Summary
このプロトコルではポッド、phenyoxadiazolyl メチル スルホンに基づく生体分子、特に抗体のチオールに貨物のサイト選択的添付試薬の合成について述べる。また、合成とポッド ベアリング二官能性キレート剤とその活用モデル抗体の特性を説明します。
Abstract
マレイミド ベアリング二官能性プローブは、生体分子、特に抗体のチオール化合物の選択的変更のため何十年も採用されています。まだ染色によるチオエーテルのリンケージは、レトロなマイケル反応を受けることができるので、マレイミド基の抱合体は体内の限られた安定性を表示します。、これはもちろん、放射性ペイロードまたは循環のチオール軸受生体分子との交換のリリースにつながることができます。これらのプロセスの両方だけでなく、健康な臓器で高い放射能濃度を作り出すことができる活動の画像コントラストを減少させると低い治療率の結果、ターゲット組織内濃度を減少します。2018 年に我々 はモジュラー、安定して、簡単にアクセスできる phenyloxadiazolyl メチル スルフォン剤の作成を報告した-'ポッド' と呼ばれる — チオール ベースの bioconjugations のためのプラットフォームとして。サイト選択的 bioconjugations のポッド ベースが均質な明確で高い陽性と非常に安定した radioimmunoconjugates に再現性をもって、堅牢に作成することが明らか。さらに、臨床実験大腸癌のマウスモデルではこれらはサイト選択的に、マレイミド基により合成された放射性標識抗体と比較して展示はるかに優れた生体内でパフォーマンスに radioimmunoconjugates をラベルを示しています。動詞。このプロトコルではポッド、ユビキタスのキレート剤 DOTA (ポッド DOTA) の二官能性鞘軸受バリアントと HER2 標的抗体トラスツズマブにポッド DOTA の活用の創造の 4 つのステップの合成について述べる。
Introduction
放射性医薬品化学者長い選択性と両方の核のイメージングのための疾患のバイオ マーカー抗体の特異性を悪用して放射線療法1を対象としました。抗体のカイネティックスにはるかに最も一般的なアプローチはアミノ酸に radiolabeled 補欠分子族または radiometal のキレート剤の無差別な添付ファイルを前提と-最もよくリシン-免疫グロブリン (の構造の中図 1 a)2。この戦略は、確かに有効ですが、そのランダムなサイト固有の性質は、問題を作成できます。具体的には、伝統的な化反応アプローチを作り出す不十分な定義し、異種 immunoconjugates 何千もの生物学的および薬理学的特性3の独自のセットを持つ別の位置の混合物から成る。さらに、貨物を抗体の抗原結合ドメインに追加する場合、ランダム化反応の抗体の免疫反応性が低下します。
年これらの問題4,5を対処するためにさまざまな部位特異的、選択的化反応戦略が開発されてきました。これらの方法の最も一般的なマレイミド軸受プローブ (図 1 b) システインのスルフヒの結紮に依存します。IgG1 抗体には自然 4 鎖間ジスルフィド、染色によるチオエーテル結合を形成するマレイミドとマイケル付加反応を受けることができる無料のチオールを生成する選択的に還元することができますリンクが含まれます。チオールおよびマレイミド類の使用は確かに伝統的な方法は、以上の改善とさまざまなマレイミド軸受シントンと二官能性キレート剤が使用可能。ただし、この方法論にも深刻な制限があることに注意してくださいすることが重要です。マレイミド基 immunoconjugates 限られた安定性生体を展示は、チオエーテル リンケージがレトロなマイケル反応 (図 2)6,7,8,9,を受けることができるので10です。 これは、もちろん、放射性のペイロードまたは循環 (例えば、グルタチオン、アルブミン) のチオール軸受生体との交換のリリースにつながることができます。これらのプロセスの両方は、正常臓器の放射能濃度を増加、ターゲット組織、画像コントラストを減少させると低い治療率の結果で放射能濃度を減少できます。Tosylates、ブロモおよびヨード-アセチル ビニールについて検討11,12,13,など、これらの問題を回避するためにいくつかの代替チオール反応試薬が開発されています。14,15,16,17します。 ただし、これらの方法すべては広範な応用を妨げている制限があります。
