Summary
Kombinationen af transmissions elektronmikroskopi og i livmoderen transduktion er en kraftfuld tilgang til at studere morfologiske ændringer i den fine ultrastruktur af nervesystemet under udvikling. Denne kombinerede metode giver dyb indsigt i ændringer i strukturelle detaljer underliggende neuroplasticitet med hensyn til deres topografiske repræsentation.
Abstract
Den nuværende undersøgelse kombinerer i livmoderen transduktion med transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) sigter mod en præcis morphometrical analyse af ultrastrukturelle parametre i entydigt identificeret topografiske strukturer, ramt af en protein af interesse der er indført i organismen via viral overførsel. Dette kombinerede tiltag giver mulighed for en glidende overgang fra macrostructural til ultrastrukturelle identifikation af følgende topografiske navigationskort i et væv atlas. Høj opløsning elektronmikroskopi af i-utero-transduced væv afslører den fine ultrastruktur af neuropil og dets plasticitet parametre, såsom cross-sectioned synaptic bouton områder, antallet af synaptiske vesikler og mitokondrier inden for en Bouton profil, længden af synaptic kontakter, cross-sectioned cytoskeletale områder, tykkelsen af myelin skeder, antallet af myelin lamellae, og cross-sectioned områder af mitokondrier profiler. En analyse af disse parametre afslører afgørende indsigt i ændringer af ultrastrukturelle plasticitet i de områder af nervesystemet, der er berørt af den virale overførsel af den genetiske konstruktion. Denne kombinerede metode kan ikke kun bruges til at studere den direkte virkning af gensplejsede biomolekyler og/eller narkotika på neuronal plasticitet, men også åbner mulighed for at studere i livmoderen redning af neuronal plasticitet (f.eks. i forbindelse med neurodegenerative sygdomme).
Introduction
Ingen foton kan trænge en ultratynde væv modellen i dybde grade af en elektron. Dette tilskriver uvurderlige fordele til TEM erobre nanometer opløsning billeder i fine strukturer i forhold til lysmikroskopi teknikker. For eksempel, TEM giver mulighed for visualisering af intracellulære organeller som mitokondrier, melanosomer og forskellige typer af sekretorisk granulat, mikrotubuli, microfilaments, cilia, microvilli og intercellulære vejkryds (cellens overflade specialer), navnlig synapser i nervesystemet1,2,3,4. Det overordnede mål med de nuværende metodiske undersøgelse er ultrastrukturelle anerkendelse af ændringer i neural plasticitet under udvikling ved prænatal interferens ved at kombinere de state-of-the-art teknikker i livmoderen transduktion og TEM. Viralt kodede proteiner af interesse har været transduced i livmoderen i det centrale nervesystem5,6,7, herunder rygmarven6. For eksempel, er i livmoderen transduktion i kombination med TEM blevet brugt til at studere effekten af celle vedhæftning molekyle L1 på motordrevne læring plasticitet i L1-mangelfuld mus, navnlig med hensyn til samspillet mellem L1 og nukleare receptorproteiner i cerebellare neuroner7.
Analyse af neuroplasticitet parametre kræver præcise oplysninger om lokaliseringen af de mindste områder inden for nervesystemet. Derfor er det passende at beskrive ultrastrukturelle detaljer og deres nøjagtige topografiske orientering med hensyn til andre strukturer. I den foreliggende undersøgelse præsenteres en forberedende metode med henblik på en detaljeret undersøgelse af særskilte morfologiske områder baseret på både lys og elektronmikroskopi. Denne metode kombinerer flere teknikker til væv manipulation, begyndende med i livmoderen transduktion af musen hjernen og rygmarven og efterfulgt af perfusion fiksering, skimmel-indlejring, og behandling af væv til TEM. Et væsentligt skridt mellem integrering og behandling af væv til TEM er dokumentation af væv, ved hjælp af interferens lysrefleksion teknik, der giver mulighed for præcis microphotographic og lav forstørrelse dokumentationen af væv prøver8,9,10. Indarbejdet i den nuværende fremgangsmåde, denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge topografiske og strukturelle detaljer af nervevæv overflader og modellen skive profiler inden deres forberedelse til TEM.
