Summary
We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.
Abstract
De posttranslationele modificatie van eiwitten door de kleine eiwitubiquitine is betrokken bij vele cellulaire gebeurtenissen. Na tryptische vertering van ubiquitinated eiwitten, peptiden met een diglycine rest geconjugeerd aan de epsilon aminogroep van lysine ('K-ε-diglycine' of gewoon 'diGly') kan worden gebruikt om de oorspronkelijke modificatie site terug te volgen. Efficiënte immunozuivering van diGly peptiden in combinatie met gevoelige detectie door massaspectrometrie heeft geresulteerd in een enorme toename van het aantal ubiquitinatiesites dat up-to-date is geïdentificeerd. We hebben verschillende verbeteringen aangebracht in deze workflow, waaronder offline hoge pH reverse-phase fractionatie van peptiden voorafgaand aan de verrijkingsprocedure, en de opname van meer geavanceerde peptide fragmentatie-instellingen in de ionenroutering multipole. Ook, efficiënter opruimen van het monster met behulp van een filter-gebaseerde plug om de antilichaam kralen te behouden resulteert in een grotere specificiteit voor diGly peptiden. Deze verbeteringen resulteren in de routinedetectie van meer dan 23.000 diGly peptiden uit menselijke cervicale kankercellen (HeLa) cellysaten bij proteasoomremming in de cel. We tonen de werkzaamheid van deze strategie voor diepgaande analyse van de ubiquitinomenprofielen van verschillende celtypen en van in vivo monsters, zoals hersenweefsel. Deze studie presenteert een originele aanvulling op de toolbox voor eiwitubiquitinatie analyse om de diepe cellulaire ubiquitinomen te ontdekken.
Introduction
De vervoeging van ubiquitine aan eiwitten markeert ze voor afbraak door het proteasoom en is een cruciaal proces in proteostase. De C-terminalcarboxylgroep van ubiquitine vormt een isopeptide band met de lysine ε-aminogroep van het doeleiwit1,2. Bovendien kan ubiquitine worden bevestigd aan andere ubiquitinemodules, wat resulteert in de vorming van homogene (d.w.z. K48 of K11) of vertakte (d.w.z. heterogene of gemengde) polyubiquitinestructuren1,3. De meest bekende functie van ubiquitine is zijn rol in proteasomale afbraak, bemiddeld door K48-gebonden polyubiquitine. Het is echter duidelijk geworden dat zowel mono- als polyubiquitinatie ook een rol spelen in vele processen die onafhankelijk zijn van afbraak door het proteasoom. K63-gebonden ketens hebben bijvoorbeeld niet-degradatieve rollen in intracellulaire handel, lysosomale afbraak, kinase signalering, en de DNA-schaderespons4,5. De andere zes koppelingstypen zijn minder overvloedig en hun rollen zijn nog steeds grotendeels raadselachtig, hoewel de eerste aanwijzingen over hun functies in de cel in opkomst zijn, grotendeels vanwege de ontwikkeling van nieuwe instrumenten om koppelingsspecifieke detectie mogelijk te maken6,7.
Massaspectrometrie is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument voor proteomen analyses en tegenwoordig duizenden verschillende eiwitten uit vrijwel elke biologische bron kan worden geïdentificeerd in een enkel experiment. Een extra laag van complexiteit wordt gepresenteerd door posttranslationele modificaties (PTMs) van eiwitten (bijvoorbeeld fosforylatie, methylatie, acetylatie en ubiquitinatie) die eiwitactiviteit kunnen moduleren. Grootschalige identificatie van PTM-dragende eiwitten is ook mogelijk gemaakt door ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie. De relatief lage stoimaginetry van peptiden met PTM's in vergelijking met hun ongewijzigde tegenhangers vormt een technische uitdaging en biochemische verrijkingsstappen zijn over het algemeen noodzakelijk voorafgaand aan de massaspectrometrieanalyse. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende specifieke verrijkingsmethoden ontwikkeld voor de analyse van PtM's.