約 5 年前、後半のカルロス ・用いる III スクリップス研究所の研究室は、非常に安定した連携 (図 1 と図 3) のチオール基の選択的形成用試薬として phenyloxadiazolyl メチルについて検討の使用を開拓18,19. 著者採用無料のシステインを含むために設計されたいくつかの抗体を変更するフルオレセインの phenyloxadiazolyl メチル スルフォン軸受バリアント最終的に類似しているより安定して immunoconjugates を生産マレイミド基のプローブを使用して作成された構造。この有望な仕事を見て、この技術を放射化学でやっとのことでのみ使用されていたがまだ使用されていないすべての二官能性キレート剤または radioimmunoconjugates20,21の合成に、多少びっくりしました.アプリケーション、ただし、この不足はすぐにより多くの意味を作り始めた: シグマ アルドリッチから試薬の調達でいくつかの試みと分解物の複雑な混合物の領収書で起因した < 目的化合物の 15%。さらに、自分自身で報告されている試薬を合成現実的なオプションでもなかった、公開された合成ルートは面倒です高度な有機化学の機器が必要とするほとんどの放射化学、分子イメージング研究所-我々 を含む、単に持っていません。
これらの障害に対し、簡単にアクセスできますを作成し、安定した堅牢かつ合理的に安易な合成経路を介して取得することができます phenyloxadiazolyl メチル スルフォン試薬に着手しました。今年、我々 はモジュラー、安定して、簡単にアクセスできる phenyloxadiazolyl メチル スルフォン剤の作成を報告した-'ポッド' と呼ばれる — チオール ベース bioconjugations (図 1 と図 3)22のためのプラットフォームとして。ポッドと試薬の主な違いは、用いる、によって報告されたらは前者、後者は同じ位置 (図 4) フェノール設備 phenyloxadiazolyl メチル スルホン基に接続されているアニリン リングを採用します。この変更より簡単かつアクセス可能な合成ルートを容易と同様、市販化合物と私たちの経験が象徴的な場合-より安定した最終的な試薬。この作品もポッド ベアリング二官能性キレート剤のペアが合成。-ポッド DFO とポッド CHX A ''-DTPA — それぞれ89Zr- 177Lu ラベル radioimmunoconjugates の作成を容易にします。説明するようサイト選択的 bioconjugations のポッド ベースが均質な明確で高い陽性と非常に安定した radioimmunoconjugates に再現性をもって、堅牢に作成することを確認しました。さらに、大腸癌のマウスモデルでの臨床実験はこれらサイト選択的にラベルが付いている radioimmunoconjugates 展示マレイミド基により合成された放射性標識抗体と比較して優れた体内のパフォーマンスを示しています。動詞。
この作品のアーチの目標明確に定義された、均一な非常に安定した、高度陽性 immunoconjugates in vitro および in vivo のアプリケーションの作成を容易にすることです。合成のアプローチはシンプルなほぼすべての研究室では、実行して別のキレート剤、蛍光物質、または貨物の茄多で親ポッド試薬を変更できます。このプロトコルとそれに伴うビデオ、ポッド (図 5) の簡単な 4 つのステップの合成について述べるDOTA、 64Cu の調整、 68Ga、 111、 177Lu 225Ac (図 6) に広く使われているキレート剤のポッド軸受けバリアントの作成さや DOTA のモデル抗体陽性、HER2 標的特異的な IgG1 トラスツズマブ (図 7) に化反応。
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Protocol
1. 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1) の合成
注: 化合物の光感受性のため、ホイルで覆われた容器にすべての反応をしてください。
- 10 mL の丸底フラスコに、3 mL のメタノールで 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol の 100 mg (0.517 モル、1 相当) を解散します。
- このソリューションでは、追加の diisopropylethylamine 360 μ L (DIPEA; 2.07 モル; 4 同等; 無水) と小型の電磁攪拌棒。ゴム栓付けフラスコをカバーし、室温で 10 分間ソリューションをかき混ぜます。
- 1 mL のガラス製注射器を使用すると、ゴム栓に穴を開けないし、すぐにこの混合物にヨードメタンの 32 μ L (0.517 モル、1 相当) を追加します。45 分間室温で反応混合物を許可します。
メモ: ヨードメタンの潜在的な有害な影響のためこの反応は化学発煙のフード実行する必要があります。 - ロータリーエバポレーターの風呂の水を 40 ° Cに設定し、ゆっくり減圧する白色固体を余裕に溶媒を除去します。
- 3 ml の酢酸エチルの固体を溶解し、, 目標到達プロセスを使用して 0.1 M 炭酸ナトリウム 5 mL ソリューションで、少なくとも 3 回を洗います。
注: 定期的にかかる; 紫外線ランプの下で水相のスポット テストランプの下で何も見られて、一度洗浄を停止できます。 - 漏斗で有機相を収集し、水様段階の pH が 6.8 7.0 まで水で洗って (ph 試験紙を使用して)。
- 有機相を収集し、水の痕跡を削除する硫酸マグネシウムを追加します。