En særlig ramme for skæring hele hjerner svarer til stereotaxisk koordinater. Denne ramme fordele morfologiske tredimensionale (3D) genopbygning af områder i nervevæv og kan bruges til morfometrisk analyse. Macrographs af sektionerne visualiseret tildeles topografiske koordinater, og de seriefremstillede nummererede afsnit bygge kort i et væv atlas.
Efter harpiks behandling, den indlejrede væv er opdelt i ultratynde sektioner (< 70 nm) der indeholder udvalgte områder, ifølge maps af ovennævnte væv atlas. De ultratynde afsnit udsættes for TEM at opnå høj opløsning billeder af plasticitet parametre (f.eks. tværsnit profil områder af synaptic boutons eller cytoskeletale fibre) af deres indhold og kontakter til nærliggende strukturer inden for komplekset neuropil.
Med den metode beskrevet heri, tillader overgangen fra visualiseret macrostructures til mikro- og nanostrukturer sammenlignende grundige undersøgelser af morfologiske neuronal plasticitet efter i utero transduktion af udviklingslandene nervøs system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer på animalsk emner er blevet godkendt af de institutionelle Dyreetik udvalg af de føderale stater i Hamburg og Nordrhein-Westfalen, Tyskland. Brug sterile instrumenter, beskyttelseshandsker og aseptisk frakker i hele hele den kirurgiske procedure.
1. i Utero transduktion
- Forberede adeno-associeret virustype 1 (AAV1), der koder for den ønskede mål (4 x 1011 virale partikler/µL af AAV1) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) pH-værdi på 7,4. Tilføje 0,1 mg/µL hurtigt grøn og holde AAV1-hurtig-Green blandingen ved 37 ° C.
- Forberede en tynd kapillær tip med den ønskede form (8 mm i længden, med en udvendig diameter på over 80 µm og en indvendig diameter på 50 µm), ved hjælp af en mikropipette puller (indstillinger: Tryk = 500, varme = 700, pull = 0, hastighed = 80, tid = 200, se tabel af materialer < / c1 >). Bryde spidsen af kapillar, så det er 4-5 mm.
- Samle en indsugningsventil rør (44 cm x 0,7 cm) med den kapillære spids og Opsug 15 µL af AAV1-hurtig-Green blandingen i kapillar.
- Holde de animalske fag på en konstant fysiologiske kropstemperatur på 37 ° C under hele proceduren.
- Placer en gravid C57Bl/6 mus (embryonale dag 14.5) i den preincubation afdeling og bedøver mus med gasformige 4% isofluran (med en volumetrisk luftstrømmen sats på 0,6-0,8 L/min).
- Subkutant, injicere buprenorphin (0,1 mg/kg legemsvægt).
- Opstille den bedøvede mus på prewarmed kirurgisk pladen (37 ° C).
- Dække øjnene med et smøremiddel.
- Passer mus med anæstesi maske (gasformige 1,5% isofluran med en volumetrisk luftstrømmen hastighed på 0,6-0,8 L/min.) på kirurgisk plade og barbering regionen abdominal hud. Tørre regionen glatbarberet med 3 X 75% ethanol og derefter betadine løsning.
Bemærk: Løbende overvåge vejrtrækning opførsel af bedøvede musen. Justere koncentrationen af isofluran gas efter indånding-udånding mønster af musen. - Check for fravær af den plantar refleks ved at klemme de bagben pote phalanges af musen.
- Åbn bughulen ved gribende huden med buede savtakket iris pincet (10 cm) og skære i huden langs linea mediana med lige wolframcarbid saks (10 cm), og derefter, gribende peritoneal væggen med lige Dumont pincet (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) og skære væg langs linea alba med lige Vanna saks (8 cm).
- Placer et stykke fenestrated paraffin film på den abdominale åbning og lave filmen på begge ender med mikro-myg hæmostatisk pincet (12,5 cm, buet).
- Udsætte de uterine horn med en ske-lignende anordning at undgå beskadigelse af embryoner inde de uterine horn. Dryppe et par dråber af PBS (37 ° C) på de uterin horn og inspicere embryoner for skader eller misdannelser inde den uterine sac.
- Dokumentere den orden og placeringen af embryoner i livmoderen horn. Drej embryoner omhyggeligt inde den uterine sac, indtil den ønskede position til injektion er nået.
- Injicér 1-2 µL af AAV1-hurtig-Green blanding af visuelt inspicere injektionsstedet (fx hjernen hjertekamrene) og farvestof penetration under et stereomikroskop.
