيبات تحت الحد من الضغط للحصول على المنتج صلبة شاحبة.
4-توليف ن1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-سوكسيناميدي {فينيل 4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]} (القرون)
- في 25 مل الجولة أسفل قارورة، حل 30 ملغ 3 مل 2.0 من الميثان.
- إضافة 400 ميكروليتر من حامض trifluoroacetic وختم قارورة بسداده زجاجية.
- إثارة رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
- استخدام مبخر دوراني، إزالة التطاير تحت ضغط انخفاض في درجة حرارة الغرفة، ترك بقايا زيتية.
- حل بقايا زيتية في 7 مل مياه، واستخدام قمع سيباراتوري، يغسل مع وخلات الإيثيل (3 x 4 مل). الاحتفاظ بالطبقة المائية.
- ليوفيليزي الطبقة المائية على تحمل القرون كمسحوق أبيض.
ملاحظة: معاملات الامتصاص المولى للقرون في 280 و 298 شمال البحر الأبيض المتوسط هي 9,900 و 12,400 سم-1م-1، على التوالي.
5-تركيب القرون-DOTA
- في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، حل 10 مغ قرون في 300 ميكروليتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (0.018 mmol؛ ما يعادل 1) وإضافة ميكروليتر 26 من N، N-دييسوبروبيليثيلاميني (0.15 mmol؛ المعادل 8).
- حل 15.2 ملغ DOTA-Bn-سي إس (0.02 ميللي مول؛ مكافئات 1.2) في 100 ميكروليتر من ديميثيلسولفوكسيدي والجمع بين هذا الحل مع الحل من 5.1 خطوة. ختم أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- السماح بأن رد الفعل على احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة ج18 [هبلك] اللوني لإزالة أي الممتص DOTA-Bn-سي إس.
ملاحظة: الاحتفاظ بأوقات ومن الواضح أن يعتمد بشدة على المعدات [هبلك] لكل مختبر (المضخات، والأعمدة، والأنابيب، إلخ)، ويجب أن يتم تشغيل عناصر التحكم المناسبة قبل تنقية. ومع ذلك، لتقديم مثال على ذلك، إذا كان تدرج 5:95 ميكن/ح2س (سواء مع 0.1% تفا) لمشروعاتها ميكن/ح2س (سواء مع 0.1% تفا) تستخدم أكثر من 30 دقيقة، شبه محضرة 19 × 250 ملم ج18 عمود، ومعدل تدفق 6 مل/دقيقة ، القرون، p-العقدة-Bn-DOTA، والقرون-DOTA سيكون الاحتفاظ بأوقات حوالي 14.4 و 18.8 19.6 دقيقة، على التوالي. ويمكن رصد جميع المركبات الثلاث في 254 نانو متر.
6-بيوكونجوجيشن من القرون-DOTA إلى تراستوزوماب
ملاحظة: لهذه الخطوة، بدأنا بحل تراستوزوماب أسهم 16.4 ملغم/مل.
- في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل ملزمة بروتين منخفض، تمييع ميكروليتر 61 الحل الأسهم تراستوزوماب (1 ملغ؛ و 6.67 نمول، أي ما يعادل 1) مع ميكروليتر 859 من الفوسفات مخزنة المالحة (درجة الحموضة 7.4).
- لهذا الخليط، إضافة ميكروليتر 6.7 من 10 مم تقدم طازجة حلاً من تسيب في ح2س (نمول 66.7، مكافئات 10).
- تعد حلاً 1 ملغ/مل من القرون-DOTA في [دمس] وإضافة ميكروليتر 73 هذا الحل DOTA القرون إلى خليط رد فعل (نمول 66.67، مكافئات 10).
- إغلاق الأنبوب ميكروسينتريفوجي واحتضان الحل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
- وبعد ساعتين، تنقية إيمونوكونجوجاتي استخدام عمود desalting استبعاد معبأة مسبقاً حجم المتاح.
- أولاً، حجته استبعاد حجم العمود كما هو موضح من قبل المورد لإزالة أي من المواد الحافظة الموجودة في العمود أثناء التخزين. إجراء نموذجي يشمل غسل العمود 5 مرات بحجم برنامج تلفزيوني يتوافق مع حجم العمود: 5 × 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- المقبل، إضافة الخليط رد فعل إلى العمود الاستبعاد الحجم مشيراً إلى حجم الخليط رد فعل.
