Summary
Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.
Abstract
A modificação pós-tralácida das proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos celulares. Após a digestão tripé de proteínas ubiquitinadas, peptídeos com um remanescente diglíino conjugado ao grupo epsilon amino de lysina ('K-ε-diglycine' ou simplesmente 'diGly') podem ser usados para rastrear o local original de modificação. A imunopurificação eficiente dos peptídeos diGly combinados com a detecção sensível por espectrometria de massa resultou em um enorme aumento no número de locais de ubiquitinação identificados até o momento. Fizemos várias melhorias neste fluxo de trabalho, incluindo o fracionadode em fase inversa de pH off-line de peptídeos antes do procedimento de enriquecimento, e a inclusão de configurações mais avançadas de fragmentação de peptídeos no multipólo de roteamento de íons. Além disso, a limpeza mais eficiente da amostra usando um plugue baseado em filtro para reter as contas de anticorpos resulta em uma maior especificidade para peptídeos diGly. Essas melhorias resultam na detecção rotineira de mais de 23.000 peptídeos diGly de células cancerígenas do colo uterino humano (HeLa) sobre a inibição proteasome na célula. Mostramos a eficácia dessa estratégia para análise aprofundada dos perfis ubiquitino dos vários tipos de células diferentes e de amostras in vivo, como tecido cerebral. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina proteica para descobrir a ubiquitinome celular profunda.
Introduction
A conjugação de ubiquitina às proteínas marca-as para a degradação pelo proteasome e é um processo crucial na proteostasis. O grupo carboxyl c-terminal de ubiquitina forma uma ligação isopeptídeo com o grupo lysine ε-amino da proteína alvo1,2. Além disso, a ubiquitina pode ser anexada a outros módulos de ubiquitina, resultando na formação de estruturas homogêneas (ou seja, K48 ou K11) ou ramificadas (i.e., heterogêneas ou mistas) estruturas de poliubiquitina1,3. A função mais conhecida da ubiquitina é seu papel na degradação proteasômica, mediada pela poliubiquitina ligada ao K48. No entanto, tornou-se claro que tanto a mono- como a poliubiquitina também desempenham papéis em muitos processos que são independentes da degradação pelo proteasome. Por exemplo, as cadeias ligadas ao K63 têm papéis não degradativos no tráfico intracelular, degradação lisossômica, sinalização de quinase e resposta de dano de DNA4,5. Os outros seis tipos de ligação são menos abundantes e seus papéis ainda são em grande parte enigmáticos, embora as primeiras indicações sobre suas funções na célula estejam surgindo, em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas para permitir a detecção específica de ligação6,7.
A espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável para análises de proteome e hoje em dia milhares de proteínas diferentes de praticamente qualquer fonte biológica podem ser identificadas em um único experimento. Uma camada adicional de complexidade é apresentada por modificações pós-traduções (PTMs) de proteínas (por exemplo, fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação) que podem modular a atividade proteica. A identificação em larga escala de proteínas portadoras de PTM também foi possível graças aos desenvolvimentos no campo de espectrometria de massa. A estequiometria relativamente baixa de peptídeos portadores de PTMs em comparação com suas contrapartes não modificadas apresenta um desafio técnico e passos de enriquecimento bioquímico são geralmente necessários antes da análise de espectrometria de massa. Ao longo das últimas duas décadas, vários métodos específicos de enriquecimento foram desenvolvidos para a análise de PTMs.
Devido aos papéis multifacetados da ubiquitina proteica na célula, há uma grande demanda para o desenvolvimento de métodos analíticos para a detecção de locais de ubiquitina em proteínas8. A aplicação de métodos espectrométricos de massa levou a uma explosão do número de locais de ubiquitina identificados em proteínas de mosca-das-frutas, camundongos, humanos e leveduras99,10,,11,,12,,13,,14. Um passo importante foi apresentado pelo desenvolvimento de estratégias de enriquecimento baseadas em imunoprecipitação no nível do peptídeo usando anticorpos direcionados contra o motivo remanescente k-ε-GG (também referido como "diglycine" ou "diGly"). Estes peptídeos diGly são produzidos após a digestão de proteínas ubiquitinas usando tripsina como protease15,16.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado para enriquecer para peptídeos diGly usando imunopurificação e detecção subseqüente por espectrometria de massa orbitrap. Usando uma combinação de várias modificações dos fluxos de trabalho existentes, especialmente nas fases de preparação da amostra e espectrometria de massa, agora podemos identificar rotineiramente mais de 23.000 peptídeos diGly de uma única amostra de células HeLa tratadas com um proteasome inibidor e ~10.000 de células HeLa não tratadas. Aplicamos este protocolo a lysates de rotulagem de isótopos não rotulados e estáveis com aminoácidos na cultura celular (SILAC) rotulados células HeLa, bem como a amostras endógenas, como tecido cerebral.
