Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa
Summary
Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.
Abstract
A modificação pós-tralácida das proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos celulares. Após a digestão tripé de proteínas ubiquitinadas, peptídeos com um remanescente diglíino conjugado ao grupo epsilon amino de lysina (‘K-ε-diglycine’ ou simplesmente ‘diGly’) podem ser usados para rastrear o local original de modificação. A imunopurificação eficiente dos peptídeos diGly combinados com a detecção sensível por espectrometria de massa resultou em um enorme aumento no número de locais de ubiquitinação identificados até o momento. Fizemos várias melhorias neste fluxo de trabalho, incluindo o fracionadode em fase inversa de pH off-line de peptídeos antes do procedimento de enriquecimento, e a inclusão de configurações mais avançadas de fragmentação de peptídeos no multipólo de roteamento de íons. Além disso, a limpeza mais eficiente da amostra usando um plugue baseado em filtro para reter as contas de anticorpos resulta em uma maior especificidade para peptídeos diGly. Essas melhorias resultam na detecção rotineira de mais de 23.000 peptídeos diGly de células cancerígenas do colo uterino humano (HeLa) sobre a inibição proteasome na célula. Mostramos a eficácia dessa estratégia para análise aprofundada dos perfis ubiquitino dos vários tipos de células diferentes e de amostras in vivo, como tecido cerebral. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina proteica para descobrir a ubiquitinome celular profunda.
Introduction
A conjugação de ubiquitina às proteínas marca-as para a degradação pelo proteasome e é um processo crucial na proteostasis. O grupo carboxyl c-terminal de ubiquitina forma uma ligação isopeptídeo com o grupo lysine ε-amino da proteína alvo1,2. Além disso, a ubiquitina pode ser anexada a outros módulos de ubiquitina, resultando na formação de estruturas homogêneas (ou seja, K48 ou K11) ou ramificadas (i.e., heterogêneas ou mistas) estruturas de poliubiquitina1,3. A função mais conhecida da ubiquitina é seu papel na degradação proteasômica, mediada pela poliubiquitina ligada ao K48. No entanto, tornou-se claro que tanto a mono- como a poliubiquitina também desempenham papéis em muitos processos que são independentes da degradação pelo proteasome. Por exemplo, as cadeias ligadas ao K63 têm papéis não degradativos no tráfico intracelular, degradação lisossômica, sinalização de quinase e resposta de dano de DNA4,5. Os outros seis tipos de ligação são menos abundantes e seus papéis ainda são em grande parte enigmáticos, embora as primeiras indicações sobre suas funções na célula estejam surgindo, em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas para permitir a detecção específica de ligação6,7.
A espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável para análises de proteome e hoje em dia milhares de proteínas diferentes de praticamente qualquer fonte biológica podem ser identificadas em um único experimento. Uma camada adicional de complexidade é apresentada por modificações pós-traduções (PTMs) de proteínas (por exemplo, fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação) que podem modular a atividade proteica. A identificação em larga escala de proteínas portadoras de PTM também foi possível graças aos desenvolvimentos no campo de espectrometria de massa. A estequiometria relativamente baixa de peptídeos portadores de PTMs em comparação com suas contrapartes não modificadas apresenta um desafio técnico e passos de enriquecimento bioquímico são geralmente necessários antes da análise de espectrometria de massa. Ao longo das últimas duas décadas, vários métodos específicos de enriquecimento foram desenvolvidos para a análise de PTMs.
Devido aos papéis multifacetados da ubiquitina proteica na célula, há uma grande demanda para o desenvolvimento de métodos analíticos para a detecção de locais de ubiquitina em proteínas8. A aplicação de métodos espectrométricos de massa levou a uma explosão do número de locais de ubiquitina identificados em proteínas de mosca-das-frutas, camundongos, humanos e leveduras99,10,,11,,12,,13,,14. Um passo importante foi apresentado pelo desenvolvimento de estratégias de enriquecimento baseadas em imunoprecipitação no nível do peptídeo usando anticorpos direcionados contra o motivo remanescente k-ε-GG (também referido como “diglycine” ou “diGly”). Estes peptídeos diGly são produzidos após a digestão de proteínas ubiquitinas usando tripsina como protease15,16.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado para enriquecer para peptídeos diGly usando imunopurificação e detecção subseqüente por espectrometria de massa orbitrap. Usando uma combinação de várias modificações dos fluxos de trabalho existentes, especialmente nas fases de preparação da amostra e espectrometria de massa, agora podemos identificar rotineiramente mais de 23.000 peptídeos diGly de uma única amostra de células HeLa tratadas com um proteasome inibidor e ~10.000 de células HeLa não tratadas. Aplicamos este protocolo a lysates de rotulagem de isótopos não rotulados e estáveis com aminoácidos na cultura celular (SILAC) rotulados células HeLa, bem como a amostras endógenas, como tecido cerebral.
Este fluxo de trabalho apresenta uma valiosa adição ao repertório de ferramentas para a análise de locais de ubiquitina, a fim de descobrir a ubiquitinome profunda. O protocolo a seguir descreve todas as etapas do fluxo de trabalho em detalhes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui foi aplicado a amostras de diversas fontes biológicas, como células cultivadas e tecido in vivo. Em todos os casos identificamos milhares de peptídeos diGly, desde que a quantidade total de entrada de proteínas fosse de pelo menos 1 mg. O enriquecimento utilizando anticorpos específicos é altamente eficiente, uma vez que apenas no máximo 100-150 peptídeos diGly muito baixos abundantes foram identificados a partir de lysatos celulares inteiros se não foram aplicados procedimentos de enri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho faz parte do projeto “Proteínas no Trabalho”, um programa do Centro de Proteômica dos Países Baixos financiado pela Organização Holandesa para a Pesquisa Científica (NWO) como parte do Roteiro Nacional de Instalações de Pesquisa em Larga Escala (projeto número 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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