- بعد أن دخلت الخليط رد فعل العمود، إضافة مبلغ مناسب لبرنامج تلفزيوني لتحقيق الحجم الإجمالي للحل إضافة إلى العمود يصل إلى 2.5 مل. على سبيل المثال، إذا أدى رد فعل تصريف إجمالي 1.3 مل، سيحتاج 1.2 مل من برنامج تلفزيوني إضافية تضاف إلى العمود.
- وأخيراً، جمع المنتج باستخدام 2 مل من برنامج تلفزيوني الوينت.
- التركيز إيمونوكونجوجاتي النهائي مع وحدات الطرد المركزي الترشيح مع وقف وزن الجزيئي كاتشين 50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوات الأربعة الأولى من هذا البروتوكول-توليف القرون – وقد صممت لتكون قوية وموثوق بها. يتيح ديبروتونيشن والاستعاضة عن 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol لتشكيل المنتج المطلوب ثيويثير ثيويثير في > الغلة 99% بعد 45 دقيقة فقط. المقبل، والربط بين 1 و N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine تحقق عبر ببتيد قياسية اقتران الإجراء، أسفر عن جمع المنتج (2) في الغلة 55%. ثم أجرى أكسدة 2 باستخدام حمض m-تشلوروبيروكسيبينزويك، أكسدة مستخدمة على نطاق واسع. اتباع خطوات الغسيل، تم الحصول على 3 صلبة شاحب في الغلة ~ 90%. وأخيراً، تم إزالة مجموعة حماية ثالثي-بوتيلوكسيكاربونيل من 3 وفقا للإجراءات القياسية، باستخدام نسبة 4:1 من حمض dichloromethane:trifluoroacetic. بعد lyophilization المرحلة المائية، ومنتجاتنا – القرون – تم الحصول عليها كمسحوق أبيض في الغلة 98 في المائة. التقدم المحرز في رد فعل أعقب عبر طبقة رقيقة اللوني، وتم تأكيد هوية كل منتج عن طريق 1ح-الرنين المغناطيسي النووي، 13ج-الرنين المغناطيسي النووي، ونظام إدارة الموارد البشرية-أي إس أي (الجدول 1).
واحدة من المزايا الرئيسية للكاشف القرون هو نمطية لها. يمكن إلحاق مجموعة متنوعة من تشيلاتورس، فلوروفوريس، السموم، أو شحنات أخرى إلى أمين قلادة في المجمع. في البروتوكول في متناول اليد، ونحن نستخدم تشيلاتور في كل مكان دي أو تي أية (حمض 1,4,7,10-تيترازاسيكلودوديكاني-1,4,7,10-تيتراسيتيك) كحمولة ممثل. DOTA، بطبيعة الحال، قد استخدمت في طائفة واسعة من المواد المشعة الجزيئية البيولوجية تشيلاتور راديوميتالس بما في ذلك 68Ga، 64Cu، 111، 90ص، 177لو، و 225التيار المتردد. وتحقيقا لهذه الغاية، يعمل متغير isothiocyanate الحاملة ليعطي (p-العقدة-Bn-DOTA) بالإضافة إلى أمين قلادة من القرون عن طريق شروط اقتران مباشر. ثم تنقيته عن طريق عكس المرحلة ج18 [هبلك] تشيلاتور بيفونكشونال الناتجة ومعزولة في الغلة ~ 75%. كما هو الحال مع السلائف الأخرى، كان تتبع التقدم المحرز في رد فعل عبر طبقة رقيقة اللوني، وتم تأكيد هوية المنتج عن طريق 1ح-الرنين المغناطيسي النووي، 13ج-الرنين المغناطيسي النووي، ونظام إدارة الموارد البشرية-أي إس أي (الجدول 1).