注: 硫酸マグネシウムは、小さいヘラを使って、その後解決策を旋回する必要があります追加する必要があります。乾燥剤の微粒子はまだ見られます、ソリューションは乾燥です。ない場合は、微粒子を見ることができるまで、少量の硫酸マグネシウムを追加します。 - 培地ガラス釉薬またはろ紙を使用して混合物をフィルター処理します。
- ロータリーエバポレーター、白い針として望ましいプロダクトを作り出すべきであるプロセスを使用して揮発性物質を蒸発させます。
2. tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl の合成] カルバミン酸 (2)
注: 化合物の光感受性のため、ホイルで覆われた容器にすべての反応をしてください。
- 25 mL の丸底フラスコに、387 mg (0.92 ミリ モル、1.0 に相当) の NBoc-n ′-サクシニル-4,7,10-trioxa-1, 13-tridecanediamine ジクロロ メタン 10 mL で溶解します。
- このソリューションに 480 μ L を追加 (2.76 ミリ モル、3 同等) DIPEA の N の 264 mg (1.38 ミリ モル; 1.5 同等物)-エチル - n ′-[3-(ジメチルアミノ) プロピル] カルボジイミド塩酸塩 (EDCI)、および1の 200 mg (0.97 モル、1.1 対応)。ガラス栓の容器を密封し、常温で 5 日間攪拌反応をしましょう。
注: ジクロロ メタンの蒸発の留意してください。必要な場合は、週を通してより追加します。 - 1 M 塩酸 (3 x 5 mL) 溶液で, 目標到達プロセスで混合物を洗浄します。
- 有機相を収集し、続ける, 漏斗、最初 1 M Na2CO3 (2 x 5 mL) のソリューションと、水 (3 x 5 mL) で洗浄します。
- 有機相を収集し、水の痕跡を削除する硫酸マグネシウムを追加 (ステップ 1.7 を参照)。培地ガラス釉薬またはろ紙を使用して混合物をフィルター処理します。
- ロータリーエバポレーターを使用してには、オフホワイトの固体を余裕に減圧下での揮発性の溶剤を削除します。
- 酢酸エチル 10 mL でこの固体を再溶解し、シクロヘキサン 30 mL を徐々 に (例えば、一度に 2 mL) 添加による製品の沈殿物します。
- フィルター紙や白い粉として製品を取得する培地ガラス釉薬のソリューションをフィルター処理します。
3. tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl の合成] カルバミン酸 (3)
注: 化合物の光感受性のため、ホイルで覆われた容器にすべての反応をしてください。
- 10 mL の丸底フラスコ2ジクロロ メタンの 4 mL の 30 mg (0.05 モル; 1 相当) を解散します。
- 徐々 49 mg (0.2 モル; 4 相当) 70% m chloroperbenzoic 酸のこの混合物に追加し、ガラス栓の反応容器をカバーします。一晩常温で黄色の混合物を最終的にもたらすソリューションをかき混ぜます。
- まず NaOH (3 x 5 mL) の 0.1 M の溶液とし、水 (3 x 5 mL), 漏斗に黄色の混合物を洗います。
- 乾燥硫酸マグネシウムと有機相と培地ガラス釉薬またはろ紙を使用して混合物をフィルターします。
- ロータリーエバポレーターを使用して、薄い固体として製品を取得する減圧下で溶媒を削除します。
4. N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] フェニル} succinamide (ポッド) の合成
- 25 mL の丸底フラスコに、ジクロロ メタンの 2.0 mL の3の 30 mg を溶解します。
- トリフルオロ酢酸の 400 μ L を追加し、ガラス栓付けフラスコを密封します。
- 3 時間室温で反応混合物をかき混ぜなさい。
- ロータリーエバポレーターを使用して、油性残留物を残して、室温で減圧下で揮発性物質を削除します。
- 7 mL の水に油性残留物を溶解し、酢酸エチル (3 x 4 mL) で洗浄, 目標到達プロセスを使用して。水層を維持します。
- 白い粉とポッドを余裕に水層を凍結乾燥します。
注: 280 と 298 nm のさやをモル吸光係数は、9,900 と 12,400 cm-1M-1、それぞれ。
5. ポッド DOTA の合成
- 1.5 mL 容マイクロ チューブ 300 μ L ジメチルスルホキシド (0.018 ミリ モル; 1 に相当) のでポッドの 10 mg を溶解し、26 μ l 中、N, N-diisopropylethylamine (0.15 ミリ モル; 8 同等物) を追加します。
- ジメチルスルホキシドの 100 μ l DOTA Bn NCS (0.02 モル; 1.2 同等) の 15.2 mg を溶解し、ステップ 5.1 からソリューションでこのソリューションを組み合わせます。遠心チューブをシールします。