- Dokumentere de injicerede embryoner og placere de uterine horn med de injicerede embryoner tilbage ind i bughulen.
- Dryppe et par dråber af PBS (37 ° C) ind i bughulen. Luk hulrummet af sutur peritoneal væggen (brug polyamid 6-0-størrelse suturer) og huden (brug polyamid 3-0-størrelse suturer), ved hjælp af Halsted's mosquito hæmostatisk pincet (12,5 cm, buet). Alternativt, brug en simpel afbrudt mønster eller rustfrit stål sutur/hæfteklammer for at lukke i bughulen og huden.
2. Telemacrophotography af isoleret væv
-
Forberedelse af buffere
- Forbered Sörensen's buffer (1 L) ved at opløse 14.95 g Na2HPO4 og 2.18 g KH2PO4 i 1 L destilleret vand under omrøring på 200 rpm. For perfusion af sene drægtigheden unger og/eller unger i den postnatale tidsperioder, bruge en passende størrelse af nåle til abdominal eller gastrisk injektion og sørg for, at koncentrationen af terminal natrium pentobarbital anæstesi ikke overstiger 180 mg / kg af kroppen vejer.
- Forberede Mugnainis fiksering løsning (5 L) ved opvarmning 500 mL destilleret vand til 75 ° C og tilføje 50 g PARAFORMALDEHYD pulver under omrøring i 200 rpm, tilføje 200 µL af 5 N NaOH, tilføje 1.500 mL af Sörensen's buffer, 1.750 mL destilleret vand , og 500 mL 25% glutaraldehyd. Fyld op til 5000 mL med destilleret vand. Brug denne endelige buffer for perfusion.
Bemærk: Forberede Mugnainis fiksering løsning under kølerhjelmen, bære beskyttelsesbriller og undgå røg. Tilføje methylenblåt (0,05 g/L) for en bedre visualisering af perfusion.
-
Musen perfusion og væv isolation
- Transcardially perfuse de gravide mus, der bærer de transduced embryoer (i tilfælde af embryo undersøgelser) eller de født transduced pubber i den ønskede alder (fx postnatal dag 24) Ifølge standardprocedurer6,7, 11,12,13,14,15,16,17, ved hjælp af intraperitoneal terminal natrium pentobarbital anæstesi (200 mg/kg legemsvægt).
- Injicere mus transcardially med heparin løsning (500 U) ved hjælp af en 26 G, 1 nål, og før fiksering, indgyde mus transcardially med 10 mL PBS til at skylle ud blod fra kroppen, og perfuse dem transcardially med 30 mL 40 ° C forvarmet Mugnaini fiksering løsning.
Bemærk: For voksne mus, udføre en alternativ retrograd perfusion via den abdominale aorta14. - Isolere det perfused væv af interesse (f.eks. hele hjernen eller rygmarven) og postfix væv i mindst 10 mL af Mugnainis fiksering løsning for en anden 24 h ved 4 ° C.
- Vask væv i 10 mL PBS i 3 timer ved stuetemperatur.
-
Indlejring i agarosegelelektroforese, plus dokumentation og skæring
- Justere den isolerede væv (f.eks. hele hjernen) i en særlig ramme med en reproducerbar skæring vinkel8,9,10. Alternativt kan du bruge en vibratome med en justerbar skære tykkelse.
- Placer den nervevæv i rammen, justere væv til telemacrography og dokumentere koordinaterne.
- Forbered 3% lav-smeltende Agarosen-embedding medium: tilsættes 3 g Agarosen i 100 mL af Sörensen's buffer og Opvarm blandingen i et vandbad til 90 ° C.
- Hæld 3% Agarosen (30 ° C) i den ramme, der indeholder væv. Dække rammen med et varmt metal blok og vente, indtil det er hærdning. Bruge telemacrographic enheder under hærdning, for at billedet den indlejrede væv og dets koordinater inden for rammen.
- Overføre Agarosen indstøbte vævet ind i en ramme med opskæring huller svarende til koordinaterne for det første billede.
- Skær den indlejrede væv i dele af ønskede tykkelse (fx, 1,5 mm) med en enhed med en tynd og vibrerende barberblad (Se Tabel af materialer).
Bemærk: For at forbedre barberblad gliding, dryppe et par dråber glycerin på den indlejrede væv. - Billede hver væv sektion i PBS og samle billederne i en mappe.