Vanwege de veelzijdige rollen van eiwitubiquitinatie in de cel, is er een grote vraag naar de ontwikkeling van analytische methoden voor de detectie van ubiquitinatiesites op eiwitten8. De toepassing van massaspectrometrische methoden heeft geleid tot een explosie van het aantal geïdentificeerde ubiquitinatieplaatsen in fruitvlieg-, muizen-, menselijke en gisteiwitten9,10,1111,12,13,14. Een belangrijke stap werd gepresenteerd door de ontwikkeling van op immunoneerslag gebaseerde verrijkingsstrategieën op peptideniveau met behulp van antilichamen gericht tegen het K-ε-GG-restmotief (ook wel 'diglycine' of 'diGly' genoemd). Deze diGly peptiden worden geproduceerd bij de vertering van ubiquitineerde eiwitten met trypsine als protease15,16.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde workflow om te verrijken voor diGly peptiden met behulp van immunozuivering en daaropvolgende detectie door Orbitrap massaspectrometrie. Met behulp van een combinatie van verschillende wijzigingen van bestaande workflows, vooral in de monstervoorbereidings- en massaspectrometriestadia, kunnen we nu routinematig meer dan 23.000 diGly peptiden identificeren uit een enkel monster van HeLa-cellen die met een proteasoom worden behandeld remmer en ~ 10.000 uit onbehandelde HeLa-cellen. We hebben dit protocol toegepast op lysaten van zowel ongelabelde als stabiele isotopenetikettering met aminozuren in celkweek (SILAC) met het label HeLa-cellen en op endogene monsters zoals hersenweefsel.
Deze workflow vormt een waardevolle aanvulling op het repertoire van tools voor de analyse van ubiquitinatiesites om de diepe ubiquitinomen te ontdekken. Het volgende protocol beschrijft alle stappen van de werkstroom in detail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik (EDC) van het Erasmus MC.
1. Bereiding van de monsters
- Gekweekte cellen
- Selecteer een cellijn van belang (bijvoorbeeld HeLa- of osteosarcoom [U2OS]-cellen) en kweek de cellen in Dulbecco's Minimal Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine.
- Voor kwantitatieve proteomics experimenten, cultuurcellen in DMEM ontbreekt arginine en lysine. Het medium moet worden aangevuld met 10% gedialyseerd foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine en alanine-glutamine. Maak twee soorten media door conventionele lysine en arginine ('Light' Medium) of lysine-8 (13C6; 15N2) en arginine-10 (13C6; 15N4) ('Heavy' Medium), respectievelijk.
- Kweekbatches van cellen in Light Medium (d.w.z. ongelabeld) en Heavy Medium (d.w.z. gelabeld, SILAC) voor ten minste zes verdubbelingen voor uitbreiding en behandeling om ervoor te zorgen dat alle eiwitten in de Heavy Medium-cultuur zijn gelabeld met zware stabiele isotoop Aminozuren.
- Behandel de cellen 8 uur met 10 μM van de proteasoomremmer bortezomib of een gelijkwaardig volume DMSO als een mock behandeling. Was de cellen met PBS, scheiden ze met behulp van 1% trypsine / EDTA, en pellet de cellen.
- Lyse de celpellet van één 150 cm2 kweekplaat per geteste toestand in 2 mL ijskoud 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) met 0,5% natriumdeoxycholaat (DOC). Kook het lysaat op 95 °C gedurende 5 min en sonicaat gedurende 10 min (instelling "H" voor de sonicator vermeld in de Tabel van materialen) op 4 °C. We raden het gebruik van deubiquitinase-remmers zoals N-ethylmaleimide (NEM) niet aan, omdat dit ongewenste eiwitmodificaties kan introduceren die de identificatie van peptiden kunnen bemoeilijken.
- In vivo muishersenweefsel
- Bij het gebruik van in vivo weefsel, lyse het weefsel in een ijskoude buffer met 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM natrium DOC, en 12 mM natrium N-lauroylsarcosinaat17. Sonicate het lysaat gedurende 10 min (instelling "H" voor de sonicator vermeld in de Table of Materials) bij 4 °C en kook het lysaat gedurende 5 min bij 95 °C.
- Quantitate de totale eiwithoeveelheid met behulp van een colorimetrische absorptie BCA eiwit test kit. De totale hoeveelheid eiwit moet ten minste enkele milligram voor een succesvolle diGly peptide immunoneerslag (IP). Voor SILAC-experimenten mengen de lichte en zware gelabelde eiwitten in een 1:1-verhouding op basis van de totale eiwithoeveelheid.
