איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה
Summary
אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.
Abstract
השינוי הפוסט-ממדי של חלבונים על ידי החלבון הקטן אוביקוויפין מעורב באירועים סלולריים רבים. לאחר העיכול הטריפטי של חלבונים אוביקוויטיים, פפטידים עם שארית דיגליצין מצוזרת לקבוצת האמינו אפסילון של ליזין (K-ε-diglycine ‘ או פשוט ‘ diGly ‘) ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר האתר המקורי שינוי. החיסונית יעילה של פפטידים diGly בשילוב עם זיהוי רגיש על ידי ספקטרומטר מסה הביא לעלייה עצומה במספר האתרים אוביקווינציה שזוהו עד היום. עשינו מספר שיפורים בזרימת עבודה זו, כולל גבוהה במצב לא מקוון pH-שלב לאחור השבר של פפטידים לפני הליך העשרה, והכללת הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר ב-multipole הניתוב יונים. גם, ניקוי יעיל יותר של המדגם באמצעות תקע מבוסס מסנן כדי לשמור על חרוזים הנוגדן תוצאות ספציפיות יותר עבור פפטידים diGly. שיפורים אלה התוצאה של הגילוי השגרתי של יותר מ 23,000 diGly פפטידים מתאי סרטן צוואר הרחם האנושי (הלה) תא lysates על עיכוב פרוטאסדום בתא. אנו מראים את היעילות של אסטרטגיה זו לניתוח מעמיק של הפרופילים אוביקווינוביים של מספר סוגי תאים שונים ובדגימות vivo, כגון רקמת המוח. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים עבור ניתוח אוביקווינציה חלבונים כדי לחשוף את אוביקוויבידום הסלולר עמוק.
Introduction
בניין של אוביקוויב לחלבונים מסמן אותם עבור השפלה על ידי פרוטאסדום והוא תהליך מכריע ב פרוטאוסטזיס. C-טרמינל קרבוקסילי הקבוצה של הצורות אוביקוויב בקשר עם הקבוצה ליזין ε-אמינו של חלבון היעד1,2. בנוסף, אוביקוויב יכול להיות מצורף מודולים אחרים אוביקוויב, וכתוצאה מכך היווצרות של הומוגנית (כלומר, K48 או K11) או מסוקנים (כלומר1, הטרוגנית או מעורב) polyubiquitinמבנים 1,3. הפונקציה הידועה ביותר של אוביקוויב היא תפקידה השפלה פרוטאספאל, בתיווך על ידי K48 מקושרים polyubiquitin. עם זאת, התברר כי הן מונו, כמו גם polyubiquitination גם לשחק תפקידים בתהליכים רבים כי הם עצמאיים של השפלה על ידי פרוטאסדום. למשל, רשתות מקושרות K63 יש תפקידים nondegradative בסחר תאיים, השפלה ליסוזומיום, איתות קינאז, ואת הנזק DNA תגובה4,5. שישה סוגי ההצמדה האחרים הם פחות שופע ותפקידם הם עדיין במידה רבה, למרות הסימנים הראשונים על התפקודים שלהם בתא הם המתעוררים, בעיקר בגלל התפתחות של כלים חדשניים כדי לאפשר זיהוי ספציפי הצמדה6,7.
ספקטרומטר מסה הפכה כלי הכרחי עבור ניתוחים פרוטדום וכיום אלפי חלבונים שונים כמעט כל מקור ביולוגי ניתן לזהות בניסוי אחד. שכבה נוספת של מורכבות מוצגת על ידי שינויים בפוסט-שינוי (למשל, זירחון, מתילציה, מרחלציה ואוביקווינציה) אשר יכולים לווסת את פעילות החלבונים. זיהוי בקנה מידה גדול של חלבונים PTM הנושאת גם התאפשר על ידי התפתחויות בשדה ספקטרומטר המסה. הסטואיצ’ימטריה הנמוכה יחסית של פפטידים הנושאים את הדבר המקביל לעמיתיהם שאינם שונו מציג אתגר טכני ושלבי העשרה ביוכימיים נחוצים בדרך כלל לפני ניתוח הספקטרומטר ההמוני. במהלך שני העשורים האחרונים פותחו מספר שיטות העשרה ספציפיות לניתוח של “פטין”.
בגלל התפקידים הרב ביותר של אוביקוויטים חלבונים בתא, יש דרישה גדולה לפיתוח שיטות אנליטיות לאיתור אתרים אוביקווינציה על חלבונים8. היישום של שיטות ספקטרומטרי המוני הוביל לפיצוץ של מספר האתרים המזוהים אוביקווילנציה בתוך מעוף פירות, עכבר, אדם, ושמרים חלבונים9,10,11,12,13,14. צעד מרכזי הוצג על ידי פיתוח אסטרטגיות העשרה המבוססות על immunoprecipitation ברמה פפטיד באמצעות נוגדנים בבימויו של K-ε-GG מוטיב שארית (המכונה גם “diglycine” או “diGly”). הפפטידים האלה מיוצרים על העיכול של חלבונים אוביקטילביים באמצעות טריפסין כפרוטאז15,16.
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת כדי להעשיר את הפפטידים diGly באמצעות immunopurification ובעקבות גילוי על ידי ספקטרומטר המסה של אורדרראפ. באמצעות שילוב של מספר שינויים של זרימות עבודה קיימות, במיוחד בהכנה לדוגמה ובשלבים ספקטרומטר המסה, עכשיו אנחנו יכולים לזהות באופן שגרתי יותר מ 23,000 הפפטידים diGly ממדגם אחד של תאי הלה שטופלו עם פרוטאסדום מעכבי ו-~ 10,000 מתאי הלה לא מטופל. יש לנו להחיל את הפרוטוקול הזה כדי lysates מתוך תיוג איזוטופ יציב ו יציבה עם חומצות אמינו בתרבות התא (SILAC) המסומנים תאי הלה, כמו גם לדגימות אנדוגניים כגון רקמת המוח.
זרימת עבודה זו מציגה תוספת רבת ערך לרפרטואר של כלים לניתוח של האתרים אוביקווינציה על מנת לחשוף את אוביקוויבידום עמוק. הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים של זרימת העבודה בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן חל על דגימות ממקורות ביולוגיים שונים, כגון תאים מתורבתים ורקמות vivo. בכל המקרים זיהינו אלפי פפטידים diGly, בתנאי הסכום הכולל של החלבון כמות היה לפחות 1 מ ג. העשרה שימוש בנוגדנים ספציפיים היא יעילה מאוד, בהתחשב בכך שרק ברוב 100-150 מאוד נמוך מאוד הפפטידים diGly זוהו מתוך ליטים תא ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היא חלק מהפרוייקט “חלבונים בעבודה”, תוכנית של הולנד פרוטאומניקס מרכז ממומן על ידי הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) במסגרת מפת הדרכים הלאומית מתקנים מחקר בקנה מידה גדול (מספר פרוייקט 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