Este fluxo de trabalho apresenta uma valiosa adição ao repertório de ferramentas para a análise de locais de ubiquitina, a fim de descobrir a ubiquitinome profunda. O protocolo a seguir descreve todas as etapas do fluxo de trabalho em detalhes.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (EDC) da Erasmus MC.
1. Preparação da amostra
- Células cultivadas
- Selecione uma linha de interesse celular (por exemplo, HeLa ou osteossarcoma [U2OS]) e crie as células no Minimal Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complementada com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina.
- Para experimentos de proteômica quantitativa, as células de cultura no DMEM não possuem arginina e lysina. O meio deve ser suplementado com soro bovino fetal dialisado de 10% (FBS), 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina e alanina-glutamina. Faça dois tipos de mídia adicionando lysina convencional e arginina ('Light' Medium) ou lysine-8(13C6; 15N2) e arginina-10(13C6; 15N4) ('Heavy' Medium), respectivamente.
- Lotes de culturas de células em Meio Leve (ou seja, sem rótulo) e Meio Pesado (ou seja, rotulado, SILAC) para pelo menos seis duplicações antes da expansão e tratamento para garantir que todas as proteínas da cultura Heavy Medium sejam rotuladas com isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo Aminoácidos.
- Trate as células por 8 h com 10 μM do inibidor proteasome bortezomib ou um volume equivalente de DMSO como um tratamento simulado. Lave as células com PBS, dissocie-as usando 1% de tripsina/EDTA e pelota as células.
- Lyse a pelota celular de uma placa de cultura de 150 cm2 por condição testada em 2 mL de gelo frio 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) com 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC). Ferva o lysate a 95 °C por 5 min e sônica por 10 min (ajuste "H" para o sônico listado na Tabela de Materiais) a 4 °C. Não recomendamos o uso de inibidores de deubiquitinase como n-etilmaleimida (NEM), pois isso pode introduzir modificações proteicas indesejadas que podem complicar a identificação de peptídeos.
- Tecido cerebral in vivo
- Ao utilizar tecido in vivo, lite o tecido em um tampão frio de gelo contendo 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM de sódio DOC e 12 mM de sódio N-lauroylsarcosinato17. Sonice o lysate por 10 min (ajuste "H" para o sônico listado na Tabela de Materiais) a 4 °C e ferva o lysato por 5 min a 95 °C.
- Quantificar a quantidade total de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA de absorção colorimétrica. A quantidade total de proteína deve ser de pelo menos vários miligramas para uma imunoprecipitação de peptídeos diGly bem sucedida (IP). Para os experimentos SILAC, misture as proteínas leves e pesadas rotuladas em uma razão 1:1 com base na quantidade total de proteínas.
- Reduza todas as proteínas usando 5 mM 1,4-dithiothreitol por 30 min a 50 °C e, posteriormente, alquila-las com iodoacetamide de 10 mM por 15 min no escuro. Realizar digestão proteica com Lys-C (proporção enzima-substrato de 1:200) por 4 h seguido de digestão noturna com tripsina (razão enzima-substrato de 1:50) a 30 °C ou à temperatura ambiente (RT).
- Adicione ácido trifluoroacético (TFA) à amostra digerida a uma concentração final de 0,5% e centrifugue a amostra a 10.000 x g por 10 min, a fim de precipitar e remover todo o detergente. Coletar o sobrenadante contendo os peptídeos para fracionamento subseqüente.
2. Fracionamento de peptídeos offline
- Use cromatografia de fase reversa de pH alto (RP) c18 com material de fase estacionária polimérico (300 Å, 50 μM; ver Tabela de Materiais) carregado em um cartucho de coluna vazio para fracionar os peptídeos tripés. O tamanho do leito de fase estacionária deve ser ajustado à quantidade de proteína digerível a ser fracionado. Prepare um cartucho vazio de coluna de 6 mL (ver Tabela de Materiais) preenchido com 0,5 g de material de fase estacionária para ~10 mg de digestão de proteínas. A relação proteína digesta a fase estacionária deve ser de aproximadamente 1:50 (c/w).