- Verminder alle eiwitten met 5 mM 1,4-dithiothreitol gedurende 30 min bij 50 °C en alkylaat ze vervolgens met 10 mM iodoacetamide gedurende 15 min in het donker. Voer eiwitvertering uit met Lys-C (1:200 enzym-substraatverhouding) gedurende 4 uur, gevolgd door 's nachts spijsvertering met trypsine (1:50 enzym-substraat verhouding) bij 30 °C of bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg trifluorazijnzuur (TFA) toe aan het verteerd monster tot een eindconcentratie van 0,5% en centrifugeer het monster op 10.000 x g gedurende 10 min om alle wasmiddel neer te slaan en te verwijderen. Verzamel de supernatant met de peptiden voor de daaropvolgende fractionering.
2. Offline peptide fractionatie
- Gebruik hoge pH reverse-phase (RP) C18 chromatografie met polymere stationaire fase materiaal (300 Å, 50 μM; zie Tabel van materialen) geladen in een lege kolom cartridge om de tryptische peptiden fractioneren. De stationaire fasebedgrootte moet worden aangepast aan de hoeveelheid eiwitvergister die moet worden gefractioneerd. Bereid een lege kolomcartridge van 6 mL (zie Materiaaltabel)gevuld met 0,5 g stationair fasemateriaal voor ~ 10 mg eiwitvertering. De eiwitsamenvatting tot stationaire faseverhouding moet ongeveer 1:50 (w/w) zijn.
- Laad de peptiden op de voorbereide kolom en was de kolom met ongeveer 10 kolomvolumes van 0,1% TFA, gevolgd door ongeveer 10 kolomvolumes van H2O.
- Maak de peptiden los in drie fracties met 10 kolomvolumes van 10 mM ammoniumformaatoplossing (pH = 10) met respectievelijk 7%, 13,5% en 50% acetonitril (AcN). Lyophilize alle fracties tot volledigheid.
- Gebruik ubiquitine rest motief (K-ε-GG) antilichamen geconjugeerd om eiwit A agarose kralen voor de immunoverrijking van diGly peptiden. Omdat de exacte hoeveelheid antilichamen per partij kralen eigendomsinformatie is en niet openbaar wordt gemaakt door de fabrikant, wordt aanbevolen om dezelfde definitie te gebruiken voor een partij kralen als de fabrikant doet om verwarring te voorkomen. Was een partij van deze kralen 2x met PBS en splits de kraal drijfmest in zes gelijke fracties. Zie figuur 1 voor een gedetailleerd experimenteel schema.
- Los de drie peptidefracties op die verzameld zijn in stap 2.3 in 1,4 mL van een buffer bestaande uit 50 mM MOPS, 10 mM natriumfosfaat en 50 mM NaCl (pH = 7,2) en draai het puin naar beneden.
- Voeg de supernatanten van de fracties toe aan de diGly antilichaamkralen en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C op een rotator-eenheid. Draai de kralen naar beneden en breng de supernatant over op een verse partij antilichaamkralen en incubeer opnieuw voor 2 uur bij 4 °C.
- Bewaar de supernatants voor de daaropvolgende wereldwijde proteome (GP) analyse.
- Breng de kralen van elke fractie over in een 200 μL pipettip uitgerust met een GF/F filterplug om de kralen te behouden. Doe de pipettip met de kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 mL, uitgerust met een centrifugetipadapter. Was de kralen 3x met 200 μL ijskoude IAP buffer en vervolgens 3x met 200 μL ijskoude milliQ H2O. Draai de kolom op 200 x g voor elke wasstap, maar zorg ervoor dat de kolom niet droog loopt. Los de peptiden af met 2 cycli van 50 μL van 0,15% TFA.
- Desalt de peptiden met behulp van een C18 fase tip (in wezen een 200 μL pipet tip met twee C18 schijven) en droog ze tot volledigheid met behulp van vacuüm centrifugatie.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Voer LC-MS/MS experimenten uit op een gevoelige massaspectrometer gekoppeld aan een nanoflow LC-systeem.
