Summary
אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.
Abstract
השינוי הפוסט-ממדי של חלבונים על ידי החלבון הקטן אוביקוויפין מעורב באירועים סלולריים רבים. לאחר העיכול הטריפטי של חלבונים אוביקוויטיים, פפטידים עם שארית דיגליצין מצוזרת לקבוצת האמינו אפסילון של ליזין (K-ε-diglycine ' או פשוט ' diGly ') ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר האתר המקורי שינוי. החיסונית יעילה של פפטידים diGly בשילוב עם זיהוי רגיש על ידי ספקטרומטר מסה הביא לעלייה עצומה במספר האתרים אוביקווינציה שזוהו עד היום. עשינו מספר שיפורים בזרימת עבודה זו, כולל גבוהה במצב לא מקוון pH-שלב לאחור השבר של פפטידים לפני הליך העשרה, והכללת הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר ב-multipole הניתוב יונים. גם, ניקוי יעיל יותר של המדגם באמצעות תקע מבוסס מסנן כדי לשמור על חרוזים הנוגדן תוצאות ספציפיות יותר עבור פפטידים diGly. שיפורים אלה התוצאה של הגילוי השגרתי של יותר מ 23,000 diGly פפטידים מתאי סרטן צוואר הרחם האנושי (הלה) תא lysates על עיכוב פרוטאסדום בתא. אנו מראים את היעילות של אסטרטגיה זו לניתוח מעמיק של הפרופילים אוביקווינוביים של מספר סוגי תאים שונים ובדגימות vivo, כגון רקמת המוח. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים עבור ניתוח אוביקווינציה חלבונים כדי לחשוף את אוביקוויבידום הסלולר עמוק.
Introduction
בניין של אוביקוויב לחלבונים מסמן אותם עבור השפלה על ידי פרוטאסדום והוא תהליך מכריע ב פרוטאוסטזיס. C-טרמינל קרבוקסילי הקבוצה של הצורות אוביקוויב בקשר עם הקבוצה ליזין ε-אמינו של חלבון היעד1,2. בנוסף, אוביקוויב יכול להיות מצורף מודולים אחרים אוביקוויב, וכתוצאה מכך היווצרות של הומוגנית (כלומר, K48 או K11) או מסוקנים (כלומר1, הטרוגנית או מעורב) polyubiquitinמבנים 1,3. הפונקציה הידועה ביותר של אוביקוויב היא תפקידה השפלה פרוטאספאל, בתיווך על ידי K48 מקושרים polyubiquitin. עם זאת, התברר כי הן מונו, כמו גם polyubiquitination גם לשחק תפקידים בתהליכים רבים כי הם עצמאיים של השפלה על ידי פרוטאסדום. למשל, רשתות מקושרות K63 יש תפקידים nondegradative בסחר תאיים, השפלה ליסוזומיום, איתות קינאז, ואת הנזק DNA תגובה4,5. שישה סוגי ההצמדה האחרים הם פחות שופע ותפקידם הם עדיין במידה רבה, למרות הסימנים הראשונים על התפקודים שלהם בתא הם המתעוררים, בעיקר בגלל התפתחות של כלים חדשניים כדי לאפשר זיהוי ספציפי הצמדה6,7.
ספקטרומטר מסה הפכה כלי הכרחי עבור ניתוחים פרוטדום וכיום אלפי חלבונים שונים כמעט כל מקור ביולוגי ניתן לזהות בניסוי אחד. שכבה נוספת של מורכבות מוצגת על ידי שינויים בפוסט-שינוי (למשל, זירחון, מתילציה, מרחלציה ואוביקווינציה) אשר יכולים לווסת את פעילות החלבונים. זיהוי בקנה מידה גדול של חלבונים PTM הנושאת גם התאפשר על ידי התפתחויות בשדה ספקטרומטר המסה. הסטואיצ'ימטריה הנמוכה יחסית של פפטידים הנושאים את הדבר המקביל לעמיתיהם שאינם שונו מציג אתגר טכני ושלבי העשרה ביוכימיים נחוצים בדרך כלל לפני ניתוח הספקטרומטר ההמוני. במהלך שני העשורים האחרונים פותחו מספר שיטות העשרה ספציפיות לניתוח של "פטין".