- Carregue os peptídeos na coluna preparada e lave a coluna com aproximadamente 10 volumes de coluna de 0,1% TFA, seguido por aproximadamente 10 volumes de coluna súdo de H2O.
- Eluir os peptídeos em três frações com volumes de 10 colunas de solução de formato de amônio de 10 mM (pH = 10) com 7%, 13,5% e 50% de acetonitrilo (AcN), respectivamente. Liofilo todas as frações para a completude.
- Use anticorpos remanescentes de ubiquitina (K-ε-GG) conjugados à proteína A agarose beads para o imunoenriquecimento de peptídeos diGly. Como a quantidade exata de anticorpos por lote de contas é de propriedade e não divulgada pelo fabricante, recomenda-se usar a mesma definição para um lote de contas como o fabricante faz para evitar confusão. Lave um lote dessas contas 2x com PBS e divida o chorume de contas em seis frações iguais. Consulte a Figura 1 para um esquema experimental detalhado.
- Dissolver as três frações de peptídeos coletadas na etapa 2.3 em 1,4 mL de um tampão composto por 50 mM MOPS, fosfato de sódio de 10 mM e 50 mM NaCl (pH = 7,2), e girar os detritos.
- Adicione os sobrenatantes das frações às contas de anticorpos diGly e incubar por 2 h a 4 °C em uma unidade rotadora. Gire as contas e transfira o sobrenadante para um lote fresco de contas de anticorpos e incuba novamente por 2 h a 4 °C.
- Armazene os sobrenatantes para análise subsequente de proteome global (GP).
- Transfira as contas de cada fração para uma ponta de pipeta de 200 μL equipada com um plugue de filtro GF/F para reter as contas. Coloque a ponta da pipeta com as contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL equipado com um adaptador de ponta centrífuga. Lave as contas 3x com 200 μL de tampão IAP gelado e, posteriormente, 3x com 200 μL de gelo-frio milliQ H2O. Gire a coluna a 200 x g por 2 min antes de cada passo de lavagem, mas tome cuidado para não deixar a coluna secar. Eluir os peptídeos usando 2 ciclos de 50 μL de 0,15% TFA.
- Dessalificar os peptídeos usando uma ponta de estágio C18 (essencialmente uma ponta de pipeta de 200 μL com dois discos C18) e secá-los para completar usando centrifugação de vácuo.
3. Nanofluxo LC-MS/MS
- Realize experimentos LC-MS/MS em um espectrômetro de massa sensível acoplado a um sistema LC de nanofluxo.
- Use uma coluna de fase invertida de 50 cm embalada internamente com um diâmetro interno de 75 μm embalado com resina CSH130 (3,5 μm, 130 Å) e eluie os peptídeos com um gradiente de 2-28% (AcN, 0,1% FA) sobre 120 min a 300 nL/min. Alternativamente, use colunas de LC disponíveis comercialmente com propriedades similares. Mantenha a coluna a 50 °C usando um forno de coluna, por exemplo (ver Tabela de Materiais).
- Faça a análise de espectrometria de massa.
- O espectrômetro de massa deve ser operado no modo de aquisição dependente de dados (DDA). Os espectros de massa MS1 devem ser coletados em alta resolução (por exemplo, 120.000), com uma configuração de meta de controle de ganho automatizado (AGC) de 4E5 e um tempo máximo de injeção de 50 ms no caso de um espectrômetro de massa Orbitrap.
- Realize a análise de espectrometria de massa no modo "Maior Intensidade Primeiro" primeiro. Dessa forma, o íon mais intenso é selecionado primeiro para fragmentação, depois o segundo mais alto, e assim por diante, usando o método de velocidade máxima com um tempo total de ciclo de 3 s. Posteriormente, realize uma segunda rodada de análise DDA MS no modo "Menor Intensidade Primeiro", de modo que o íon menos intenso seja selecionado primeiro, depois o segundo mais baixo, e assim por diante. Essa estratégia garante a detecção ideal de peptídeos de abundancy muito baixos.
- Filtrar os íons precursores de acordo com seus estados de carga (2-7 cargas) e atribuição de pico monoisotópico. Exclua os precursores previamente interrogados dinamicamente para 60 s. Isole os precursores do peptídeo com um filtro de massa quadrúpole definido para uma largura de 1,6 Th.