- 室温で一晩インキュベートする反応を許可します。
- 逆相 C18高速液体クロマトグラフィー クロマトグラフィーを使用して任意の未反応 DOTA-Bn-NCS を削除する製品を浄化します。
注: 保持時間は (ポンプ、列、チューブ、等)、各研究室の高速液体クロマトグラフィー装置明らかに大きく依存しており、適切なコントロールが浄化する前に実行する必要があります。ただし場合 5: 95 MeCN/H2O のグラデーション、例が存在する (両方 0.1 %tfa) 70: 30 MeCN/H2O を (0.1% の両方 TFA) セミ分取 19 x 250 mm C18列と 6 mL/min の流速が使用されますように 30 分以上、ポッド、p-SCN-Bn-土田とポッド DOTA はそれぞれ 19.6 分、18.8、14.4 の保持時間があります。すべての 3 つの化合物は、254 でモニターできる nm。
トラスツズマブにポッド DOTA の 6 化反応
注: この手順では、我々 はトラスツズマブの 16.4 mg/mL の原液を開始しました。
- 低蛋白結合 1.5 mL 遠心チューブにリン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) 859 μ L のトラスツズマブの原液 (1 mg; 6.67 nmol、1 相当) の 61 μ L を希釈します。
- この混合物に、たて 10 ミリメートルのソリューションの TCEP の H2O (66.7 nmol、10 同等) 6.7 μ L を追加します。
- DMSO のポッド DOTA の 1 mg/mL の溶液を準備、このポッド DOTA ソリューションの 73 μ L を反応混合物 (66・67 nmol、10 同等) に追加します。
- 遠心管を密封し、室温で 2 時間インキュベートするソリューション。
- 2 時間後、あらかじめパックされた使い捨てサイズ排除脱塩カラムを用いる・免疫を浄化します。
- 最初に、貯蔵中防腐剤すべて列に存在を削除するサプライヤーのとおりサイズ排除コラムを平衡させ。典型的なプロシージャを含む 5 回列のボリュームに対応する PBS のボリュームと列の洗浄: 5 x 2.5 mL の PBS。
- 次に、反応混合物の量を注意してサイズ除外] 列に反応混合物を追加します。
- 反応混合物が列を入力列に追加ソリューションの総容積をもたらすに PBS の適切な量を追加 2.5 mL。たとえば、抱合反応 1.3 mL の容量の場合は、1.2 mL の追加の PBS は、列に追加する必要があります。
- 最後に、溶離液 2 mL の PBS を使用して製品を収集します。
- 50 kDa の分子量カットオフと遠心ろ過ユニットの最終・免疫を集中します。
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Representative Results
このプロトコルの最初の 4 つのステップ-ポッドの合成-信頼性の高い、堅牢な設計されています。脱プロトン化および目的によるチオエーテルの製品を形成する 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol の置換 affords のチオエーテル > わずか 45 分後 99% の利回り。次に、標準的なペプチド カップリング法、55% で得られる (2) 製品のコレクションの結果を介して結紮術1間と N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine を実現しました。その後、 2の酸化は、%m-酸、広く使用されている酸化剤を用いて行われた.洗濯の手順3 〜 90% の収率で薄い固体として得た。最後に、dichloromethane:trifluoroacetic 酸の比率は 4:1 を使用して、標準的な手順に従って3から tert butyloxycarbonyl 保護基の除去が行われていた。当社の製品は、水相の凍結乾燥後-ポッド-98% で得られる白色の粉末として得られました。薄層クロマトグラフィによる反応の進行が続いたし、 1H nmr 法、 13C 核磁気共鳴、HRMS ESI (表 1) を介して各製品の id を確認しました。
ポッド試薬の主な利点の 1 つは、そのモジュールです。さまざまなキレート剤、fluorophores が付いて、毒素、または他の貨物は、化合物のペンダントを追加できます。プロトコル一方で、代表的なペイロードとしてユビキタス キレート剤 DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-四酢酸) を用いています。DOTA、もちろん、使用されています生体分子放射性医薬品の広い範囲で、キレート剤として68Ga、 64Cu、 111、 90Y、 177Lu を含む radiometals のためと225Ac。この目的のための DOTA (p-SCN Bn-DOTA) のイソチオ シアン酸軸受バリアントは採用、簡単な結合条件を介してポッドのペンダントのアミンと結合しました。結果二官能性キレート剤、逆相 C18高速液体クロマトグラフィーによる精製され ~ 75% の収率で分離されました。他の前駆物質と同様薄層クロマトグラフィによる反応の進行が続いた、 1H nmr 法、 13C 核磁気共鳴、HRMS ESI (表 1) を介して製品のアイデンティティを確認しました。