בגלל התפקידים הרב ביותר של אוביקוויטים חלבונים בתא, יש דרישה גדולה לפיתוח שיטות אנליטיות לאיתור אתרים אוביקווינציה על חלבונים8. היישום של שיטות ספקטרומטרי המוני הוביל לפיצוץ של מספר האתרים המזוהים אוביקווילנציה בתוך מעוף פירות, עכבר, אדם, ושמרים חלבונים9,10,11,12,13,14. צעד מרכזי הוצג על ידי פיתוח אסטרטגיות העשרה המבוססות על immunoprecipitation ברמה פפטיד באמצעות נוגדנים בבימויו של K-ε-GG מוטיב שארית (המכונה גם "diglycine" או "diGly"). הפפטידים האלה מיוצרים על העיכול של חלבונים אוביקטילביים באמצעות טריפסין כפרוטאז15,16.
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת כדי להעשיר את הפפטידים diGly באמצעות immunopurification ובעקבות גילוי על ידי ספקטרומטר המסה של אורדרראפ. באמצעות שילוב של מספר שינויים של זרימות עבודה קיימות, במיוחד בהכנה לדוגמה ובשלבים ספקטרומטר המסה, עכשיו אנחנו יכולים לזהות באופן שגרתי יותר מ 23,000 הפפטידים diGly ממדגם אחד של תאי הלה שטופלו עם פרוטאסדום מעכבי ו-~ 10,000 מתאי הלה לא מטופל. יש לנו להחיל את הפרוטוקול הזה כדי lysates מתוך תיוג איזוטופ יציב ו יציבה עם חומצות אמינו בתרבות התא (SILAC) המסומנים תאי הלה, כמו גם לדגימות אנדוגניים כגון רקמת המוח.
זרימת עבודה זו מציגה תוספת רבת ערך לרפרטואר של כלים לניתוח של האתרים אוביקווינציה על מנת לחשוף את אוביקוויבידום עמוק. הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים של זרימת העבודה בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (EDC) של ארסמוס MC.
1. הכנה לדוגמא
- תאים מתורבתים
- בחר קו תא של עניין (למשל, הלה או אוסטאוסרקומה [U2OS] תאים) ולגדול את התאים בינונית נשר מינימלי של דולבקה (DMEM) שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל באמצעות סרום העוברי (FBS) ו 100 יחידות/לסטרפטומיצין.
- עבור ניסויים כמותיים הפרוטקומאים, התרבות תאים ב dmem חסר ארגינין ו ליזין. המדיום חייב להיות שיושלם עם 10% סרום העוברי העובר דיאליזה (fbs), 100 יחידות/סטרפטומיצין ו-mL, ו אלכין-גלוטמין. ליצור שני סוגים של מדיה על ידי הוספת ליזין קונבנציונאלי ו ארגינין (' אור ' בינוני) או ליזין-8 (13ג6; 15N2) ו-arginine 10 (13ג6; 15N4) (' כבד ' בינוני), בהתאמה.
- התרבות אצוות של תאים בינוני בהיר (כלומר, ללא תווית) ו בינונית כבד (כלומר, מתויג, SILAC) עבור לפחות שישה טווח לפני התרחבות וטיפול כדי לוודא כי כל החלבונים בתרבות בינונית כבדה מתויגים עם איזוטופ יציב כבד המכיל חומצות אמינו.
- לטפל בתאים עבור 8 h עם 10 μM של מעכבי מעכב פרוטאסדום או נפח שווה ערך של DMSO כטיפול מבוים. רחץ את התאים עם PBS, הנתק אותם באמצעות 1% טריפסין/EDTA, וכלה את התאים.
- Lyse את הגלולה תא מ 1 150 ס מ2 לוחית התרבות לכל תנאי נבדק 2 מ ל של קרח קר 50 mM טריס-HCl (pH = 8.2) עם 0.5% נתרן deאוקסיכולולאואט (DOC). מרתיחים את הליפוסט ב 95 ° c עבור 5 דקות ו sonicate עבור 10 דקות (הגדרת "H" עבור sonicator המפורטים בטבלה של חומרים) ב 4 ° c. אנחנו לא ממליצים על השימוש של מעכבי ביוקווינואז כמו N-ethylmaleimide (NEM), כי זה עשוי להציג שינויים חלבון לא רצויים שיכולים לסבך זיהוי פפטיד.
- ברקמת מוח vivo העכבר
- כאשר משתמשים ברקמה vivo, lyse את הרקמה בתוך מאגר קר קרח המכיל 100 mM טריס-HCl (pH = 8.5), 12 mM נתרן DOC, ו 12 מ"מ נתרן N-lauroylsarcosinate17. Sonicate הליפוסט במשך 10 דקות (הגדרת "H" לsonicator המפורטים בטבלת החומרים) ב -4 ° c ומרתיחים את הליפוסט במשך 5 דקות ב 95 ° c.