- Coletar espectros MS2 na armadilha de íons em um AGC de 7E3 com um tempo máximo de injeção de 50 ms e energia de colisão HCD de 30%.
4. Análise de dados
- Analise os arquivos brutos de espectrometria de massa usando um mecanismo de pesquisa apropriado, como o conjunto de software MaxQuant livremente disponível com base no mecanismo de busca de Andrômeda18,19. No MaxQuant, selecione as configurações padrão com algumas adaptações indicadas abaixo. Defina a especificidade da enzima para tripsina, com o número máximo de decotes perdidos elevado para três. Coloque a lysina com um remanescente diGly (+114.04 Da), oxidação de metionina e acetilação n-terminal como modificações variáveis, e definir carbamidometilação de cisteína como uma modificação fixa.
- Realizar pesquisas de banco de dados contra um arquivo FASTA contendo seqüências proteicas baixadas, por exemplo, do repositório Uniprot(https://www.uniprot.org/downloads)combinado com uma isca e um banco de dados de contaminantes comum padrão que é fornecido automaticamente pelo MaxQuant. Defina a taxa de detecção falsa (FDR) para 1% e defina a pontuação mínima para peptídeos modificados (diGly) para 40 (valor padrão). Exclua peptídeos identificados com um resíduo de lysina diGly modificado do terminal C de análises posteriores.
- Para a análise quantitativa dos arquivos de experimento SILAC, defina a multiplicidade como "2" e repita a etapa 4.2.
- Realize todas as análises a jusante (por exemplo, estatísticas, análises de ontologia genética) com o módulo Perseus20 do pacote de software MaxQuant.
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Representative Results
As proteínas ubiquitadas deixam um remanescente de diglycine 114,04 no resíduo de lysina alvo quando as proteínas são digeridas com tripsina. A diferença de massa causada por este motivo foi usada para reconhecer inequivocamente o local da ubiquitina em um experimento de espectrometria de massa. A estratégia que descrevemos aqui é um método de última geração para o enriquecimento e posterior identificação de peptídeos diGly por nanofluxo LC-MS/MS(Figura 1A). Neste estudo, tanto as células cultivadas quanto o material in vivo foram utilizados como fonte biológica de proteínas, mas este protocolo é compatível com qualquer fonte de proteínas. Seguindo as etapas do protocolo deve ser simples identificar 10.000-25.000 peptídeos diGly de 2-20 mg de entrada de proteína. Para aumentar a extensão da ubiquitina proteica nas células, um inibidor proteasome como bortezomib ou MG132 pode ser adicionado algumas horas antes da colheita das células. Se não foi utilizado nenhum inibidor proteasome, o número de peptídeos diGly identificados tende a ser significativamente menor (30-40%).
Fizemos várias melhorias nos protocolos existentes. Primeiro, um fracionamento bruto em três frações com base na cromatografia de fase invertida e posterior elução em pH alto é realizado para reduzir a complexidade da mistura de peptídeos. Estas frações mostram uma sobreposição muito baixa nas identificações de peptídeos, e números comparáveis de peptídeos diGly devem ser identificados por fração(Figura 2). Isso resulta em altos números de peptídeos diGly únicos identificados em cada uma dessas frações. É importante ressaltar que uma das frações (tipicamente a segunda) deve conter o próprio peptídeo tripé de típtico k48 da ubiquitina LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730,39). Este é de longe o peptídeo mais abundante na fração imunoprecipitada e é caracterizado pelo pico intenso e amplo no cromatograma LC(Figura 1B). Este é um pico cromatográfico de referência e se ele está ausente do cromatograma o IP provavelmente não teve sucesso.