3. forberedelse af isoleret væv for transmissions Elektron Mikroskopi
Bemærk: Udføre alle yderligere skridt til inkubation i glas retter med stramt aflukkelige låg på en rystende platform under kølerhjelmen.
- Vask afsnittene væv til 2 x 30 min i PBS. Inkuber sektioner i 2% vandig osmium dinitrogentetraoxid løsning (OsO4) i 2 timer ved stuetemperatur.
Forsigtighed: Osmium dinitrogentetraoxid er giftigt og kan være skadelig, når det kommer i kontakt med huden. - Vask de osmicated sektioner til 2 x 30 min i PBS.
- Inkuber sektioner i 30%, 50% og 70% ethanol ved stuetemperatur i 10-15 min. (valgfri: inkuberes i 70% ethanol ved 4 ° C natten over).
- Billede osmicated modellerne i 70% ethanol under LED RGB lys8,9,10 (2 x 15 W) anvendes til prøven fra venstre og højre side i en vinkel på 45 °. Brug sort retter og en kedelig sort baggrund til at minimere spredning og refleksion af lys under belysning.
Forsigtighed: Tillad ikke afsnittet for at tørre ud under imaging. - Oprette et atlas i afsnittet billeder med koordinater ved at indsamle billeder i serie i en mappe.
- Inkuber modellerne i 100% ethanol (2 x til 30 min) og 100% propylenoxid (2 x til 30 min) ved stuetemperatur.
Forsigtighed: Tillad ikke sektioner til at tørre ud mens skiftende løsninger. - Bland 260 mL af harpiks med 240 mL af dodecenylsuccinic eddikesyreanhydrid i en glasbeholder mens forsigtigt omrøring med en glasbar. Kontrollér med jævne mellemrum for uensartethed, bobler og udstrygninger. Meget forsigtigt, omrøres i hånden i mindst 45 min.
- Forberede harpiks/propylenoxid i forholdet 1:2 og 1:1 og tilføje 3% accelerator (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
- Inkuber væv i 1:2 indlejring løsning fra trin 3.8 for 2 h og derefter i 1:1 indlejring løsning fra trin 3.8 i 2 timer ved stuetemperatur på en roterende hjul.
- Placer vævet i fladt polypropylen retter, dække vævet med frisk harpiks der indeholder 3% accelerator, og helbrede den indlejrede væv på 65-85 ° C i 12-24 timer.
- Køle ned den indlejrede væv til stuetemperatur og fjerne harpiks-embedded enhederne fra de polypropylen retter.
4. udvælgelse af ultrastrukturelle neuroplasticitet parametre for kvantitativ analyse
-
Kortlægning område af interesse
- Vælg et område af interesse (f.eks. hippocampus eller cerebellum) og lokalisere området i afsnittet atlas ved at vælge billedet fra atlas (trin 3.5), der indeholder dette område.
- Skitse grænser i området af interesse på afsnit billedet og find/sammenkopiere disse regionen grænser op til harpiks-modellen.
- Scratch-mark grænser i området af interesse (f.eks. hippocampus eller cerebellum) på harpiks modellen, ved hjælp af en fin nål gauge (26 G, 1 in).
- Opvarm resin modellen til 85 ° C i en ovn for at blødgøre harpiks for trimning eller alternativt bruge en trimning enhed, en tynd klinge eller sandpapir.
- Punktafgifter område af interesse fra harpiks modellen med et barberblad (Se Tabel af materialer). Montere modellen på holding barer af akryl glas af den krævede kaliber fx med (diameter 8 mm) og en længde på 1 cm med lim. Trim monteret modellen for semi- og ultratynde skæring.
- Forberede semithin (0,75 µm) og ultratynde (70 nm) afsnittene i det beskårne område ved hjælp af en ultramicrotome: sæt den på 1,5 mm/s for 0,75 µm tykkelse og 0,7 mm/s til 70 nm tykkelse.
- Indsamle de semithin sektioner på glas bærere og plette sektioner med 1% toluidin blå i PBS (for 4 min).
- Vask sektioner flere gange i ionbyttet vand. Undersøge de farvede afsnit under lysmikroskop bruger 4 x (NA af 0,1 ∞ /-), 10 x (NA af 0,22 ∞/0,17), 40 x (NA af 0,65 ∞/0,17), og 100 x (NA af 1,25 ∞/0,17) mål.