- Gebruik een in-house verpakte 50 cm omgekeerde-fase kolom met een 75 μm binnendiameter verpakt met CSH130 hars (3,5 μm, 130 Å) en los de peptiden met een gradiënt van 2−28% (AcN, 0,1% FA) over 120 min bij 300 nL/min. Alternatief, gebruik commercieel beschikbare LC kolommen met vergelijkbare eigenschappen. Houd de kolom op 50 °C met behulp van een kolomoven, bijvoorbeeld (zie Tabel van materialen).
- Voer de massaspectrometrieanalyse uit.
- De massaspectrometer moet worden bediend in de DDA-modus (data-dependent acquisition). MS1-massaspectra moeten worden verzameld bij hoge resolutie (bijvoorbeeld 120.000), met een automatische versterkingscontrole (AGC) doelinstelling van 4E5 en een maximale injectietijd van 50 ms in het geval van een Orbitrap massaspectrometer.
- Voer eerst de massaspectrometrieanalyse uit in de modus "Hoogste intensiteit eerst". Op deze manier wordt de meest intense ionen eerst geselecteerd voor fragmentatie, dan de op een na hoogste, enzovoort, met behulp van de topsnelheid methode met een totale cyclustijd van 3 s. Voer vervolgens een tweede ronde DDA MS-analyse uit in de modus "Laagste intensiteit eerst", zodat de minst intense ionen eerst worden geselecteerd, vervolgens de op één na laagste, enzovoort. Deze strategie zorgt voor een optimale detectie van zeer lage abundancy peptiden.
- Filter de voorloperionen op basis van hun ladingstoestanden (2-7 ladingen) en monoisotopische piektoewijzing. Sluit eerder ondervraagde precursoren dynamisch uit voor 60 s. Isoleer peptideprecursoren met een quadrupole massafilter ingesteld op een breedte van 1,6.
- Verzamel MS2-spectra in de ionenval bij een AGC van 7E3 met een maximale injectietijd van 50 ms en HCD-botsenergie van 30%.
4. Gegevensanalyse
- Analyseer de massaspectrometrie ruwe bestanden met behulp van een geschikte zoekmachine, zoals de vrij beschikbare MaxQuant software suite op basis van de Andromeda zoekmachine18,19. Selecteer in MaxQuant de standaardinstellingen met een paar aanpassingen die hieronder worden weergegeven. Stel de enzymspecificiteit in op trypsine, met het maximum aantal gemiste decolletés verhoogd tot drie. Stel lysine met een diGly restant (+114.04 Da), oxidatie van methionine en N-terminal acetylatie als variabele modificaties, en stel carbamidomethylatie van cysteïne als een vaste modificatie.
- Voer databasezoekopdrachten uit op een FASTA-bestand met eiwitsequenties die zijn gedownload van bijvoorbeeld de Uniprot-repository(https://www.uniprot.org/downloads)in combinatie met een lokmiddel en een standaard database met veelvoorkomende verontreinigingen die automatisch wordt geleverd door MaxQuant. Stel de false discovery rate (FDR) in op 1% en stel de minimumscore in voor gewijzigde (diGly) peptiden op 40 (standaardwaarde). Uitsluit peptiden die zijn geïdentificeerd met een C-terminal diGly gemodificeerd lysineresidu uit verdere analyse.
- Voor de kwantitatieve analyse van SILAC-experimentbestanden stelt u de veelheid in op "2" en herhaalt u stap 4.2.
- Voer alle downstream analyses uit (bijvoorbeeld statistieken, genontologieanalyses) met de Perseus module20 van de MaxQuant softwaresuite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ubiquitineerde eiwitten laten een 114.04 Da diglycine rest op de doel lysine residu wanneer de eiwitten worden verteerd met trypsine. Het massaverschil veroorzaakt door dit motief werd gebruikt om ondubbelzinnig te herkennen de site van alomtegenwoordigheid in een massaspectrometrie experiment. De strategie die we hier beschrijven is een state-of-the-art methode voor de verrijking en daaropvolgende identificatie van diGly peptiden door nanoflow LC-MS/MS (Figuur 1A). In deze studie werden zowel gekweekte cellen als in vivo materiaal gebruikt als de biologische bron van eiwitten, maar dit protocol is compatibel met elke bron van eiwitten. Na de stappen in het protocol moet het eenvoudig zijn om 10.000-25.000 diGly peptiden van 2-20 mg eiwitinput te identificeren. Om de mate van eiwitubiquitinatie in cellen te verhogen, kan een proteasoomremmer zoals bortezomib of MG132 enkele uren voor het oogsten van de cellen worden toegevoegd. Als er geen proteasoomremmer werd gebruikt, waren de aantallen geïdentificeerde diGly peptiden meestal aanzienlijk lager (30-40%).