Outra melhoria é a adaptação do procedimento de análise de DDA é o multipólo de roteamento de íons no espectrômetro de massa. Na aquisição convencional de n dependente de dados (DDA), os picos N do espectro MS1 são selecionados para fragmentação. Este esquema de fragmentação começa com o pico de maior intensidade primeiro, seguido pelo pico da segunda maior intensidade, e assim por diante. Em um esquema alternativo de fragmentação, o pico menos intenso é selecionado primeiro, seguido pelo segundo pico menos intenso, etc. A lógica por trás dessa ordem de seleção é que haja tempo suficiente para fragmentar peptídeos muito baixos e abundantes também. De fato, descobrimos que o número de identificações de peptídeos aumenta quando as corridas de DDA "mais altas" e "mais baixas" foram combinadas em comparação com uma análise de LC-MS duplicada com configurações padrão de DDA (ou seja, a mais alta primeiro). Para um perfil de ubiquitinome mais abrangente, recomenda-se, portanto, combinar as corridas de LC-MS com regimes de fragmentação "mais altos" e "mais baixos" no procedimento de análise de dados. Esta estratégia "mais baixa em primeiro lugar" pode produzir mais do que 4.000 peptídeos diGly únicos, que não foram detectados quando apenas o regime convencional de DDA foi usado (Figura 2).
Finalmente, ips adicionais do fluxo após o primeiro IP podem produzir outros ~2.500 peptídeos diGly exclusivos(Figura 2).
Artigos na literatura sobre perfil de ubiquitina tipicamente relatam cerca de 10.000 peptídeos diGly identificados12,21. Aqui, de todos os peptídeos diGly identificados ao longo de três telas de réplica biológica, >9.000 estavam presentes em todas as três, enquanto >17.000 estavam presentes em pelo menos duas das três réplicas(Figura 3). Normalmente, seguindo o protocolo descrito aqui deve-se identificar >21.000 peptídeos diGly exclusivos de uma amostra de proteína de 15-20 mgs usando um lote padrão de contas de anticorpos CST. Em termos de pureza e seletividade, a razão entre peptídeos diGly identificados e peptídeos não modificados deve ser sempre >0.5. O número de identificações de peptídeos diGly foi altamente dependente da quantidade de material de entrada de proteínas. Um PI realizado com apenas 1 mg de material de entrada produziu cerca de 2.500 identificações de peptídeos diGly, enquanto com 10 mg de material de entrada de proteína >15.000 diGly identificaçãos de peptídeos foram produzidas. A Tabela 1 lista o número esperado de peptídeos diGly identificados para cada condição. Deve-se notar que esses números são apenas estimativas e dependem do tipo de espectrômetro de massa utilizado. A Figura 4 mostra a sobreposição entre as identificações de peptídeos diGly com baixas, médias e altas quantidades de material de entrada.
A fim de ilustrar o valor agregado das melhorias para a análise do local de ubiquitina descrito acima, também realizamos uma análise ubiquitinômica quantitativa das células HeLa rotuladas silac que foram tratadas com o inibidor proteasome bortezomib em comparação com células de controle não tratadas em um ensaio de troca de rótulo duplicado. Mais da metade (>55%) de todos os peptídeos identificados no eluate sobre IP eram peptídeos diGly. Foram identificados mais de 19.000 peptídeos diGly únicos, o que é apenas um pouco menor do que em uma amostra não rotulada pelo SILAC. A razão para isso pode ser a maior complexidade do espectro MS1 em um ensaio SILAC devido à presença de pares de pico de peptídeos. Na análise SILAC foram observadas diferenças relativamente grandes entre os números de peptídeos diGly que foram exclusivamente identificados na condição de avanço (ou seja, bortezomib tratou células no canal pesado, células de controle no canal de luz) e aquelas exclusivamente identificadas na condição inversa (ou seja, células tratadas com bortezomib no canal de luz, células de controle no canal pesado), neste caso 1.752 versus 6.356(Tabela Suplementar 1). Ao operar o software MaxQuant no modo "multiplicidade = 2" (ou seja, SILAC de dois canais), 7.555 peptídeos diGly foram identificados com intensidade zero no canal pesado (praticamente todos vindo no experimento reverso) e um valor de intensidade não zero no canal de luz. Em contraste, nenhum peptídeo diGly único foi identificado com um valor de intensidade não zero no canal pesado acompanhado de um valor de intensidade zero no canal de luz. Quando uma análise MaxQuant no mesmo conjunto de dados foi realizada no modo "multiplicidade = 1" com o dimly moiety e o aminoácido rotulado combinado em uma única modificação variável, muitas variantes de peptídeos diGly pesadas foram identificadas, mesmo quando nenhuma contrapartida leve desse peptídeo poderia ser detectada. A explicação mais provável para isso é a incapacidade do software de lidar com a identificação de peptídeos diGly que estão exclusivamente presentes no canal pesado. Esse fenômeno provavelmente ocorrerá extensivamente, pois a inibição do proteasome desencadeará a formação de novos locais de ubiquitinação. Marcar a caixa de seleção de opção "requantificar" no MaxQuant, que foi desenvolvida para lidar com esses problemas e deve corrigir para isso, parece ser insuficiente para evitar esse problema completamente. Obviamente, a grande maioria dos peptídeos diGly estão sendo regulados ou formados de novo após a inibição proteasome, porque mais de dois terços da piscina de peptídeos têm proporções de H:L de pelo menos 1,5(Figura 5B).