- ככמת את סכום החלבון הכולל באמצעות שיטת התאמת החלבון BCA. הסכום הכולל של החלבון צריך להיות לפחות כמה מיליגרם עבור immunoprecipitation פפטיד מוצלחת של diGly (IP). עבור ניסויים SILAC לערבב את האור ואת החלבונים המסומנים כבדים ביחס 1:1 בהתבסס על כמות החלבון הכולל.
- להפחית את כל החלבונים באמצעות 5 מ"מ 1, 4-dithioitol עבור 30 דקות ב 50 ° c ולאחר מכן לאחר מכן האלדול אותם עם 10 מילימטר מאשר במשך 15 דקות בחושך. לבצע עיכול חלבון עם Lys-C (1:200 יחס אנזימים למצע) עבור 4 שעות ואחריו העיכול לילה עם טריפסין (1:50 יחס אנזים למצע) ב 30 ° צ' או בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף חומצה trifluoroacetic (TFA) למדגם מתעכל לריכוז הסופי של 0.5% ו צנטריפוגה את המדגם ב 10,000 x g עבור 10 דקות כדי לזרז ולהסיר את כל חומרי הניקוי. לאסוף את סופרנטנט המכיל את הפפטידים עבור המהומה הבאה.
2. משבר פפטיד לא מקוון
- השתמש גבוהה pH לאחור שלב (RP) סי18 כרומטוגרפיה עם חומר נייח בשלב הקבוע (300 Å, 50 μM; ראה טבלת חומרים) נטען לתוך מחסנית עמודה ריקה כדי לאנגיופלסטיקה את הפפטידים טריפטיים. הגודל הנייח של מיטת הפאזה חייב להיות מותאם לכמות החלבונים שניתן לעכל. הכינו מחסנית עמודה ריקה בגובה 6 מ ל (ראו טבלת חומרים) המלאה ב-0.5 גרם של חומר נייח בשלב של ~ 10 מ ג של תקציר חלבונים. תקציר חלבון ליחס שלב נייח צריך להיות כ 1:50 (w/w).
- טען את הפפטידים על הטור המוכן ושטוף את העמודה עם כ 10 כרכים של עמודות של 0.1% TFA, ואחריו כ 10 כרכים של עמודות של H2O.
- Elute הפפטידים לתוך שלושה שברים עם 10 כרכים של עמודות 10 מ"מ הפתרון אמוניום (pH = 10) עם 7%, 13.5%, ו 50% acetonitrile (AcN), בהתאמה. ליאופליז כל השברים לשלמות.
- השתמש אוביקוויב שארית מוטיב (K-ε-GG) נוגדנים מצוזרת לחלבון מחרוזת agarose עבור העשרת הפפטידים של diGly. בגלל הסכום המדויק של הנוגדן לכל אצווה של חרוזים הוא מידע קנייני ולא נחשף על ידי היצרן, מומלץ להשתמש באותה הגדרה עבור אצווה של חרוזים כמו היצרן עושה כדי למנוע בלבול. לשטוף חבילה אחת של החרוזים האלה 2x עם PBS ולפצל לתוך שישה שברים שווים. ראה איור 1 עבור ערכה ניסיונית מפורטת.
- לפזר את שלושת השברים פפטיד שנאספו בשלב 2.3 ב1.4 mL של מאגר המורכב 50 מ ל מגבים, 10 מ"מ נתרן פוספט, ו 50 מ"מ (pH = 7.2), ולסובב את השברים.
- הוסיפו את הסופרנטנים של השברים לחרוזי הנוגדן diGly ו הדגירה עבור 2 h ב 4 ° c על יחידת מסובבי. לסובב את החרוזים ולהעביר את supernatant לתוך אצווה טרייה של חרוזי נוגדן ו הדגירה שוב 2 h ב 4 ° c.
- לאחסן את סופרנטנים עבור ניתוח פרוטדום הכללית הבאים (GP).
- להעביר את החרוזים מכל שבר לתוך הקצה 200 μL הצינורות מצויד תקע GF/F מסנן לשמור את החרוזים. לשים את העצה הצינורות עם החרוזים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL מצויד במתאם קצה צנטריפוגה. לשטוף את החרוזים 3x עם 200 μL של מאגר IAP קר קרח ולאחר מכן 3x עם 200 μL של קרח קר מילי מילימטר2O. ספין לאורך העמודה ב 200 x g עבור 2 דקות לפני כל צעד לשטוף, אבל להיזהר לא לתת את העמודה לרוץ יבש. אליוט הפפטידים באמצעות 2 מחזורים של 50 μL של 0.15% TFA.
