बीजाणु अधिशोषण एंजाइम और एंटीजन के लिए एक Nonrecombinant प्रदर्शन प्रणाली के रूप में
Summary
इस प्रोटोकॉल को विभिन्न जैविक गतिविधियों के साथ विषमजीवी अणुओं adsorb करने के लिए एक “लाइव” nanobiotechnological उपकरण के रूप में बैक्टीरियल बीजाणु के उपयोग पर केंद्रित है । अधिशोषण की कुशलता को मापने की विधियाँ भी दिखाई जाती हैं.
Abstract
बैक्टीरियल बीजाणु एक metabolically शांत सेल, सुरक्षात्मक एक निर्जला कोशिका द्रव्य आसपास के परतों की एक श्रृंखला के द्वारा गठित है । इस अजीब संरचना बीजाणु अत्यंत स्थिर और प्रतिरोधी बनाता है और एक मंच के रूप में बीजाणु का उपयोग करने के लिए विषम अणुओं को प्रदर्शित करने का सुझाव दिया है । अब तक, एंटीजन और एंजाइमों की एक किस्म बेसिलस सबटिलिस और कुछ अंय प्रजातियों के बीजाणुओं पर प्रदर्शित किया गया है, शुरू में एक पुनः संयोजक दृष्टिकोण द्वारा और फिर, एक सरल और कुशल nonrecombinant विधि द्वारा । nonrecombinant प्रदर्शन प्रणाली बीजाणु सतह पर विषमजातीय अणुओं के प्रत्यक्ष सोखना पर आधारित है, पुनः संयोजक उपभेदों के निर्माण से परहेज और पर्यावरण में आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया की रिहाई. अधिशोषित अणुओं को बीजाणुओं के साथ अंतःक्रिया द्वारा स्थिर और संरक्षित किया जाता है, जो प्रतिजनों के तेजी से क्षरण और प्रतिकूल परिस्थितियों में एंजाइम गतिविधि की हानि को सीमित करता है । एक बार उपयोग किया, बीजाणु-अधिशोषित एंजाइमों गतिविधि की एक ंयूनतम कमी के साथ आसानी से एकत्र की जा सकती है और अतिरिक्त प्रतिक्रिया दौर के लिए पुन: उपयोग । इस पत्र में दर्शाया गया है कि किस प्रकार मॉडल अणुओं को बी-सबटिल्सके शुद्ध बीजाणु के रूप में देखा जाता है, सोखना की दक्षता का मूल्यांकन कैसे किया जाता है, और उपयोग किए गए बीजाणु को नई प्रतिक्रियाओं के लिए रीसायकल करने के लिए कैसे एकत्र करना चाहिए ।
Introduction
डिस्प्ले सिस्टम का उद्देश्य सूक्ष्मजीवों की सतह पर जैविक रूप से सक्रिय अणुओं को प्रस्तुत करना और विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों को खोजना है, औद्योगिक से चिकित्सा और पर्यावरणीय जैव प्रौद्योगिकियों के लिए । phages के अलावा1,2 और विभिन्न ग्राम की कोशिकाओं-नकारात्मक और सकारात्मक प्रजातियों3,4,5,6,7, बैक्टीरियल बीजाणु भी किया गया है दो दृष्टिकोण8,9द्वारा प्रदर्शन प्रणाली के रूप में प्रस्तावित ।
अपनी विशिष्ट संरचना की वजह से, अर्थात् एक निर्जला कोशिका द्रव्य सुरक्षात्मक परतों की एक श्रृंखला से घिरा हुआ10, बीजाणु फैगे पर कई फायदे प्रदान करता है-और सेल आधारित प्रदर्शन प्रणालियों8,9। एक पहला लाभ है कि शर्तों पर बीजाणु की चरम मजबूती और स्थिरता से आता है कि अंय सभी10,11कोशिकाओं को हानिकारक होगा । बीजाणु प्रदर्शित एंटीजन और एंजाइम कमरे के तापमान12 पर लंबे समय तक भंडारण और कम पीएच और उच्च तापमान13पर गिरावट से संरक्षित