Finalmente, aplicamos esse método de análise do local de ubiquitina a uma amostra de tecido in vivo. Para avaliar a eficácia, extraímos aproximadamente 32 mg de proteína do cérebro de camundongos frescos (~10% do peso do tecido molhado é proteína). O material cerebral não foi tratado com inibidores proteasome ou qualquer outro reagente que poderia aumentar a ubiquitinação global da proteína. A partir desta amostra, foram identificados 10.871 peptídeos diGly únicos (Tabela Suplementar 2). Todos os peptídeos diGly identificados neste tecido originaram-se de sítios endógenos de ubiquitina em uma situação de estado estável. Não foi imposto tratamento para aumentar a ubiquitina global (por exemplo, inibição proteasome). Por conseguinte, supõem-se que esses locais de ubiquitina, pelo menos parcialmente, decorrem de (poli)ubiquitinação envolvida em eventos de sinalização celular não proteasome mediados, o que está de acordo com as ideias propostas na literatura5,16,22.
Em conclusão, o método aqui descrito permite a exploração aprofundada da ubiquitinome de forma reprodutível. Para uma visão geral dos resultados típicos obtidos com este procedimento, consulte Van Der Wal et al.23.
Figura 1: Visão geral experimental. (A)Visão geral da abordagem experimental. As amostras foram preparadas, tripsinizadas e fracionadas em três frações utilizando cromatografia de fase inversa com alta elução de pH. Um lote de contas comerciais de anticorpos de peptídeos α-diGly foi dividido em seis frações iguais e as três frações de peptídeos foram então carregadas em três das frações de contas. Os peptídeos diGly foram imunopurificados, eluidos e coletados, e o fluxo foi posteriormente transferido para as três frações de contas frescas restantes. Os peptídeos diGly coletados foram analisados por espectrometria de massa em um espectrômetro de massa Lumos Orbitrap de acordo com um esquema de dois níveis combinando um ciclo no qual os picos mais intensos foram selecionados pela primeira vez para fragmentação de peptídeos e o próximo ciclo em que os picos menos intensos foram selecionados primeiro. O conjunto completo de corridas nLC-MS/MS foi então analisado usando o MaxQuant. (B) Uma das frações deve conter o próprio peptídeo tripé de ubiquitina LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730,39). Este é de longe o peptídeo mais abundante na fração imunoprecipitada e foi caracterizado pelo pico intenso e amplo no cromatograma LC entre 50-55 min em um gradiente de 120 min. Se este pico de referência estiver ausente do cromatograma, o IP provavelmente não teve sucesso. Esta figura foi modificada de Van Der Wal et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Números de peptídeos diGly detectados para cada uma das três etapas de melhoria. (A) Efeito do fracionamento bruto antes da imunoprecipitação. Mostra-se a sobreposição entre as populações de peptídeos diGly identificadas nas três frações separadas. (B) Efeito da primeira e segunda etapas de incubação. (C) Resultados do regime de fragmentação de peptídeos ajustados. Esta figura foi modificada de Van Der Wal et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Peptídeos digly detectados em três réplicas biológicas de células tratadas com bortezomib mostrando a quantidade de sobreposição entre as corridas. Esta figura foi modificada de Van Der Wal et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sobreposição de peptídeos diGly identificados a partir de análises com quantidades de entrada de proteínas baixas (4 mg), médias (10 mgs) e altas (40 mg) de entrada total de proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Detecção de peptídeos diGly em células rotuladas SILAC. (A) Números de peptídeos detectados nas condições dianteiras e inversas das células HeLa rotuladas silac para as configurações de multiplicidade 1 e 2. (B) Dispersão de proporções de peptídeos diGly SILAC em células De Bortezomib (Btz) tratadas hela. Apenas peptídeos identificados e quantificados em experimentos avançados e reversos são mostrados. Esta figura foi modificada de Van Der Wal et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Condição | Quantidade de material de entrada (mg) | Número esperado de peptídeos diGly identificados |
| Células HeLa não tratadas | 10 | 7,500 |
| Inibidor proteasome tratado células HeLa | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Tecido (cérebro do rato) | 30 | >10.000 |
Tabela 1: Números esperados de identificações de peptídeos diGly para diferentes condições. Esses números são apenas estimativas e dependem das configurações experimentais utilizadas.