في الخطوة النهائية للبروتوكول، ونحن نناقش بيوكونجوجيشن الموقع انتقائية من القرون-DOTA لنموذج الغلوبولين مناعي، تراستوزوماب جسم استهداف HER2. وتحقيقا لهذه الغاية، خفضت الروابط ثنائي كبريتيد المنطقة يتوقف الجسم بشكل انتقائي مع عامل تخفيض تسيب [tris(2-carboxyethyl) الفوسفين]. بعد هذه الخطوة الحد، الجسم المحتضنة مع القرون-DOTA ح 2 في درجة حرارة الغرفة وتنقيته بعد ذلك عن طريق حجم الاستبعاد اللوني. في هذه الحالة، تم الحصول على إيمونوكونجوجاتي المنقي، DOTA-واضعة في الغلة ~ 80%، وكشف تحليل استخدام ToF درجة من وسم (DOL) من ~1.8 دي أو تي أية/ماب. وبصفة عامة، وقد وجدنا أن مكافئات 10 من تسيب، 10 مكافئات الكاشف القرون، واحتضان ح 2 تكفي للعائد إيمونوكونجوجاتي مع دول من القرون 2/ماب (الجدول 2). هذه النتيجة تظل متسقة عبر مجموعة من الأجسام المضادة IgG1 الإنسان وأنسنة، وتشيميريك؛ ومع ذلك، تنتج نفس الشروط إيمونوكونجوجاتيس مع دول ~1.5 فقط عند العمل مع الأجسام المضادة IgG1 مورين. وقال كل هذا، الباحثين وينبغي تحسين شروط رد فعل هذه الأجسام المضادة الجديدة والبضائع الحاملة للقرون. وأخيراً، والأهم من ذلك، فيما يتعلق بالمنتج النهائي، مرارا وتكرارا، وتكاثر وجدنا أن يحمل إيمونوكونجوجاتيس المستندة إلى القرون إيممونوريكتيفيتيس مساوية أو أفضل من بنيات مماثلة تم إنشاؤها باستخدام عشوائي أو المستندة إلى ماليميدي استراتيجيات الاقتران.
رقم 1: التخطيطي التوضيح من بيوكونجوجيشنز استخدام أمين المتفاعلة، (أ) (ب) ماليميدي الحمل، و (ج) القرون الحاملة للشحنات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إضافة مايكل بيوموليكولي تحمل ثيول (أخضر) وماليميدي النويدات المشعة الحاملة (أصفر) لتشكيل بيوكونجوجاتي راديولابيليد، فضلا عن ردود الفعل الإضافية التي يمكن أن يخضع لها بناء راديولابيليد حضور الذاتية ثيول تحمل جزيئات (الوردي). RT = درجة حرارة الغرفة. الرقم طبع بإذن من دافيدوفا أدومياو، ص،، م.، زيجليس، م. تشيلاتورس بيفونكشونال ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي "راديويمونوكونجوجاتيس تعديل" مع "تحسن الاستقرار". كيمياء بيوكونجوجاتي. 29، 1364-1372 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التخطيطي للتفاعل بين القرون وثيول. الرقم طبع بإذن من دافيدوفا أدومياو، ص،، م.، زيجليس، م. تشيلاتورس بيفونكشونال ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي "راديويمونوكونجوجاتيس تعديل" مع "تحسن الاستقرار". كيمياء بيوكونجوجاتي. 29، 1364-1372 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: هيكل القرون (A) ، وكذلك (ب) الكاشف عنها بارباس،18،et al.19الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: خطة من أربع خطوات عملية توليف من القرون. الرقم طبع بإذن من دافيدوفا أدومياو، ص،، م.، زيجليس، م. تشيلاتورس بيفونكشونال ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي "راديويمونوكونجوجاتيس تعديل" مع "تحسن الاستقرار". كيمياء بيوكونجوجاتي. 29، 1364-1372 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مخطط لتركيب القرون-DOTA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: مخطط بيوكونجوجيشن تراستوزوماب مع القرون-DOTA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