We hebben verschillende verbeteringen aangebracht aan bestaande protocollen. Ten eerste wordt een ruwe fractionatie in drie fracties op basis van omgekeerde fase chromatografie en daaropvolgende elutie bij hoge pH uitgevoerd om de complexiteit van het peptidemengsel te verminderen. Deze fracties vertonen een zeer lage overlap in peptide-identificaties en vergelijkbare aantallen diGly peptiden moeten per fractie worden geïdentificeerd (figuur 2). Dit resulteert in grote aantallen unieke diGly peptiden geïdentificeerd in elk van deze fracties. Belangrijk is dat een van de fracties (meestal de tweede) ubiquitine's eigen K48 gemodificeerde tryptische diGly peptide LIFAGK (GG)QLEDGR (m/z 730.39) moet bevatten. Dit is veruit het meest voorkomende peptide in de immunoprecipitated fractie en wordt gekenmerkt door de intense en brede piek in het LC chromatogram (Figuur 1B). Dit is een benchmark chromatografische piek en als het ontbreekt aan het chromatogram het IP was waarschijnlijk niet succesvol.
Een andere verbetering is de aanpassing van de DDA-analyseprocedure is de ionenrouting multipool in de massaspectrometer. In conventionele top N data-dependent acquisition (DDA) worden N-pieken uit het MS1-spectrum geselecteerd voor fragmentatie. Deze fragmentatie regeling begint met de hoogste intensiteit piek eerste, gevolgd door de piek van de tweede hoogste intensiteit, en ga zo maar door. In een alternatieve fragmentatieregeling wordt eerst de minst intense piek geselecteerd, gevolgd door de op een na minst intense piek, enz. De reden achter deze volgorde van selectie is dat er voldoende tijd om zeer lage overvloedige peptiden ook fragment. In feite, vonden we dat het aantal peptide identificaties toeneemt wanneer de "hoogste eerste" en "laagste eerste" DDA loopt werden gecombineerd in vergelijking met een dubbele LC-MS analyse met standaard DDA-instellingen (dat wil zeggen, hoogste eerste). Voor uitgebreidere ubiquitinomenprofilering wordt daarom aanbevolen om de LC-MS-runs te combineren met "hoogste eerste" en "laagste eerste" fragmentatieregimes in de data-analyseprocedure. Deze "laagste eerste" strategie kan produceren meer dan extra 4.000 unieke diGly peptiden, die niet werden gedetecteerd toen alleen de conventionele DDA-regime werd gebruikt (Figuur 2).
Ten slotte kunnen extra IP's van de flowthrough na het eerste IP nog eens ~ 2.500 unieke diGly peptiden produceren (figuur 2).
Artikelen in de literatuur over ubiquitinatie profilering meestal verslag rond 10.000 geïdentificeerddiGly peptiden12,21. Hier, van alle diGly peptiden geïdentificeerd meer dan drie biologische repliceren schermen, >9,000 aanwezig waren in alle drie, terwijl >17,000 aanwezig waren in ten minste twee van de drie replica's (Figuur 3). Typisch, na het protocol hier beschreven moet men identificeren >21,000 unieke diGly peptiden uit een 15-20 mg eiwitmonster met behulp van een standaard partij van CST antilichaam kralen. In termen van zuiverheid en selectiviteit moet de verhouding tussen geïdentificeerde diGly peptiden en ongewijzigde peptiden altijd >0.5 zijn. Het aantal diGly peptide identificaties was sterk afhankelijk van de hoeveelheid eiwit input materiaal. Een IP uitgevoerd met slechts 1 mg input materiaal geproduceerd ongeveer 2.500 diGly peptide identificaties, terwijl met 10 mg eiwit input materiaal >15,000 diGly peptide identificaties werden geproduceerd. Tabel 1 bevat het verwachte aantal geïdentificeerde diGly peptiden voor elke aandoening. Opgemerkt moet worden dat deze getallen slechts schattingen zijn en afhankelijk zijn van het type massaspectrometer dat wordt gebruikt. Figuur 4 toont de overlap tussen diGly peptide-identificaties met lage, gemiddelde en hoge hoeveelheden invoermateriaal.