- Indsamle ultratynde sektioner på nikkel gitre. Forbehold TEM gitrene på 180 kV og på 3, 200 x, 6, 000 x, og/eller 8.000 x forstørrelse.
-
TEM analyse
- Vælg de ultrastrukturelle parametre af interesse for kvantitative TEM analyse (f.eks. boutons med vesikler og mitokondrier eller myelinerede og nonmyelinated axoner) og tage TEM billeder af disse parametre under 3 500 x, 6000 x og/eller 8.000 x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Talrige sikkerhedsparametre ansås for pålidelig og hurtig anæstesi af mus, og en optimeret arbejdsområde af anæstesi enhed viste sig for at være tilstrækkelig (fig. 1A). Enheden er designet til at styre blandingen af flydende isofluran og luften med en præcision, der er nødvendige for vellykket kirurgi på små dyr som mus og rotter. Luft og isofluran blandes i vaporizer ifølge de ønskede indstillinger og leveres i en kasse eller gennem en maske til dyret (fig. 1A). Scavenger indsamler og inaktiverer eventuelle overskydende isofluran gas, der kan fremstilles, hvilket giver et sikkert arbejdsmiljø. Gassen opsamles og passeret gennem aktiv kul i en patron (fig. 1A).
En optimeret sæt af instrumenter (figur 1B) giver forskerne til at udføre kirurgi hurtigt på gravide mus. En simpel paraffin film med hydrofobe egenskaber forhindrer mave slimhinden i tørring efter resektion (figur 1B). Uterin hornene husly embryonerne er udsat på paraffin film og embryonerne er nummereret i den måde, vist i figur 1C. Når lokaliseret, er at embryonerne justeret i den korrekte position for indsprøjtning af virus via en tynd kapillær (fig. 1D). Injektionen er visuelt kontrolleres ved at observere figuren diffusion af gennemtrængende farvestoffet indeholdt i injiceres virus blanding (fig. 1D). Efter injektion af i livmoderen, er uterus horn placeret tilbage i bughulen tillade udviklingen af de injicerede embryoner indtil fase (fx, indtil fødslen og nå postnatal dag 24), der er nødvendige for eksperimentet (se, for eksempel, Lutz et al.5 ,6 og Kraus et al.7). For studier på synaptisk plasticitet anbefales sene udviklingsmæssige eller voksen stadier.
Efter en transcardial perfusion af dyrene på det ønskede tidspunkt, er nervevæv (for eksempel, hjerne og rygmarv i figur 2) placeret og orienteret i en gennemsigtig plastik ramme med koordinater og indlejret i Agarosen (figur 2 A, B). Efter skæring, hvert afsnit er afbildet (figur 2C, E, G) og derefter osmicated. Efter osmication og inkubering i 70% eller 80% ethanol, er sektionerne afbildet igen ved hjælp af interferens lys telemacrography8,9,10. Afsnittene væv skal placeres i en kedelig sort omkring for at minimere spredt stråling under den krævede højintensive belysning. Fiber skrifter og forskellige områder af væv afspejler iriserende farver, kontrast mørke væv baggrund, og en specielt farvet mønster af væv overflade fremgår (figur 2D, F, H). Alle iriserende billeder er overlejret med de nonosmicated billeder, og sammen med de forventede koordinater af trinnet indlejring, de genererer navigationskort af væv topografi. Næste, er vævet yderligere dehydreret og indkapslet i harpiks. Baseret på navigationskort, interesseområder er valgt og videreforarbejdes til TEM-som eksempler, hippocampus (stratum lucidum), lillehjernen (granulet cellelag) og rygmarven (dorsale funiculus) er vist i figur 3A1-C4 .
I hippocampus og lillehjernen, er mossy fibre synapser kendt for at udstille unikke ultrastrukturelle karakteristika i forhold til andre synapser, herunder store præsynaptiske boutons (figur 3A1-B5). De kan nemt lokaliseres ved hjælp af de iriserende navigationskort etableret under de tidligere behandlingstrin. I deres tværsnit profiler, boutons indeholder et utal af vesikler og mitokondrier og meget ofte vedlægge flere dendritiske pigge (figur 3A4, A5, B4, B5). TEM billeder af disse profiler giver mulighed for kvantificering af cross-sectioned synaptic bouton områder, antal synaptiske vesikler og mitokondrier i en bouton profil, længden af synaptic kontakter, og antallet af kontakt websteder.