8 الرقم: مقارنة بين سلوك المجراة في 89Zr المسمى راديويمونوكونجوجاتيس من huA33 التي تم إنشاؤها باستخدام المستندة إلى القرون (89Zr-DFO-القرون-huA33) والاستراتيجيات المستندة إلى ماليميدي (89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33) بيوكونجوجيشن. مستو (يسار) وصور الحيوانات الأليفة الإسقاط (يمين) أقصى شدتها athymic الفئران عارية واضعة A33 معربا عن مستضد SW1222 سرطان القولون والمستقيم تكثيفها (السهم الأبيض) بعد حقن 89Zr-DFO-القرون-huA33 و 89 Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33 (140 µCi، ميكروغرام 60-65). شرائح الاكليلية تتقاطع مع مركز الأورام. الرقم طبع بإذن من دافيدوفا أدومياو، ص،، م.، زيجليس، م. تشيلاتورس بيفونكشونال ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي "راديويمونوكونجوجاتيس تعديل" مع "تحسن الاستقرار". كيمياء بيوكونجوجاتي. 29، 1364-1372 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: مقارنة بين سلوك المجراة في 89Zr المسمى راديويمونوكونجوجاتيس من huA33 التي تم إنشاؤها باستخدام المستندة إلى القرون (89Zr-DFO-القرون-huA33) والاستراتيجيات المستندة إلى ماليميدي (89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33) بيوكونجوجيشن. بيوديستريبوشن البيانات بعد إدارة 89Zr-DFO-القرون-huA33 و 89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33 (30 µCi، 15-18 ميكروغرام) للفئران athymic عارية واضعة A33 معربا عن مستضد SW1222 تحت الجلد سرطان القولون والمستقيم البشرية تكثيفها. وتشمل القيم الخاصة المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة المحتويات. الرقم طبع بإذن من دافيدوفا أدومياو، ص،، م.، زيجليس، م. تشيلاتورس بيفونكشونال ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي "راديويمونوكونجوجاتيس تعديل" مع "تحسن الاستقرار". كيمياء بيوكونجوجاتي. 29، 1364-1372 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مجمع | 1 ح-الرنين المغناطيسي التحولات | 13 ج-الرنين المغناطيسي التحولات | نظام إدارة الموارد البشرية | |||
| 1 | (500 ميغاهرتز، كدكل3) 7.79 (2 ح، د، ي = 8.5 هرتز)، 6.72 (2 ح، د، ي = 8.5 هرتز)، 4.04 (ح 2، ق ر)، 2.75 (ح 3, s) | (125 ميغاهيرتز، كدكل3) 166.3، 163.7، 149.7، 128.5، 114.8، 113.5، 14.8 | m/z كالكد ل [ج9ح9N3OS + H]+: 208.0539؛ وجد: 208.0539؛ Δ: 0.0 جزء في المليون | |||
| 2 | (500 ميغاهرتز، CDCl3) 9.68 (ح 1, s)، 7.91 (2 ح، د، ي = هرتز 9.0)، 7.71 (2 ح، د، ي = 8.5 هرتز)، 6.82 (ح 1, s)، 4.99 (ح 1, s)، 3.70-3.45 (12 ح، م)، 3.41 (2 ح،، ي = هرتز 6.0)، 3.20 (2 ح،، ي = 6.5 هرتز)، 2.76 (ح 3, s)، 2.71 (ح 2، m) 2.63 (ح 2 ، m)، 1.70 1.80 (ح 4، م) 1.42 (ح 9, s) | (125 ميغاهيرتز، CDCl3) 172.6، 171.3، 165.8، 164.6، 156.2، 141.8، 127.7، 119.6، 118.6، 79.2، 70.6، 70.5، 70.3، 70.1، 69.6، 38.8، 38.5، 33.5، 31.6، 29.9، 28.6، 14.8 | m/z كالكد ل [ج28ح43N5س8S + Na]+: 632.2725؛ وجد: 632.2722؛ Δ:-0.470 صفحة في الدقيقة | |||