プロトコルの最後のステップでモデルの免疫グロブリン、HER2 標的抗体トラスツズマブにポッド DOTA のサイト選択化反応について述べる。このため、抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合は、減水剤 TCEP を選択的に還元 [tris(2-carboxyethyl) ホスフィン]。この削減ステップ抗体はポッド DOTA に室温で 2 時間インキュベート、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した後。この場合、~ 80% の収率で得られた精製、DOTA ベアリング ・免疫、Maldi-tof 解析表示 (DOL) ~1.8 DOTA/mAb の程度を明らかにしました。一般的に言えば、我々 は TCEP、ポッド試薬と 2 時間培養の 10 の同等の同等の 10 が 2 ポッド/mAb (表 2) の DOL で・免疫を生成するための十分なことを発見しました。この結果は、ヒト、ヒト、およびキメラの IgG1 抗体; の範囲で一定します。ただし、同じ条件は、マウス IgG1 抗体を操作するときだけ ~1.5 の DOL で immunoconjugates を生成します。このすべては、研究者は新しい抗体とポッド軸受け貨物のためのこれらの反応条件を最適化する必要がありますと述べた。最後と重要なは、最終製品に関して繰り返しおよび再現性をもって見出したポッド ベースの immunoconjugates がランダムまたはマレイミド基を使用して作成された類似構造以上の成績を示すこと活用戦略。
図 1:アミン反応性、(B) マレイミド-軸受、(A) と (C) ポッド軸受け貨物を使用して bioconjugations の模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:マイケル (緑) チオール軸受生体分子標識ナノ診断として radiolabeled コンストラクトは、内因性の存在下で受けることができる追加の反応を形成する放射性核種軸受マレイミド (イエロー) 添加チオール軸受分子 (ピンク)。RT = 温度。図 Adumeau、p.、ダビドフから許可を得て転載・ Zeglis、作成のサイト選択的に修正 Radioimmunoconjugates の向上安定のため B. M. チオール反応性官能キレート剤。ナノ診断化学。291364-1372 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:ポッドとチオールとの反応の模式図。図 Adumeau、p.、ダビドフから許可を得て転載・ Zeglis、作成のサイト選択的に修正 Radioimmunoconjugates の向上安定のため B. M. チオール反応性官能キレート剤。ナノ診断化学。291364-1372 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:ポッド(A)と(B)の構造、試薬は用いるら18,19によって報告されたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:ポッドの 4 段階合成の方式です。図 Adumeau、p.、ダビドフから許可を得て転載・ Zeglis、作成のサイト選択的に修正 Radioimmunoconjugates の向上安定のため B. M. チオール反応性官能キレート剤。ナノ診断化学。291364-1372 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:ポッド DOTA の合成の方式です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7:ポッド DOTA にトラスツズマブの化反応の方式です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8:89ポッド ベース (89Zr-DFO-さや-huA33) とマレイミド基 (89Zr-DFO-マル-huA33) 化反応戦略を使用して作成された huA33 の Zr ラベル radioimmunoconjugates の生体内での挙動の比較。(左) 平面と A33 抗原を表現する SW1222 大腸癌異種移植片 (白い矢印) 89Zr-DFO-さや-huA33 と89の注入無胸腺ヌードマウスの最大強度投影 (右) ペット画像Zr-DFO-マル-huA33 (140 µCi、60-65 μ g)。