- Desalt הפפטידים באמצעות תיאור שלב סי18 (למעשה טיפ 200 μL הפיפטה עם שני דיסקים סי18) ולייבש אותם לשלמות באמצעות צנטריפוגה ואקום.
3. ננופרופיל LC-MS/MS
- בצע ניסויים LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה רגיש בשילוב עם מערכת LC nanoflow.
- השתמש ב-house ארוז 50 ס מ היפוך-שלב הטור עם קוטר 75 יקרומטר הפנימי ארוז עם שרף CSH130 (3.5 יקרומטר, 130 Å) ו elute הפפטידים עם הדרגתי של 2 ל 28% (acn, 0.1% FA) מעל 120 דקות ב 300 nL/min. לחילופין, השתמש בעמודות LC מסחריות זמינות עם מאפיינים דומים שמור את העמודה ב 50 ° צ' באמצעות תנור עמודה, למשל (ראה טבלת חומרים).
- בצע את ניתוח הספקטרומטר המסה.
- על ספקטרומטר המסה להיות מופעל במצב רכישה תלוית נתונים (לוד). ספקטרום המסה MS1 יש לאסוף ברזולוציה גבוהה (למשל, 120,000), עם בקרת רווח אוטומטי (AGC) הגדרת היעד של 4E5 וזמן הזרקה מקסימלית של 50 ms במקרה של ספקטרומטר המסה של אורבראפ.
- בצע תחילה את ניתוח הספקטרומטר המסה במצב ' עוצמה גבוהה ביותר '. בדרך זו, היון האינטנסיבי ביותר נבחר ראשון לפיצול, אז השני הגבוה ביותר, וכן הלאה, באמצעות שיטת המהירות העליונה עם זמן מחזור כולל של 3 s. לאחר מכן, בצע סיבוב שני של ניתוח הדה-לילי במצב "העוצמה הנמוכה ביותר הראשונה", כך שהיון העמוק ביותר ייבחר קודם, ואז השני הנמוך ביותר, וכן הלאה. אסטרטגיה זו מבטיחה זיהוי אופטימלי של פפטידים מאוד נמוכים.
- סנן את היונים הקודנות לפי מצבי הטעינה שלהם (2-7 חיובים) והקצאת שיא מונואיזונושא. אל תכלול סמנים מוקדמים שנחקרו בעבר באופן דינאמי עבור 60 s. בידוד מקדים פפטיד עם מסנן המסה פי ארבעה של מוט מוגדר לרוחב של 1.6 Th.
- לאסוף MS2 ספקטרום במלכודת יונים ב-AGC של 7E3 עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms ואנרגיה התנגשות HCD של 30%.
4. ניתוח נתונים
- נתח את הקבצים הגולמיים של הספקטרומטר ספקטרומטריה באמצעות מנוע חיפוש מתאים כגון חבילת התוכנה הזמינה באופן חופשי maxquant המבוססת על מנוע החיפוש של אנדרומדה18,19. ב-MaxQuant, בחר בהגדרות ברירת המחדל עם מספר עיבודים המצוינים להלן. הגדר את האנזים לטריפסין, עם המספר המירבי של ביקנים שהחמצת הגדלים עד שלוש. הגדר ליזין עם שארית digly (+ 114.04 Da), חמצון של מתיונין ו-N-טרמינל מרחלציה כמו שינויים משתנים, ולהגדיר carbamidomלציה של ציסטאין כשינוי קבוע.
- בצע חיפושים במסד נתונים מול קובץ FASTA המכיל רצפי חלבון שהורדו מ-, לדוגמה, מאגר יוניפרוט (https://www.uniprot.org/downloads) בשילוב עם מדמה ומסד נתונים רגיל של מזהם שמסופק באופן אוטומטי על-ידי MaxQuant. קבע את קצב גילוי השקר (רוזוולט) ל-1% והגדר את הניקוד המינימלי עבור שינוי (diGly) כדי 40 (ערך ברירת מחדל). לא לכלול פפטידים מזוהה עם C-טרמינל diGly שונה ליזין שאריות מניתוח נוסף.
- לניתוח כמותי של קבצי ניסוי SILAC, הגדר את הריבוי ל-"2" וחזור על שלב 4.2.