I rygmarven indeholder den dorsale funiculus mange cytoskeletale fibre, som er myelinerede af oligodendroglia. På tværgående sektioner, kan den dorsale funiculus findes mellem begge posterior horn af rygmarven på tværgående sektioner (figur 3C1, C2). På TEM billeder, cross-sectioned myelinerede axoner vises runde og myelin skeder omkring axoner er arrangeret i lameller (figur 3C3, C4). En kvantificering af cross-sectioned cytoskeletale områder, herunder tykkelsen af myelin skeder og antallet af myelin lamellae, samt en kvantificering af cross-sectioned mitokondrier profil områder kan gennemføres.
Rede atlas og mikrografiske TEM billederne af de ultrastrukturelle parametre er ikke kun nyttigt for en sammenligning af morfologiske neuroplasticitet på forskellige betingelser for behandling, men også når en sammenligning mellem parametre, inden for samme område er påkrævet (f.eks. en sammenligning, mellem forskellige slags synapser i hippocampus18 og tilsvarende strukturer af forskellige arter [figur 4]).
Figur 1 : Forberedelse til i livmoderen transduktion. (A) isofluran anæstesi setup: 1) induktion kammer for indledende anæstesi; 2) pumpe; 3) anæstesi enhed; 4) routing switch ventil; 5) anæstesi supply slanger; 6) skyllevæske enhed; 7) vejrtrækning maske; 8) opvarmet kirurgisk bord; 9) kikkert Stereoskopet med lyskilde; 10) styreenhed. (B) kirurgi udstyr: 1) elektrisk shaver; 2) øje lubricant; 3) fiksering bånd; 4) hygiejnebind; 5) iris pincet (10 cm, buet, savtakkede); 6 og 7) iris saks (11 cm, lige, tungsten carbide); 8) Dumont pincet (#3, 12 cm, lige, 0,2 mm x 0,12 mm); 9) Vanna saks (8 cm, straight); 10 og 11) mikro-myg hæmostatisk pincet (12,5 cm, buet); 12) paraffin film; 13) micro skeen; 14) bomuld svaberprøver; 15 og 16) Halsted myg hæmostatisk pincet (12,5 cm, straight); 17 og 18) suturer (størrelse 6-0 og 3-0); 19) sprøjte; 20) indsugningsventil tube forsamlinger for kalibreret microcapillary pipetter. (C) ordning af en systematisk nummerering af embryoner i de uterine horn på embryonale dag (E) 14,5: L = venstre; R = højre. (D) strategier af injektion: i første og anden hjerne hjertekamrene (jegve og IIve, henholdsvis), fjerde ventrikel (IVve) og rygmarven. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Dokumentation af isoleret væv af telemacrography. (A og B) Indlejring af en hjerne og en rygmarv i agarosegelelektroforese, bruge kuvetter med et koordinatsystem (gitre). Efter skæring, sektionerne er udsat for telemacrography og interferens refleksion light imaging. (C-F) Tværgående og sagittal dele af hjernen. Skalere barer = 5 mm; Co = cortex; St = striatum; di = diencephalon; mig = mesencephalon; Hej = hippocampus; PED = pedunculi cerebri; CE = lillehjernen; mo = medulla oblongata. (G og H) tværgående del af en cervikale segment af rygmarven. Skalalinjen = 1 mm; ahR = højre forreste horn; ahL = venstre forreste horn; DF = dorsale funiculus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Topografiske og ultrastrukturelle identifikation af plasticitet parametre. (A1) Inverteret indblanding lys macrograph af hippocampus. Regionen i mossy fiber boutons i stratum lucidum (sl) er fremhævet. PCL = pyramide cellelag; GCL = granulet cellelag. Skalalinjen = 500 µm. (A2) lys microphotograph (100 x mål) af en semithin sektion (0,75 µm) viser stratum lucidum. Stjernerne angiver regionerne i mossy fiber boutons, der omgiver mange dendritiske øer (sort pilespidser). Toluidin blå/OsO4 farvning. Skalalinjen = 50 µm. (A3) transmissions elektron Mikrograf ved en lav forstørrelse viser mossy fiber boutons (stjerner) omkring en dendrit (D). Rektanglet omfatter en enkelt mossy fiber bouton. Skalalinjen = 2 µm. (A4) transmissions elektron Mikrograf af profilen tværsnit af en enkelt mossy fiber bouton (MFB). Pigge (blå) og området