コロナのスライスには、腫瘍の中心部が交差します。図 Adumeau、p.、ダビドフから許可を得て転載・ Zeglis、作成のサイト選択的に修正 Radioimmunoconjugates の向上安定のため B. M. チオール反応性官能キレート剤。ナノ診断化学。291364-1372 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9:89ポッド ベース (89Zr-DFO-さや-huA33) とマレイミド基 (89Zr-DFO-マル-huA33) 化反応戦略を使用して作成された huA33 の Zr ラベル radioimmunoconjugates の生体内での挙動の比較。89Zr-DFO-さや-huA33 と89A33 抗原を表現する皮下 SW1222 ひと大腸癌の異種無胸腺ヌードマウスに Zr-DFO-マル-huA33 (30 µCi、15-18 μ g) の投与後の体内データ。胃、小腸、大腸の値には、内容が含まれます。図 Adumeau、p.、ダビドフから許可を得て転載・ Zeglis、作成のサイト選択的に修正 Radioimmunoconjugates の向上安定のため B. M. チオール反応性官能キレート剤。ナノ診断化学。291364-1372 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 化合物 | 1H NMR シフト | 13C NMR シフト | 人事管理システム | |||
| 1 | (500 MHz、CDCl3) 7.79 (2 H、d、J = 8.5 の Hz)、6.72 (2 H、d、J = 8.5 の Hz)、4.04 (2 H, br s)、2.75 (3 H, s) | (125 MHz、CDCl3) 166.3, 163.7, 149.7、128.5、114.8、113.5, 14.8 | m/z+[C9H9N の3OS + H] Calcd: 208.0539;見つかりました: 208.0539;Δ: 0.0 ppm | |||
| 2 | (500 MHz、CDCl3) 9.68 (1 H, s)、7.91 (2 H、d、J = 9.0 Hz)、7.71 (2 H、d、J = 8.5 Hz)、6.82 (1 H, s)、4.99 (1 H, s) 3.70 3.45 (12 H、m)、3.41 (2 H、q、J = 6.0 Hz)、3.20 (2 H、q、J = 6.5 Hz)、2.76 (3 H, s)、2.71 (2 H, m)、2.63 (2 H、m)、1.80 1.70 (4 H、m)、1.42 (9 H, s) | (125 MHz、CDCl3) 172.6, 171.3、165.8、164.6、156.2, 141.8、127.7、119.6、118.6、79.2、70.6、70.5、70.3、70.1、69.6、38.8、38.5、33.5、31.6、29.9、28.6、14.8 | m/z Calcd [C28H43N5O8S + Na]+: 632.2725;見つかりました: 632.2722;Δ:-0.470 ppm | |||
| 3 | (500 MHz、CDCl3) 9.99 (1 H, s)、7.98 (2 H、d、J = 9.0 Hz)、7.75 (2 H、d、J = 8.5 Hz)、6.88 (1 H, s)、4.99 (1 H, s) 3.66 3.50 (15 H、m)、3.41 (2 H、q、J = 6.0 Hz)、3.20 (2 H、q、J = 6.5 Hz)、2.71 (2 H, m)、2.65 (2 H, m)、1.80 1.70 (4 H、m)、1.43 (9 H, s) | (125 MHz、CDCl3) 172.6、171.5、166.5、161.6、156.1、143.4、128.7、119.6、1,164億、79.1、70.5、70.4、70.2、70.0、69.4、43.0、38.8、38.4、33.2、31.3、29.7、28.4 | m/z +[C28H43N5O10S + H] Calcd: 642.2803;見つかりました: 642.2797;Δ:-0.930 ppm | |||
| ポッド | (500 MHz、D2O) 7.85 (2 H、d、J = 9.0 Hz) 7.55、(2 H、d、J = 8.5 Hz)、3.60 3.45 (15 H、m) 3.45 (2 H、t、J = 6.5 Hz)、3.20 (2 H、t、J = 6.5 Hz) 3.04、(2 H、t、J = 7.0 Hz)、2.67 (2 H、t、J = 6.5 Hz)、2.54 (2 H、t、J = 6.5 Hz)、1.87 (2 H, qt, J = 6.5 Hz)、1.70 (2 H、qt、J = 6.5 Hz) | (125 MHz、D2O) 174.5、173.2、166.8, 161.4、142.2、128.6、120.3、116.6、69.4、69.4、69.3、69.2、68.2、68.2、42.5、37.6、36.2、31.9、30.7、28.2、26.4 | m/z +[C23H35N5O8S + H] Calcd: 542.2279;見つかりました: 542.2281;Δ: 0.37 ppm | |||