- בצע את כל ניתוחי במורד הזרם (למשל, סטטיסטיקה, ניתוחי האונטולוגיה גנטי) עם מודול פרסאוס20 של חבילת התוכנה MaxQuant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חלבונים אוביקווילביים להשאיר את שארית 114.04 Da דה דיגליצין על השאריות ליזין היעד כאשר החלבונים מתעכלים טריפסין. ההפרש ההמוני שנגרם על-ידי מוטיב זה שימש לזיהוי משמעי של האתר של אוביקווינציה בניסוי ספקטרומטר המוני. האסטרטגיה שאנו מתארים כאן היא שיטה מתקדמת ליצירת העשרה והזדהות הבאה של פפטידים diGly על-ידי nanoflow LC-MS/MS (איור 1א). במחקר זה, הן תאים מתורבתים והן בחומר vivo שימשו כמקור הביולוגי של חלבונים, אבל פרוטוקול זה תואם לכל מקור של חלבונים. בעקבות השלבים בפרוטוקול זה צריך להיות פשוט כדי לזהות 10000-25000 diGly הפפטידים מ 2-20 mg של קלט חלבון. כדי להגדיל את היקף אוביסטנציה של חלבון בתאים, מעכב פרוטאסדום כגון bortezomib או MG132 ניתן להוסיף כמה שעות לפני איסוף התאים. אם לא נעשה שימוש במעכב הפרוטאסאלי, מספר הפפטידים המזוהים באופן משמעותי נטו להיות נמוך משמעותית (30-40%).
עשינו מספר שיפורים. בפרוטוקולים הקיימים ראשית, משבר גולמי לתוך שלושה שברים על בסיס כרומטוגרפיה בשלב היפוך ומשחררות ברמת pH גבוהה מבוצע כדי להפחית את המורכבות של תערובת פפטיד. שברים אלה מראים חפיפה מאוד נמוכה בזהויות פפטיד, ומספרים דומים של פפטידים diGly צריך להיות מזוהה לכל שבר (איור 2). התוצאה היא מספר גבוה של פפטידים diGly ייחודי המזוהים בכל אחד מאותם שברים. חשוב מכך, אחד השברים (בדרך כלל השני) צריך להכיל K48 שונה של אוביקוויב משלו פפטיד באופן מידי משלו (GG) QLEDGR (ז/ז 730.39). זה בהרבה פפטיד הנפוץ ביותר בשבר immunoprecipitated והוא מאופיין בשיא אינטנסיבי ורחב ב-LC chromatogram (איור 1B). זהו שיא כרומטוגרפי בחינת ביצועים ואם הוא נעדר מן כרומטוגרפי ה-IP היה כנראה נכשל.
שיפור נוסף הוא הסתגלות של הליך הניתוח של ת. א. מרובה המוט בספקטרומטר המסה. ב- n העליון המקובל של הרכישה התלוית נתונים (לוד), n פיקס מספקטרום MS1 נבחרים לצורך פיצול. מערכת פיצול זו מתחילה בשיא האינטנסיביות הגבוה ביותר, ואחריה השיא של העוצמה השנייה בגובהו, וכן הלאה. בערכת פיצול חלופית, השיא הכי פחות אינטנסיבי נבחר ראשון, ואחריו הפסגה השנייה הפחות אינטנסיבית, וכו '. הרציונל מאחורי סדר זה של הבחירה הוא כי יש מספיק זמן לרסיס נמוך מאוד פפטידים שופע, כמו גם. למעשה, גילינו שמספר הזהויות הפפטיד מגדיל כאשר הראשון "הגבוה ביותר" ו-"הנמוך ביותר" הראשון משתלב בהשוואה לניתוח משוכפל של LC-MS עם הגדרות הדה הסטנדרטיות (כלומר, הגבוהה ביותר). לקבלת פרופילים מקיפים יותר של אוביקוויטים, מומלץ לפיכך לשלב את ה-LC-MS הפועל עם "הגבוהה ביותר הראשונה" ו-"הנמוך ביותר הראשון" משטרים בתהליך ניתוח נתונים. האסטרטגיה "הראשונה הנמוכה ביותר" יכולה לייצר יותר מ-4,000 הפפטידים הייחודיים של היחידה, שלא זוהו כאשר רק משטר השימוש המקובל שימש (איור 2).
לבסוף, IP נוספים של flowthrough לאחר ה-IP הראשון יכול לייצר אחר ~ 2,500 ייחודי הפפטידים diGly (איור 2).