Tabela suplementar 1. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
Tabela suplementar 2. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
O protocolo descrito aqui foi aplicado a amostras de diversas fontes biológicas, como células cultivadas e tecido in vivo. Em todos os casos identificamos milhares de peptídeos diGly, desde que a quantidade total de entrada de proteínas fosse de pelo menos 1 mg. O enriquecimento utilizando anticorpos específicos é altamente eficiente, uma vez que apenas no máximo 100-150 peptídeos diGly muito baixos abundantes foram identificados a partir de lysatos celulares inteiros se não foram aplicados procedimentos de enriquecimento de proteínas ubiquitinadas ou peptídeos diGly. Obviamente, a espectrometria de massa sensível é um pré-requisito para obter um alto número de identificações diGly. Embora tenhamos usado com sucesso vários espectrômetros de massa diferentes, encontramos o Orbitrap Tribrid Lumos como o mais sensível que deu os maiores rendimentos.
A cromatografia RP offline com alta elução de pH deve ser testada antes da realização dos IP.. A sobreposição entre as frações em termos de identificação de peptídeos deve ser o mais baixa possível para um experimento ideal. Após o IP, uma das frações deve conter o próprio peptídeo tripé de ubiquitina LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730,39). Este é de longe o peptídeo mais abundante na fração imunoprecipitada e é caracterizado pelo pico intenso e amplo no cromatograma LC entre 50-55 min em um gradiente de 120 min(Figura 1B). Se este pico de referência estiver ausente do cromatograma, o IP provavelmente não teve sucesso.
É importante analisar os peptídeos diGly tripptic imunoprecipitados imediatamente após o procedimento ip, de modo que o tempo entre o PI e a análise deve ser mantido ao mínimo. Durante esse tempo, os peptídeos devem ser armazenados preferencialmente em um frasco de vidro em vez de tubos plásticos. Deixar peptídeos em tubos de plástico por muito tempo, seja em RT ou a -20 °C, pode resultar em precipitação de peptídeos e/ou grudar na parede do tubo de plástico. Isso afetará, em última análise, a sensibilidade da análise.
Embora tenha havido relatos na literatura sobre a possível má interpretação dos adutos de iodoacetamide como locais de ubiquitinação devido aos seus idênticos 114.04 Turnos de massa24, não encontramos qualquer indicação disso com nossas preparações de peptídeos tripés imunoprecipitados. Em primeiro lugar, os efeitos colaterais do uso de iodoacetamida (IAM) são mínimos em nossas mãos usando o protocolo de redução de alquilação descrito acima. Segundo, o anticorpo é específico para peptídeos com um remanescente diglycine. Peptídeos com duas moieties de iodoacetamide covalentemente adicionadas aos resíduos de lisina não devem ser enriquecidos neste protocolo. Em terceiro lugar, a maioria dos peptídeos da fração imunoprecipitada são regulados mediante inibição proteasome, como exemplificado no experimento SILAC descrito acima (Figura 5). Como a população de proteínas ubiquitinadas é afetada como resultado deste tratamento, é altamente provável que esses peptídeos afetados sejam de fato peptídeos diGly resultantes de proteínas ubiquitinadas.
Finalmente, este protocolo poderia ser usado em combinação com uma estratégia quantitativa multiplexada recentemente publicada usando TMT19. Obviamente, embora os números de peptídeos diGly publicados sejam um pouco inferiores aos obtidos usando o protocolo atual, a capacidade de quantificar relativamente até 16 amostras simultaneamente é uma enorme vantagem. A combinação desses métodos permitirá que os pesquisadores realizem estudos de ubiquitinome quantitativo em larga escala em grande profundidade.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho faz parte do projeto "Proteínas no Trabalho", um programa do Centro de Proteômica dos Países Baixos financiado pela Organização Holandesa para a Pesquisa Científica (NWO) como parte do Roteiro Nacional de Instalações de Pesquisa em Larga Escala (projeto número 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
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