| 3 | (500 ميغاهرتز، كدكل3) 9.99 (ح 1, s)، 7.98 (2 ح، د، ي = هرتز 9.0)، 7.75 (2 ح، د، ي = 8.5 هرتز)، 6.88 (ح 1, s)، 4.99 (ح 1, s)، 3.66-3.50 (ح 15، م)، 3.41 (2 ح،، ي = هرتز 6.0)، 3.20 (2 ح،، ي = 6.5 هرتز)، 2.71 (ح 2، m)، 2.65 (ح 2، m) ، 1.70 1.80 (ح 4، م) 1.43 (ح 9، ق) | (125 ميغاهيرتز، كدكل3) 172.6، 171.5، 166.5، 161.6، 156.1، 143.4، 128.7، 119.6، 116.4، 79.1، 70.5، 70.4، 70.2، 70.0، 69.4، 43.0، 38.8، 38.4، 33.2، 31.3، 29.7، 28.4 | m/z كالكد ل [ج28ح43N5س10S + H]+: 642.2803؛ وجد: 642.2797؛ Δ:-0.930 صفحة في الدقيقة | |||
| القرون | (500 ميغاهرتز، د2س) 7.85 (ح 2، د، ي = هرتز 9.0)، 7.55 (ح 2، د، ي = 8.5 هرتز)، 3.60-3.45 (ح 15، م)، 3.45 (ح 2, t, J = 6.5 هرتز)، 3.20 (ح 2, t, J = 6.5 هرتز)، 3.04 (ح 2, t, J = 7.0 هرتز)، 2.67 (ح 2, t, J = هرتز 6.5)، 2.54 (ح 2 t, J = 6.5 هرتز)، 1.87 (ح 2، كيو تي، ي = 6.5 هرتز)، 1.70 (ح 2، كيو تي، ي = 6.5 هرتز) | (125 ميغاهيرتز، د2س) 174.5، 173.2، 166.8، 161.4، 142.2، 128.6، 120.3، 116.6، 69.4، 69.4، 69.3، 69.2، 68.2، 68.2، 42.5، 37.6، 36.2، 31.9، 30.7، 28.2، 26.4 | m/z كالكد ل [ج23ح35N5س8S + H]+: 542.2279؛ وجد: 542.2281؛ Δ: 0.37 جزء في المليون | |||
| القرون-DOTA | (600 ميجاهرتز، د [دمس]6) 10.46 (ح 1, s)، 9.74 (ح 1, bs)، 8.04 (ح 2، د، ي = 8.6 هرتز)، 7.99 (ح 1, s)، 7.90 (ح 1, t, J = هرتز 5.0)، 7.86 (ح 2، د، ي = 6.5 هرتز)، 7.44 (2 ح، د، ي = هرتز 7.9)، 7.24 (ح 2، د، ي = 7.1 هرتز)، 2.41 4.35 (45 ح، م) ، 3.70 (ح 3, s)، 1.76 (2 ح،، ي = 6.3 هرتز)، 1.61 (2 ح،، ي = 6.5 هرتز) | (125 ميغاهيرتز، د [دمس]6) 171.8، 171.4، 166.1، 162.2، 158.8، 158.6، 129.8، 129.0، 127.6، 123.3، 119.5، 118.5، 116.5، 116.4، 70.2، 70.1، 70.0، 68.7، 68.5، 43.4، 41.8، 36.3، 32.2، 30.4، 29.8، 29.1 | m/z كالكد ل [ج47ح68ن10س16ق2+ H]+: 1093.4334؛ وجد: 1093.4327؛ Δ:-0.640 صفحة في الدقيقة | |||
الجدول 1- ووصف بيانات توصيف لوسيطة الاصطناعية فضلا عن القرون والقرون-DOTA.
| جسم مضاد | نوع | المنطقة المستمر | نسبة من القرون: ماب |
| البلازما البشرية مفتش | البشرية | مفتش الإنسان | 2.1 ± 0.1 |
| تراستوزوماب | أنسنة | IgG1 البشرية | 2.0 ± 0.1 |
| huA33 | أنسنة | IgG1 البشرية | 2.1 ± 0.1 |
| سيتوكسيماب | تشيميريك | IgG1 البشرية | 2.2 ± 0.1 |
| AR 9.6 | الفاري | مورين IgG1 | 1.4 ± 0.1 |
| ماوس البلازما مفتش | الفاري | مفتش الفاري | 1.5 ± 0.1 |
الجدول 2- درجة تصنيف مختلف الأجسام المضادة بعد الاقتران مع فلوروفوري الحاملة لقرون. يتم عرض قيم الانحرافات المعيارية. الجدول طبع بإذن من دافيدوفا أدومياو، ص،، م.، زيجليس، م. تشيلاتورس بيفونكشونال ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي "راديويمونوكونجوجاتيس تعديل" مع "تحسن الاستقرار". كيمياء بيوكونجوجاتي. 29، 1364-1372 (2018). حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير، لقد اخترنا لا تتضمن أية بروتوكولات للتجريب راديولابيلينج أو المجراة. لدينا أسباب واضحة. فيما يتعلق بالمسألة الأولى، راديولابيلينج إيمونوكونجوجاتي المستندة إلى القرون لا تختلف في كل من إيمونوكونجوجاتي تصنيعه باستخدام استراتيجيات أخرى بيوكونجوجيشن، وكانت هذه الإجراءات شاملة استعرض في أماكن أخرى2 . فيما يتعلق بالنقطة الأخيرة، يمكن أن تختلف التفاصيل المتعلقة بالتجارب المجراة في السريري (أي نماذج الماوس، جرعات، إلخ) على نطاق واسع وفقا لكل من التطبيق ونظام جسم/مستضد.