| ポッド DOTA | (600 MHz、DMSO d6) 10.46 (1 H, s)、9.74 (1 H, bs)、8.04 (2 H、d、J = 8.6 Hz)、7.99 (1 H, s)、7.90 (1 H、t、J = 5.0 Hz) 7.86、(2 H、d、J = 6.5 Hz)、7.44 (2 H、d、J = 7.9 Hz)、7.24 (2 H、d、J = 7.1 Hz)、4.35 2.41 (45 H、m)、3.70 (3 H, s)、1.76 (2 H、q、J = 6.3 Hz)、1.61 (2 H、q、J = 6.5 Hz) | (125 MHz、DMSO d6) 171.8、171.4、166.1、162.2、158.8、158.6、129.8、129.0、127.6、123.3、119.5、1,185億、116.5、1,164億、70.2、70.1、70.0、68.7、68.5、43.4、41.8、36.3、32.2、30.4、29.8、29.1 | m/z [C47H68N10O16S2+ H] Calcd+: 1093.4334;見つかりました: 1093.4327;Δ:-0.640 ppm | |||
表 1.合成中間体の特性データは、莢や莢 DOTA 説明します。
| 抗体 | タイプ | 一定の地域 | さや: mAb の比率 |
| ひと血漿 IgG | 人間 | ヒト IgG します。 | 2.1 ± 0.1 |
| トラスツズマブ | ヒト化 | ヒト IgG1 | 2.0 ± 0.1 |
| huA33 | ヒト化 | ヒト IgG1 | 2.1 ± 0.1 |
| セツキシマブ | キメラ | ヒト IgG1 | 2.2 ± 0.1 |
| AR 9.6 | マウス | マウス IgG1 | 1.4 ± 0.1 |
| マウス血漿 IgG | マウス | マウス IgG します。 | 1.5 ± 0.1 |
表 2.ポッド軸受け fluorophore と活用、次別の抗体の分類の程度。値には、標準偏差が表示されます。テーブル Adumeau、p.、ダビドフから許可を得て転載・ Zeglis、作成のサイト選択的に修正 Radioimmunoconjugates の向上安定のため B. M. チオール反応性官能キレート剤。ナノ診断化学。291364-1372 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。
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Discussion
本報告で我々 は radiolabeling や生体内で実験の任意のプロトコルを含むことができない分野します。理由は、簡単です。前者に関してポッド ベース ・免疫のカイネティックス違いはありませんまったく他化反応戦略を使用して合成・に免疫のと手順が総合的にされている他の2 の見直し.後者に関して、臨床生体実験 (すなわち、マウスモデル、用量等) の具体的なアプリケーションと抗体/抗原システムによって広く異なることができます。
HuA33 の89Zr ラベル バリエーションを持つ我々 の前の調査は、ポッド ベースの bioconjugations の利点の魅力的なイラストを提供します。HuA33 は A33 抗原、膜貫通糖蛋白質の表現を対象とヒト IgG1 抗体 > 大腸癌23,24の 95%。私たち以前原稿22、 89Zr DFO huA33 radioimmunoconjugate 両方ポッドとマレイミド基化反応戦略を使用しての合成を報告します。2 標識抗体- 89Zr-DFO-さや-huA33 と89Zr-DFO-マル-huA33-ほぼ同じ収量、純度、特異性活動、免疫活性で作り出されました。批判的に、ただし、2 つの radioimmunoconjugates 展示ひと血清で劇的に異なる安定性: 37 ° C で 7 日間培養後89Zr-DFO-さや-huA33 86 ± 1% がそのまま残って、そのいとこは、マレイミド基はのみ 61 ± 5%そのまま。ペットの in vivo イメージングと A33 抗原を表現する SW1222 ひと大腸癌異種移植片明らかに明確な違いが (図 8およびの 2 つの radioimmunoconjugates の生体内での挙動の無胸腺ヌードマウスにおける体内実験図 9)。89Zr-DFO-さや-huA33 と89Zr DFO-マル huA33 生産高活性腫瘍組織内濃度: 56.4 ± 6.9%ID/g と 49.6 ± 9.3%ID/g、投与後それぞれ、48 h。しかし、マレイミド基 radioimmunoconjugate はポッド ベースのエージェントよりも健全なティッシュの有意に高い放射能濃度を生産しました。