tværsnit bouton (violet) er fremhævet. m = mitochondriet; s = pigge. Skalalinjen = 200 nm. (A5) Synaptiske vesikler inde en MFB. Skalalinjen = 100 nm. (B1) Inverteret indblanding lys macrograph af lillehjernen. Granulet cellelag (gcl) som indeholder mossy fiber boutons-regionen er indiceret. MCL = Molekylær lag; h = hilus. Skalalinjen = 500 µm. (B2) lys microphotograph (100 x mål) af en semithin sektion (0,75 µm) viser en region af granulet cellelag, der grænser til Purkinje celler (PC). Stjernerne angiver regionerne i mossy fiber boutons, der er omgivet af mange cerebellare granulet neuroner (CGN). Toluidin blå/OsO4 farvning. Skalalinjen = 50 µm. (B3) transmissions elektron Mikrograf ved lav forstørrelse, viser området af MFBs. Rektanglet omfatter en enkelt MFB. Skalalinjen = 2 µm. (B4) transmissions elektron Mikrograf af profilen tværsnit af en svamp-lignende MFB i granulet cellelag af lillehjernen. Tværsnit bouton området (violet) og vesikel-fri pigge (blå) er fremhævet. Skalalinjen = 1 µm. (B5) mitokondrier (violet) og synaptiske vesikler inde en MFB. Skalalinjen = 150 nm. (C1) Inverteret indblanding lys macrograph af rygmarven. Regionen i den dorsale funiculus (df), der indeholder stærkt myelinerede axoner er fremhævet. ahR og ahL = højre og venstre forreste horn, henholdsvis; phR og phL = højre og venstre bagerste horn, henholdsvis. Skalalinjen = 500 µm. (C2) lys microphotograph (100 x mål) af en semithin sektion (0,75 µm) viser den dorsale funiculus, der er beriget med stærkt myelinerede axoner (ax), der klart kan skelnes fra nonmyelinated fibre (stjerner). CT = bindevæv. Toluidin blå/OsO4 farvning. Skalalinjen = 50 µm. (C3) transmissions elektron Mikrograf af tværsnit profiler af myelinerede og nonmyelinated axoner (ax, violet). min = myelin skeder. Skalalinjen = 200 nm. (C4) Rektanglet viser high-forstørret, stærkt myelinerede axoner med myelin lamellae og nonmyelinated fibre. Mikrotubuli (mt) og mitokondrier (m) inden for den cytoskeletale fibre er synlige. Skalalinjen = 50 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Eksempler på ultrastrukturelle plasticitet parametre i forskellige dyremodeller. (A) Mossy fiber boutons i lillehjernen af en haj. Skalalinjen = 400 nm. (B) Mossy fiber bouton i hippocampus af en rhesus makak. Skalalinjen = 200 nm. (C) neuromuskulære junction af en kat. Skalalinjen = 300 nm. (D) Synaptic boutons i pars reticularis substantia nigra af en phalanger. Stjernerne angiver postsynaptiske tæthed (PSD; i indsatser: sort pilespidser). Rektanglet viser en forstørret PSD. Skalalinjen = 400 nm. (E) A nonmyelinating Schwann celle (SC) omkring mange cytoskeletale fibre i spinal ganglion musen. I nærheden er stærkt myelinerede fibre synlige. Skalalinjen = 300 nm. For alle paneler: ax = axon; D = dendrit; m = mitochondriet; MFB = mossy fiber bouton; MF = mossy fiber; min = myelin skeder; s = ryg; SA = rygsøjlen apparater; Sv = synaptiske vesikler. Kontakt websteder (postsynaptiske tæthed) er angivet med stjerner. Tværsnit områder fremhæves i violet og blåt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et afgørende skridt for in utero transduktion er proceduren injektion. Den præcise injektion i hjernens ventrikler eller i et andet område af interesse kræver erfaring og praktiske færdigheder. Jo tyndere microcapillary spids, de mindre vævsskade kan forekomme; Dette er dog på bekostning af stigende indsprøjtning pres. I modsætning til i livmoderen elektroporation19,20,21,22, overlevelsesraten for de injicerede embryoner efter in utero transduktion er meget høj. Alle embryoner af uterin horn kan injiceres, selv hvis embryoner er placeret ved roden af de uterine horn og skal justeres i den uterine sac. Udviklingsstadier af injektion og analyse kan tilpasses til den videnskabelige spørgsmål.