تحقيقاتنا السابقة مع متغيرات المسمى Zr 89من huA33 تقدم دليلاً مقنعا من مزايا بيوكونجوجيشنز المستندة إلى القرون. HuA33 هو جسم IgG1 أنسنة يستهدف مستضد A33، بروتين سكري transmembrane أعرب عن > 95% من سرطان القولون والمستقيم23،24. لدينا المخطوطة السابقة22، نحن تقرير توليف 89Zr-DFO-huA33 راديويمونوكونجوجاتي باستخدام كلا الاستراتيجيات المستندة إلى القرون وماليميدي بيوكونجوجيشن. وهما راديولابيليد الأجسام المضادة – 89Zr-DFO-القرون-huA33 و 89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33-أنتجت في الغلة متطابقة تقريبا، والنقاء، وخصوصية النشاط وإيمونوريكتيفيتي. خطيرة، ومع ذلك، أظهرت راديويمونوكونجوجاتيس اثنين زيادة مختلفة إلى حد كبير في مصل الدم البشري: حضانة لمدة سبعة أيام في 37 درجة مئوية، 89Zr-DFO-القرون-huA33 ظل بعد 86 ± 1% سليمة، بينما كان ابن عم لها على أساس ماليميدي فقط 61 ± 5% سليمة. تصوير الحيوانات الأليفة في الحية والتجارب بيوديستريبوشن في الفئران athymic عارية واضعة A33 معربا عن مستضد SW1222 البشرية سرطان القولون والمستقيم تكثيفها كشف صارخ الاختلافات في سلوك المجراة في راديويمونوكونجوجاتيس اثنين (الرقم 8 و الرقم 9). 89Zr-DFO-القرون-huA33 و 89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33 إنتاج تركيزات عالية من النشاط في أنسجة الورم: 56.4 ± 6.9%ID/g و 49.6 ± 9.3%ID/g، على التوالي، من 48 ساعة بعد الإدارة. ومع ذلك، أنتجت راديويمونوكونجوجاتي على أساس ماليميدي أعلى بكثير النشاط التركيزات في الأنسجة السليمة من عميل المستندة إلى القرون. على سبيل المثال، أنتجت 89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33 النشاط تركيزات 3.1 ± 0.5 2.7 ± 0.4 و 12.2 ± 0.4% معرف/ز في الكلي والكبد، والعظام، على التوالي، في 120 ساعة بعد الحقن، القيم التي تتجاوز تركيزات نشاط كبير 89Zr-DFO-القرون-huA33 في الأنسجة نفسها التي تنتجها (1.4 ± 0.1، 1.2 ± 0.3، و 4.3 ± 0.6% معرف/g). والواقع أن إنتاج 89Zr-DFO-القرون-huA33 تركيزات أقل من النشاط في جميع الأنسجة غير المستهدفة (باستثناء الغليظة) ح 120 بعد الحقن بالمقارنة مع 89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33. نتيجة لذلك نسب تركيز نشاط الورم إلى الجهاز 89Zr-DFO-القرون-huA33 عموما تفوق 89Zr-DFO-القانون النموذجي للتحكيم-huA33؛ في خاصة، ورم بالكبد وورم الطحال، ورم في الكلي، وتركيز النشاط الورم إلى العظام نسب مزدوجة تقريبا إيمونوكونجوجاتي المستندة إلى القرون بالمقارنة مع ابن عم لها المستمدة من ماليميدي. النظر إلى أن الفرق الرئيسي بين راديويمونوكونجوجاتيس اثنين مقبض بيوكونجوجيشن تشيلاتور، استقرار زيادة الربط القرون-ثيول مسؤولة يكاد يكون من المؤكد المجراة في هذا التحسن في الأداء.