Om de toegevoegde waarde van de hierboven beschreven verbeteringen voor ubiquitinatiesiteanalyse te illustreren, hebben we ook een kwantitatieve ubiquitinomische analyse uitgevoerd van SILAC-gelabelde HeLa-cellen die werden behandeld met de proteasoominhibitor bortezomib in vergelijking met onbehandelde controlecellen in een dubbele labelswaptest. Meer dan de helft (>55%) van alle geïdentificeerde peptiden in het eluaat op IP waren diGly peptiden. Meer dan 19.000 unieke diGly peptiden werden geïdentificeerd, wat slechts iets minder is dan in een niet-SILAC gelabeld monster. De reden hiervoor kan de hogere complexiteit van MS1-spectra in een SILAC-test zijn vanwege de aanwezigheid van peptidepiekparen. In de SILAC-analyse werden relatief grote verschillen waargenomen tussen de aantallen diGly peptiden die uitsluitend in de voorwaartse toestand werden geïdentificeerd (d.w.z. bortezomib behandelde cellen in het zware kanaal, controlecellen in het lichtkanaal) en cellen die uitsluitend in omgekeerde toestand zijn geïdentificeerd (d.w.z. bortezomib behandelde cellen in het lichtkanaal, controlecellen in het zware kanaal), in dit geval 1.752 versus 6.356 (Aanvullende tabel 1). Bij het gebruik van de MaxQuant-software in de "multipliciteit = 2" (d.w.z. tweekanaals SILAC)-modus werden 7.555 diGly peptiden geïdentificeerd met nulintensiteit in het zware kanaal (vrijwel allemaal in het omgekeerde experiment) en een niet-nulintensiteitswaarde in het lichtkanaal. Daarentegen werden geen enkele diGly peptiden geïdentificeerd met een niet-nulintensiteitswaarde in het zware kanaal, vergezeld van een nulintensiteitswaarde in het lichtkanaal. Wanneer een MaxQuant analyse op dezelfde dataset werd uitgevoerd in de "multipliciteit = 1" modus met de diGly moiety en het gelabelde aminozuur gecombineerd in een enkele variabele modificatie, veel zware diGly peptide varianten werden geïdentificeerd, zelfs wanneer er geen lichte tegenhanger van dat peptide kon worden gedetecteerd. De meest waarschijnlijke verklaring hiervoor is het onvermogen van de software om te gaan met de identificatie van diGly peptiden die uitsluitend aanwezig zijn in het zware kanaal. Dit fenomeen zal waarschijnlijk op grote schaal optreden, omdat de remming van het proteasoom de vorming van nieuwe ubiquitinatiesites zal veroorzaken. Het aanvinken van de optie "requant" in MaxQuant, dat is ontwikkeld om deze problemen aan te pakken en hiervoor moet corrigeren, lijkt onvoldoende om dit probleem volledig te voorkomen. Uiteraard wordt de grote meerderheid van diGly peptiden upregulated of gevormd de novo bij proteasole remming, omdat meer dan twee derde van de peptide pool hebben H: L ratio's van ten minste 1,5 (Figuur 5B).
Ten slotte hebben we deze ubiquitinatiesiteanalysemethode toegepast op een in vivo weefselmonster. Om de effectiviteit te beoordelen, haalden we ongeveer 32 mg eiwit uit verse muishersenen (~10% van het natte weefselgewicht is eiwit). Het hersenmateriaal werd niet behandeld met proteasoomremmers of andere reagens die de algehele eiwitubiquitinatie konden stimuleren. Uit dit monster werden 10.871 unieke diGly peptiden geïdentificeerd (Aanvullende tabel 2). Alle diGly peptiden geïdentificeerd in dit weefsel afkomstig zijn van endogene locaties van ubiquitinatie in een steady-state situatie. Er werd geen behandeling opgelegd om de wereldwijde alomtegenwoordigheid te stimuleren (bijvoorbeeld proteasoomremming). We veronderstellen dan ook dat deze ubiquitinatiesites ten minste gedeeltelijk het gevolg zijn van (poly)ubiquitinatie die betrokken is bij niet-proteasole gemedieerde cellulaire signaleringsgebeurtenissen, wat in overeenstemming is met ideeën die in de literatuurwordenvoorgesteld 5,16,22.