מאמרים בספרות על הפרופיל אוביקווינציה בדרך כלל לדווח סביב 10,000 זיהה פפטידים דיקלי12,21. כאן, מכל הפפטידים המזוהים עם שלושה מסכי שכפול ביולוגיים, > 9000 היו נוכחים בכל השלושה, ואילו > 17000 היו נוכחים לפחות שניים מתוך שלושה משכפל (איור 3). בדרך כלל, בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן אחד צריך לזהות > 21000 הפפטידים diGly ייחודי ממדגם אחד 15-20 mg חלבון באמצעות אצווה אחת סטנדרטית של חרוזי נוגדן CST. במונחים של טוהר ובסלקטיביות היחס בין פפטידים diGly מזוהה ופפטידים שאינם ביניהם צריך להיות תמיד > 0.5. מספר הזהויות הפפטיד של diGly היה תלוי מאוד בכמות החומר של הזנת החלבון. IP שבוצעה עם רק 1 מ ג של חומר קלט המיוצר בערך 2,500 diGly פפטיד הזהויות, בעוד עם 10 מ"ג של חומר קלט חלבון > 15000 הזהויות הפפטיד diGly הופקו. טבלה 1 מפרטת את המספר הצפוי של פפטידים digly שזוהו עבור כל תנאי. יצוין כי מספרים אלה הם רק הערכות ותלוי בסוג של ספקטרומטר המסה בשימוש. איור 4 מציג את החפיפה בין הזהויות הפפטיד של digly עם כמויות נמוכות, בינוניות וגבוהות של חומר קלט.
על מנת להמחיש את הערך המוסף של השיפורים עבור ניתוח האתר אוביקווינציה שתוארו לעיל, אנו גם ביצעו ניתוח אוביקווימטיקה כמותי של SILAC המסומנים בתאי הלה שטופלו עם המעכב מעכב פרוטאסדום לעומת תאים בקרה מטופל בתוך החלפת תווית כפולה. יותר ממחצית (> 55%) של כל פפטידים מזוהה בשנת ה-IP היו פפטידים diGly. מעל 19,000 הפפטידים diGly ייחודיים זוהו, אשר רק מעט פחות מאשר במדגם לא SILAC התווית. הסיבה לכך עשויה להיות המורכבות הגבוהה יותר של MS1 ספקטרום בתוך שיטת SILAC בשל נוכחותם של זוגות הפסגה פפטיד. בניתוח SILAC הבדלים גדולים יחסית נצפו בין המספרים של פפטידים diGly שזוהו באופן בלעדי במצב הקדמי (כלומר, בורזוזומב תאים מטופלים בערוץ כבד, בקרת תאים בערוץ האור) ואת אלה שזוהו באופן בלעדי במצב הפוך (כלומר, בורטזומב תאים מטופלים בערוץ האור, בקרת תאים בערוץ כבד), במקרה זה 1,752 מול 6,356 (טבלה משלימים 1). בעת הפעלת התוכנה MaxQuant ב "ריבוי = 2" (כלומר, שני ערוצים SILAC) מצב, 7,555 הפפטידים diGly זוהו עם עוצמת אפס בערוץ כבד (כמעט כל מגיע הניסוי ההפוך) וערך שאינו אפס עוצמה בערוץ האור. לעומת זאת, שום פפטידים diGly אחד לא זוהה עם ערך שאינו אפס עוצמה בערוץ כבד מלווה בערך אפס עוצמה בערוץ האור. כאשר ניתוח MaxQuant על אותה ערכת נתונים בוצעה במצב "ריבוי = 1" עם הmoiety diGly ואת חומצת האמינו בתווית בשילוב לשינוי אחד משתנה בודד, הרבה משתני הפפטיד diGly כבד זוהו, גם כאשר לא קבילה אור של פפטיד כי ניתן לזהות. ההסבר הסביר ביותר לכך הוא חוסר היכולת של התוכנה להתמודד עם זיהוי פפטידים diGly כי הם באופן בלעדי בערוץ כבד. תופעה זו עשויה להתרחש באופן נרחב, כי העיכוב של פרוטאסדום יהיה להפעיל את היווצרות של אתרים אוביקווינציה הרומן. מתקתק את תיבת הסימון "שאילתה חוזרת" ב-MaxQuant, אשר פותחה כדי להתמודד עם בעיות אלה צריך לתקן את זה, נראה לא מספיק כדי למנוע את הבעיה לחלוטין. ברור, הרוב הרחוק של פפטידים diGly הם להיות upregulated או יצרו דה נובו על עיכוב פרוטאסדום, כי מעל שני שלישים של הבריכה פפטיד יש יחס H:L של לפחות 1.5 (איור 5ב).