たとえば、 89Zr DFO-マル huA33 生産 3.1 の放射能濃度 ± 0.5、2.7 ± 0.4 と 12.2 ± 0.4 %id/g、腎臓、肝臓、骨、それぞれ、120 h 後注入で値の放射能濃度を大幅に超える同じ組織で89Zr-DFO-さや-huA33 によって生成される (1.4 ± 0.1、0.3、および 4.3 1.2 ± ± 0.6 %id/g)。確かに、 89Zr-DFO-さや-huA33 は、120 h 89Zr-DFO-マル-huA33 と比較して投与後で (大きい腸) を除くすべての非標的組織に低放射能濃度を生産しました。その結果、 89Zr-DFO-さや-huA33 の腫瘍-器官の活動の濃度比が一般的に優れている89Zr-DFO-マル-huA33;特に、腫瘍の肝臓、腫瘍・脾臓、腎臓に腫瘍と腫瘍-骨放射能濃度比は、マレイミド由来のいとこと比較してポッド ベース ・免疫の約 2 倍。2 つの radioimmunoconjugates の主要な相違が、キレート剤の化反応ハンドルを考慮した、ポッド-チオール結合の安定性の向上はほぼ確実にこの生体内でパフォーマンスを向上させる責任があります。
広範なビューを取って、抗体内のリシンにプローブのサイト非選択的化反応は確かに抗体の修飾する簡単かつ安易なアプローチです。ただし、免疫グロブリンの構造全体に分散複数のリシンの存在を意味する正確なサイトや化反応2の程度を制御することが可能です。結果として、このランダム戦略はしばしば不十分な定義を生成し、表わすことができる非常に異種の immunoconjugates および抗原結合ドメイン3で発生した場合に免疫を減少しました。化反応のサイト選択的アプローチの利点は、両方の radioimmunoconjugates の繰り返し示されているし、抗体薬物複合体8,14,25,26, 27,28,29,30。一言で言えば、だけでなくサイト選択化反応戦略生成より明確に定義された、従来の方法論よりも均一な immunoconjugates は、彼らも作成イメージング エージェント、radioimmunotherapeutics、および Adc 生体内で性能を向上させた。まだどこポッド ベースを立つの比較で他のサイト選択の変更の戦略に?一般に、抗体の選択的修飾へのアプローチは 4 つのカテゴリに分類できます: (1) システイン残基、重鎖糖鎖、(3) 化学的酵素変換、および (4) 利用の (2) の操作を遺伝子工学4,5。もちろん、この分類システムは完璧ではない、必然的に 2 つのカテゴリの資格いくつかのアプローチ (例えば、酵素と重鎖糖鎖の修正)。各戦略は、独自の長所と短所を持っています。遺伝子工学・ ベースのアプローチは、まだ彼らは複雑で高価な31,32,33活用のサイト絶妙な制御を提供します。重鎖糖鎖を酸化的カップリングが安価な簡単なまだ免疫グロブリン34,35,36,37 の構造の整合性に酸化的損傷を危険にさらします。 ,38。
チオール系 bioconjugations の主な利点-ポッドが含まれて-そのシンプルさとモジュールは。彼らの主要な制限は、他の一方で、抗体、活用の両方のサイトを制御性と抗体あたりの変更の数を減らす特色内複数チオール化合物の存在から生じています。この意味で、チオール基をフリーのシステイン残基を保有する遺伝子組み換えされている抗体の組み合わせは、特に魅力的なアプローチです。前にも触れましたが、マレイミド基のチオールの別の制限はレトロなマイケル付加体内染色によるチオエーテル結合の感受性。まだ批判的に、ポッドの使用はこの問題を放棄します。
前に締結、ポッド技術の創発的性質が障害物の独自のセットを作成することに重要です。たとえば、ポッド ベアリング二官能性キレート剤は (現在)、市販、臨床薬理学、毒物学、またはポッド ベース immunoconjugates の免疫原性を示すデータがないです。ただし、ポッド ベース bioconjugations immunoconjugates 研究所とクリニックの両方で合成される方法を根本から変える可能性があることと考えています。現時点では、我々 だけ技術を応用してこの化学核および放射免疫療法、radioimmunoconjugates の開発に抗体医薬の建設のためのこのアプローチの捜査ユーティリティが抱合体が、他の生体分子薬は現在進行中であります。最後に、我々 はひたすら期待してこのプロトコル — と特に簡単で、単純な化学を開発した-スルフヒ ベース動詞 phenyloxadiazolyl メチルについて検討の利用促進し、からフィールドでシフトに拍車をかけるを助ける安定した、信頼性の高い選択肢とマレイミド。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は博士サイ キラン シャルマの役に立つ会話をありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
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