Tot slot, de hier beschreven methode maakt het mogelijk om de ubiquitinomen op een reproduceerbare manier te verkennen. Voor een overzicht van de typische resultaten verkregen met deze procedure zie Van Der Wal et al.23.
Figuur 1: Experimenteel overzicht. (A) Overzicht van de experimentele aanpak. Monsters werden voorbereid, trypsinized, en gefractioneerd in drie fracties met behulp van reverse-phase chromatografie met hoge pH elution. Een partij van commerciële α-diGly peptide antilichaam kralen werd opgesplitst in zes gelijke fracties en de drie peptide fracties werden vervolgens geladen op drie van de kraal fracties. De diGly peptiden werden immunopurified, geëlueerd, en verzameld, en de flowthrough werd vervolgens overgebracht naar de drie resterende verse kralen fracties. De verzamelde diGly peptiden werden geanalyseerd door massaspectrometrie op een Lumos Orbitrap massaspectrometer volgens een twee-tier schema combineren van een cyclus waarin de meest intense pieken werden voor het eerst geselecteerd voor peptide fragmentatie en de volgende cyclus waarin de minst intense pieken werden geselecteerd eerst. De volledige set nLC-MS/MS runs werden vervolgens geanalyseerd met behulp van MaxQuant. (B) Een van de breuken moet ubiquitine's eigen K48 gemodificeerde tryptische diGly peptide LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) bevatten. Dit is veruit het meest voorkomende peptide in de immunoprecipitated fractie en werd gekenmerkt door de intense en brede piek in het LC chromatogram tussen 50-55 min op een 120 min gradiënt. Als deze benchmarkpiek afwezig is in het chromatogram, was het IP waarschijnlijk niet succesvol. Dit cijfer is gewijzigd van Van Der Wal et al.23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Aantallen diGly peptiden gedetecteerd voor elk van de drie verbeteringsstappen. (A) Effect van ruwe fractionatie voorafgaand aan immunoprecipitatie. De overlap tussen diGly peptide populaties geïdentificeerd in de drie afzonderlijke fracties wordt getoond. bB) Effect van de eerste en tweede incubatiestappen. (C) Resultaten van de aangepaste peptide fragmentatie regime. Dit cijfer is gewijzigd van Van Der Wal et al.23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: DiGly peptiden gedetecteerd in drie biologische replica's van bortezomib behandelde cellen met de hoeveelheid overlap tussen de runs. Dit cijfer is gewijzigd van Van Der Wal et al.23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Overlapping van geïdentificeerde diGly peptiden uit analyses met lage (4 mg), medium (10 mg) en hoge (40 mg) totale eiwitinput bedragen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Detectie van diGly peptiden in SILAC gelabelde cellen. (A) Aantallen peptiden die zijn gedetecteerd in de voorwaartse en omgekeerde omstandigheden van de SILAC-gelabelde HeLa-cellen voor veelheidsinstellingen 1 en 2. (B) Scatterplot van diGly peptide SILAC ratio's in Bortezomib (Btz) behandelde HeLa cellen. Alleen peptiden die werden geïdentificeerd en gekwantificeerd in zowel voorwaartse als omgekeerde experimenten worden getoond. Dit cijfer is gewijzigd van Van Der Wal et al.23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Voorwaarde | Hoeveelheid invoermateriaal (mg) | Verwacht aantal geïdentificeerde diGly peptiden |
| Onbehandelde HeLa cellen | 10 | 7,500 |
| Proteasoomremmer behandelde HeLa-cellen | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Weefsel (muishersenen) | 30 | >10.000 |
Tabel 1: Verwachte aantallen diGly peptide identificaties voor verschillende omstandigheden. Deze getallen zijn slechts schattingen en zijn afhankelijk van de gebruikte experimentele instellingen.