לבסוף, התחלנו את שיטת ניתוח האתר אוביקווינציה לדגימת רקמה vivo. כדי להעריך את האפקטיביות, אנו המחולצים כ 32 מ"ג חלבון מהמוח העכבר הטרי (~ 10% של משקל רקמת רטוב הוא חלבון). חומר המוח לא טופלו מעכבי פרוטאסדום או כל מגיב אחר שיכול להגביר את החלבון הכולל אוביקווינציה. מתוך דוגמה זו, 10,871 הפפטידים הייחודיים של diGly זוהו (טבלה משלימה 2). כל הפפטידים diGly זיהה רקמה זו מקורו באתרים אנדוגניים של אוביקווינציה במצב יציב מצב. לא טיפול להגברת אוביקווינציה הכללית (למשל, עיכוב פרוטאסדום) הוטל. לפיכך, אנחנו ההשערה כי אלה אתרים אוביקווינציה לפחות באופן חלקי מעורבים (פולי) אוביקווינציה מעורב לא פרוטאסדום מתווך הסלולר אירועים, אשר בהסכמה עם רעיונות המוצעים בספרות5,16,22.
לסיכום, השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחקר העומק של אוביקוויבידום באופן שאינו מאפשר להשחתה. לקבלת מבט כולל על תוצאות טיפוסיות שהתקבלו עם הליך זה, ראה ואן דר וול אל.23.
איור 1: סקירה ניסויית. (א) מבט כולל על הגישה הניסיונית. הדגימות היו מוכנות, טריסינטזציה, ומאבקים לשלושה שברים בעזרת כרומטוגרפיה בשלב ההפוך עם הימנעות מהחומציות הגבוהה. חבילה אחת של מסחרי α-diGly מחרוזת נוגדן פפטיד התפצל לשישה שברים שווים את שלושת השברים פפטיד העמיסו אז על שלושה של שברים חרוז. הפפטידים הדיקטילי היו מוחלקים, שוחררו ונאספו, והזרימה הועברה לאחר מכן לשלושת החרוזים הטריים שנותרו. הפפטידים diGly שנאספו נותחו על ידי ספקטרומטר המוני על ספקטרומטר מסה של לומוס אורדרראפ על פי שיטת שתי שכבות המשלבת מחזור אחד שבו הפסגות האינטנסיביות ביותר נבחרו לראשונה עבור פיצול פפטיד ואת המחזור הבא שבו הפסגות הפחות אינטנסיבי נבחרו ראשון. הקבוצה המלאה של הפעלת nLC-MS/MS נותחו לאחר מכן באמצעות MaxQuant. (ב) אחד השברים אמור להכיל K48 משלו של אוביקוויב משלו טריטיק digly פפטיד ליפיינק (GG) QLEDGR (m/z 730.39). זה בהרבה פפטיד שופע ביותר בשבר immunoprecipitated והתאפיין בשיא אינטנסיבי ורחב ב-LC chromatogram בין 50-55 דקות על מעבר הדרגתי 120 דקות. אם השיא בחינת ביצועים נעדר מן chromatogram ה-IP היה כנראה נכשל. דמות זו השתנתה מוואן דר וול אל-23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מספר פפטידים diGly שאותרו עבור כל אחד משלושת שלבי השיפור. (א) השפעה מחפירה גסה לפני immunoprecipitation. החפיפה בין אוכלוסיות דיקלי פפטיד המזוהה בשלושת השברים הנפרדים מוצג. (ב) האפקט של שלבי הדגירה הראשון והשני. (ג) תוצאות של המשטר פיצול פפטיד מנוכי. דמות זו השתנתה מוואן דר וול אל-23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פפטידים DiGly זיהה שלושה משכפל ביולוגי של בורטזומ1 תאים מטופלים המציגים את כמות החפיפה בין הרצפים. דמות זו השתנתה מוואן דר וול אל-23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חפיפה של פפטידים diGly מזוהה מפני ניתוחים עם נמוך (4 מ ג), בינוני (10 מ"ג), ו גבוה (40 mg) כמויות קלט החלבון הכולל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: זיהוי פפטידים diGly בתאי התווית SILAC. (A) מספרי פפטידים שאותרו בתנאים קדימה והפוכים של silac המסומנים בתאי הלה עבור הגדרות ריבוי 1 ו-2. (ב) מגרש הארץ בבורזומב (בז) התייחס לתאי הלה (ב בורטדיאיב). רק פפטידים שזוהו והקוונו בניסויים קדימה והפוך מוצגים. דמות זו השתנתה מוואן דר וול אל-23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מצב | כמות חומר הקלט (mg) | המספר הצפוי של פפטידים diGly שזוהו |
| תאי הלה לא מטופלות | 10 | 7,500 |
| מעכב פרוטאסדום טיפל בתאי הלה | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | > 25000 | |
| רקמה (מוח עכבר) | 30 | > 10000 |
טבלה 1: מספרים צפויים של שמות פפטיד של diGly עבור תנאים שונים. מספרים אלה משמשים רק להערכה ותלויים בהגדרות הנסיוניות.