Når injiceres i hjernens ventrikler, fordeles AAV1 partiklerne via cerebrospinalvæske gennem hele ventrikulære systemet. Udvikle strukturer med overflader, der er i tæt kontakt med spiritus, såsom hippocampus og lillehjernen, er transduced af den anvendte viruspartikler5,6,7. En analyse af ændringerne i ultrastrukturelle parametre, såsom bouton størrelse, cross-sectioned bouton områder, antal synaptiske vesikler, antal mitokondrier, og tal og længden af synaptic kontakter i disse strukturer er en elegant udlæsning til ultrastrukturelle plasticitet. Metoden i livmoderen transduktion kan anvendes til at studere forskellige hjernen områder, samt rygmarven6. Desuden kan andre organer og væv ligeledes vælges som transduktion mål. Endelig, den ofte anvendte musemodel kan erstattes af andre arter som krævet.
Fotografering af væv skiver giver mulighed for en meget præcis dissektion af harpiks-embedded prøver for transmissions Elektron Mikroskopi. Da den rumlige orientering af prøven er defineret, blev omfattende og tidskrævende skæring udeladt. Desuden kan afgørende naboregionerne bevares i deres oprindelige forhold til hinanden. En vigtig fordel af fotografisk dokumentation trin er mulighed for at overvåge kvaliteten af væv fiksering og erkende patologiske ændringer. Kvaliteten af fiksering og indlejring af materialet er således af afgørende betydning. Nonsuitable prøver, der indeholder artefakter kan outsources før videre behandling.
Mikrograf serie af skiverne er afbildet væv giver et nyttigt morfologiske atlas. For sammenlignende neuroanatomical undersøgelser, som også kan omfatte sjældne arter, er atlas et værdifuldt arkiv. Valget af tykkelsen af skiverne er væv afhænger den adresserede videnskabelige spørgsmål og er begrænset af størrelsen af væv-modellen. For små dyr, bør en tykkelse på op til 1 mm justeres. Meget tyk sektioner (> 5 mm) er ikke anbefales på grund af den begrænsede udbredelse kapacitet af osmium dinitrogentetraoxid8,9,10.
Telemacrophotography dokumentation er afgørende for morphometrical undersøgelser. Det tilbyder en fast korrelation af væv overflade til side og top flyet af rammen og definerer placeringen af en given struktur i et rumlige koordinater. En kombination af den beskrevne metode med Elektrofysiologi18 eller rygmarv skade model, hvor plasticitet spiller en væsentlig rolle i revitalisering6, er muligt. For sammenlignende neuroanatomical undersøgelser, som også kan omfatte sjældne arter, er iriserende væv atlas og de mikrografiske TEM billeder af de ultrastrukturelle parametre værdifulde aktiver.
Trods sine styrker, TEM har flere begrænsninger på grund af tykkelsen størrelsen af prøven (70 nm), området cross-sectioned (< 6 mm2), og kompleksiteten af prøveforberedelsen. Men når modellen er præcist rede, TEM billeder af modellens ultrastruktur er af fineste kvalitet i forhold til billeder fremstillet af lys-mikroskopiske teknikker. I livmoderen transduktion teknik er begrænset af den injicerede volumen og den topografiske region af injektion. Ubestrideligt, teknikken har en stærk translationel medicinske potentiale i tidlig udviklingsmæssige behandling og redning af medfødte Neuropatologisk sygdomme. Desuden kan den nuværende kombination af i livmoderen transduktion med TEM ikke kun betragtes som en strategi for den fremtidige behandling af medfødte sygdomme, men også for høj kvalitet ultrastruktur-baserede udviklingsforstyrrelser diagnostik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke kolleger af det animalsk facilitet på det medicinske fakultet, Ruhr-Universität Bochum, for deres støtte og dyrs pleje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26 G x 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | - | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | - | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | - | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | - | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 mL | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| iris forceps (10 cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11 cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257mm x110 mm x 18 mm. Heating area: 190 mm x 90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | - | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | - | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | - | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | - | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | - | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | - | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6 mm Inner diameter: 4 mm Wa ll thickness: 1 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | - | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | - | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