Aanvullende tabel 1. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende tabel 2. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol werd toegepast op monsters uit verschillende biologische bronnen, zoals gekweekte cellen en in vivo weefsel. In alle gevallen identificeerden we duizenden diGly peptiden, op voorwaarde dat de totale eiwitinput hoeveelheid ten minste 1 mg was. De verrijking met behulp van specifieke antilichamen is zeer efficiënt, gezien het feit dat slechts maximaal 100-150 zeer lage overvloedige diGly peptiden werden geïdentificeerd uit hele cellysaten als er geen verrijkingsprocedures voor ubiquitineerde eiwitten of diGly peptiden werden toegepast. Uiteraard is gevoelige massaspectrometrie een voorwaarde voor het verkrijgen van grote aantallen diGly-identificaties. Hoewel we met succes verschillende massaspectrometers hebben gebruikt, vonden we de Orbitrap Tribrid Lumos de meest gevoelige die de hoogste opbrengsten gaf.
De offline RP-chromatografie met hoge pH-elutie moet worden getest voordat de IP's worden uitgevoerd. De overlap tussen de breuken in termen van peptide-identificaties moet zo laag mogelijk zijn voor een optimaal experiment. Na het OT moet een van de breuken ubiquitine's eigen K48 gemodificeerde tryptische diGly peptide LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) bevatten. Dit is veruit het meest voorkomende peptide in de immunoprecipitated fractie en wordt gekenmerkt door de intense en brede piek in het LC chromatogram tussen 50-55 min op een 120 min gradiënt(figuur 1B). Als deze benchmarkpiek ontbreekt in het chromatogram, is het IP waarschijnlijk niet succesvol geweest.
Het is belangrijk om de immunoprecipitated diGly tryptische peptiden onmiddellijk na de IP-procedure te analyseren, dus de tijd tussen het IP en de analyse moet tot een minimum worden beperkt. Gedurende die tijd moeten peptiden bij voorkeur worden opgeslagen in een glazen flesje in plaats van plastic buizen. Peptiden in plastic buizen te lang achterlaten, hetzij bij RT, hetzij bij -20 °C, kan leiden tot neerslag van peptiden en/of vasthouden aan de plastic buiswand. Dit zal uiteindelijk invloed hebben op de gevoeligheid van de analyse.
Hoewel er rapporten in de literatuur over de mogelijke verkeerde interpretatie van iodoacetamide adducten als ubiquitinatie sites vanwege hun identieke 114.04 Da massa verschuivingen24, hebben we geen enkele indicatie van deze gevonden met onze voorbereidingen van immunoprecipitated tryptische peptiden. Ten eerste, de bijwerkingen van het gebruik van iodoacetamide (IAM) zijn minimaal in onze handen met behulp van de alkylation-reductie protocol hierboven beschreven. Ten tweede is het antilichaam specifiek voor peptiden met een diglycine-overblijfsel. Peptiden met twee iodoacetamide moieties covalently toegevoegd aan lysine residuen mag niet worden verrijkt in dit protocol. Ten derde wordt de meerderheid van de peptiden in de immunoprecipitated fractie bij proteasoomremming opgetremeteerd, zoals blijkt uit het hierboven beschreven SILAC-experiment (figuur 5). Omdat de populatie van ubiquitinated eiwitten wordt beïnvloed als gevolg van deze behandeling, is het zeer waarschijnlijk dat deze aangetaste peptiden inderdaad diGly peptiden zijn als gevolg van ubiquitinated eiwitten.
Ten slotte zou dit protocol kunnen worden gebruikt in combinatie met een onlangs gepubliceerde gemultiplexed kwantitatieve strategie met tmt19. Uiteraard, hoewel de gepubliceerde diGly peptide nummers zijn iets lager dan die verkregen met behulp van het huidige protocol, de mogelijkheid om relatief kwantificeren tot 16 monsters tegelijkertijd is een enorm voordeel. Het combineren van deze methoden zal onderzoekers in staat stellen om grootschalige kwantitatieve ubiquitinomen studies uit te voeren in grote diepte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk maakt deel uit van het project "Proteins at Work", een programma van het Nederlands Proteomics Centrum gefinancierd door NWO in het kader van de Nationale Roadmap Grootschalige Onderzoeksfaciliteiten (projectnummer 184.032.201 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