טבלה משלימה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
טבלה משלימה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן חל על דגימות ממקורות ביולוגיים שונים, כגון תאים מתורבתים ורקמות vivo. בכל המקרים זיהינו אלפי פפטידים diGly, בתנאי הסכום הכולל של החלבון כמות היה לפחות 1 מ ג. העשרה שימוש בנוגדנים ספציפיים היא יעילה מאוד, בהתחשב בכך שרק ברוב 100-150 מאוד נמוך מאוד הפפטידים diGly זוהו מתוך ליטים תא שלם אם לא הליכי העשרה עבור חלבונים אוביקטיתים או הפפטידים diGly הוחלו. ברור, ספקטרומטר מסה רגיש הוא תנאי מוקדם להשגת מספר גבוה של זהויות diGly. למרות שאנחנו השתמשנו בהצלחה מספר ספקטרומטר מסה שונים, מצאנו את Tribrid לומוס להיות הרגיש ביותר שנתן את התשואות הגבוהות ביותר.
כרומטוגרפיה מקוונת RP עם הימנעות pH גבוהה יש לבדוק לפני מתבצעות של ה-IP. החפיפה בין השברים במונחים של זהויות פפטיד צריכה להיות נמוכה ככל האפשר לניסוי אופטימלי. לאחר ה-IP, אחד השברים צריך להכיל את K48 של אוביקוויב משלו שונה טריטיק diGly פפטיד LIFAGK (GG) QLEDGR (m/z 730.39). זה בהרבה פפטיד שופע ביותר בשבר immunoprecipitated והוא מאופיין על ידי שיא אינטנסיבי רחב ב-LC chromatogram בין 50-55 דקות על הדרגתי 120 דקות (איור 1B). אם השיא בחינת ביצועים נעדר מן chromatogram, ה-IP היה כנראה נכשל.
חשוב לנתח את הפפטידים immunoprecipitated diGly מיד לאחר הליך ה-IP, כך הזמן בין ה-IP ניתוח צריך להישמר למינימום. במהלך הזמן הזה, פפטידים צריך להיות מאוחסן בבקבוקון זכוכית במקום צינורות פלסטיק. השארת פפטידים בצינורות פלסטיק זמן רב מדי, או ב-RT או ב-20 ° c, עלול לגרום משקעים של פפטידים ו/או דבק בקיר צינור פלסטיק. זה ישפיע בסופו של דבר על רגישות הניתוח.
למרות שהיו דיווחים בספרות על טעות פוטנציאלית מוטעה של addo, כגון אתרים אוביקווינציה בגלל שלהם זהה 114.04 Da המוני שינויים24, לא מצאנו שום אינדיקציה זה עם ההכנות שלנו של פפטידים immunoprecipitated טריטיים. ראשית, תופעות הלוואי של שימוש iodoamide (יאם) הם מינימליים בידינו באמצעות פרוטוקול הפחתת האללציה המתואר לעיל. שנית, הנוגדן הוא ספציפי פפטידים עם שארית דיגליצין. פפטידים עם שני iodoacetamide moieties מוסף לשקעי ליזין לא צריך להיות מועשר בפרוטוקול זה. שלישית, רוב הפפטידים בחלק הimmunoprecipitated הם upregulated על עיכוב פרוטאסדום, כפי שמתואר בניסוי SILAC שתוארו לעיל (איור 5). בגלל האוכלוסייה של חלבונים אוביקווילים מושפע כתוצאה של טיפול זה, סביר מאוד כי אלה פפטידים מושפעים הם אכן פפטידים diGly כתוצאה מחלבונים אוביקטילים.
לבסוף, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה בשילוב עם אסטרטגיה כמותית שפורסמה לאחרונה תוך שימוש בתורה מחודש19. ברור, למרות מספרי הפפטיד diGly שפורסמו נמוכים במקצת מאלה המתקבלים באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, היכולת לכמת יחסית עד 16 דגימות בו הוא יתרון עצום. שילוב שיטות אלה יאפשר לחוקרים לבצע מחקרים כמותיים בקנה מידה גדול בעומק רב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
עבודה זו היא חלק מהפרוייקט "חלבונים בעבודה", תוכנית של הולנד פרוטאומניקס מרכז ממומן על ידי הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) במסגרת מפת הדרכים הלאומית מתקנים מחקר בקנה מידה גדול (מספר פרוייקט 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