أخذ وجهة نظر أوسع نطاقا، بيوكونجوجيشن غير انتقائية الموقع من المسابر إلى ليسينيس داخل أجسام المسلم اتباع نهج واضحة وسهلة لتعديل الأجسام المضادة. ومع ذلك، وجود ليسينيس متعددة موزعة في جميع أنحاء هيكل المناعية يعني أنه من المستحيل فرض السيطرة على الموقع الدقيق أو درجة بيوكونجوجيشن2. كنتيجة لذلك، غالباً ما تنتج هذه الاستراتيجية العشوائية سيئة المعرفة من قبل وإيمونوكونجوجاتيس متغايرة جداً التي يمكن أن يحمل انخفض إيمونوريكتيفيتي إذا ليجيشنز تحدث داخل المجالات مستضد ملزمة3. وقد تجلت فوائد النهج الانتقائي الموقع إلى بيوكونجوجيشن مرارا وتكرارا لكلا راديويمونوكونجوجاتيس والأجسام المضادة-المخدرات يرتبط8،14،،من2526، 2728،،،من2930. وباختصار، ليس فقط القيام بإنتاج استراتيجيات بيوكونجوجيشن الموقع انتقائية أكثر المعالم ومتجانسة إيمونوكونجوجاتيس من المنهجيات التقليدية، أنها أيضا إنشاء وكلاء التصوير، وراديويمونوثيرابيوتيكس، و ADCs مع تحسين الأداء المجراة. ومع ذلك ليجيشنز المستندة إلى القرون، أين بالمقارنة إلى استراتيجيات أخرى لتعديل موقع انتقائية؟ وبصفة عامة، يمكن تصنيف النهج إلى تعديل موقع الانتقائي للأجسام المضادة إلى أربع فئات هي: (1) ليجيشنز لبقايا السيستين، (2) التلاعب في جليكانس سلسلة ثقيلة والتحولات (3) تشيمونزيماتيك (4) الاستخدام من الهندسة الوراثية4،5. وبطبيعة الحال، نظام التصنيف هذا ليس مثاليا، وبعض النهج (على سبيل المثال، تعديل جليكانس سلسلة ثقيلة مع الإنزيمات) حتما مؤهلة لهاتين الفئتين. كل استراتيجية له مزاياه وعيوبه. النهج المستندة إلى الهندسة الوراثية توفير رائعة من السيطرة على موقع لتصريف الأفعال، ومع ذلك فهي معقدة ومكلفة31،،من3233. وصلات الأكسدة إلى جليكانس السلسلة الثقيلة، غير مكلفة وبسيطة، ومع ذلك فإنها تواجه خطر الضرر التأكسدي على السلامة الهيكلية الغلوبولين المناعي34،35،36،37 ،38.
كبير وميزة المستندة إلى ثيول بيوكونجوجيشنز – القرون شملت – هو البساطة ونمطية. القيد الرئيسي بها، من ناحية أخرى، تنبع من وجود ثيولس متعددة داخل جسم، سمة مما يقلل من درجة السيطرة على كل موقع لتصريف وعدد التعديلات كل جسم. وبهذا المعني، المزيج من ليجيشنز على أساس ثيول والأجسام المضادة التي وراثيا لامتلاك بقايا السيستين الحرة نهج جاذبية خاصة. كما لاحظنا، هو قيد آخر من ليجيشنز على أساس ماليميدي ثيول قابلية السندات ثيوثير سوكسينيميديل للإضافات الرجعية-مايكل المجراة. بعد استخدام القرون نقديا، يلغي هذه المشكلة.
قبل أن نختتم، من المهم ملاحظة أن الطبيعة الناشئة لتكنولوجيا القرون يمكن إنشاء مجموعتها الخاصة من العقبات. على سبيل المثال، لا تشيلاتورس بيفونكشونال الحاملة للقرون متوفرة تجارياً (حاليا)، ولا توجد بيانات معالجة الصيدلة السريرية، وعلم السموم، أو الاستمناع إيمونوكونجوجاتيس المستندة إلى القرون. ومع ذلك، نعتقد أن المستندة إلى القرون بيوكونجوجيشنز لديها القدرة على تغيير جذري بالطريقة إيمونوكونجوجاتيس يتم تصنيعه في المختبر وعيادة. في الوقت الحاضر، سوى المطبقة لدينا هذه التكنولوجيا الكيميائية لتطوير راديويمونوكونجوجاتيس للتصوير النووي وراديويمونوثيرابي، على الرغم من أن التحقيقات في الفائدة هذا النهج لبناء جسم-المخدرات يرتبط و ويجري حاليا الأدوية الجزيئية البيولوجية الأخرى. في النهاية، نأمل مخلصين أن هذا البروتوكول – ولا سيما الكيمياء واضحة وبسيطة أن وضعنا – سيساعد على تعزيز استخدام فينيلوكساديازوليل الميثيل سولفونيس للاقتران القائم على سلفهيدريل وحفز تحولاً في الميدان من ماليميديس إلى بدائل أكثر استقرارا وأكثر موثوقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور ساي كيران شارما للمحادثات مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
References
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -w, Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. III Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