करने के बाद स्थिर हैं । बीजाणु का दूसरा लाभ कई बीजाणु बनाने वाली प्रजातियों की सुरक्षा है । बी, बी clausii, बी coagulans, और कई अंय प्रजातियों प्रोबायोटिक्स के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल कर रहे है और मानव या पशु उपयोग के लिए बाजार पर दशकों के लिए किया गया है14,15। इस असाधारण सुरक्षा रिकॉर्ड एक सतह प्रदर्शन प्रणाली के लिए एक स्पष्ट सामांय आवश्यकता है और विशेष रूप से प्रासंगिकता की है जब प्रणाली मानव या पशु उपयोग16के लिए करना है । एक बीजाणु आधारित प्रदर्शन प्रणाली का एक तीसरा, महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह अणु है कि उजागर किया जाना है के आकार के लिए सीमाएं नहीं है । फैगे-आधारित सिस्टम में, एक बड़े विषम प्रोटीन कैप्सिड की संरचना को प्रभावित कर सकता है, जबकि सेल आधारित प्रणालियों में, यह झिल्ली की संरचना को प्रभावित कर सकता है या झिल्ली स्थानांतरण चरण17को ख़राब कर सकता है । बीजाणु आसपास सुरक्षात्मक परतों से अधिक ७० विभिन्न प्रोटीन से बना रहे हैं10 और काफी लचीला किसी भी स्पष्ट संरचनात्मक दोष या कार्यात्मक हानि के बिना बड़े विदेशी प्रोटीन स्वीकार करने के लिए कर रहे हैं8. इसके अलावा, दोनों बीजाणु आधारित प्रदर्शन प्रणालियों के साथ, विषमजातीय प्रोटीन की झिल्ली स्थानांतरण8,9की आवश्यकता नहीं है । दरअसल, विषमजातीय प्रोटीन या तो मदर सेल कोशिका द्रव्य में उत्पादित कर रहे हैं और बीजाणु कि एक ही कोशिका द्रव्य में बनाने या परिपक्व बीजाणु8,9पर अधिशोषित पर इकट्ठे हुए ।
बीजाणु प्रदर्शन शुरू में एक आनुवंशिक प्रणाली विकसित करने के लिए बीजाणु सतह18इंजीनियर द्वारा प्राप्त किया गया था । इस आनुवंशिक प्रणाली मैं पर आधारित था) जीन कोडन के बीच एक बीजाणु कोट प्रोटीन के लिए एक जीन संलयन के निर्माण (एक वाहक के रूप में इस्तेमाल किया) और प्रोटीन के लिए जीन कोडिंग प्रदर्शित किया जा करने के लिए-अंतर्जात के transcriptional और transcriptional संकेतों की उपस्थिति जीन फ्यूजन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करेगा, और ii) आनुवंशिक स्थिरता प्रदान करने के लिए बी. सबटिल्ज क्रोमोजोम पर चिमेरिक जीन का एकीकरण । एंटीजन और एंजाइमों की एक किस्म इस पुनः संयोजक दृष्टिकोण द्वारा प्रदर्शित किया गया है, वाहक के रूप में विभिंन बीजाणु सतह प्रोटीन का उपयोग कर और विभिंन संभावित अनुप्रयोगों पर लक्ष्य, म्यूकोसा वैक्सीन से biocatalyst के लिए लेकर, बायोसेंसर, biocatalyst, या bioanalytical उपकरण8,13।
हाल ही में, बीजाणु प्रदर्शन का एक अलग दृष्टिकोण विकसित किया गया है19। यह दूसरी प्रणाली nonrecombinant है और बीजाणु सतह9पर अणुओं की सहज और अत्यंत तंग सोखना पर निर्भर करता है । 19 एंटीजन,20 और एंजाइमों13,21 है कुशलता से प्रदर्शित किया गया है और पता चला है कि इस पद्धति को पुनः संयोजक एक से काफी अधिक कुशल है । यह nonrecombinant दृष्टिकोण20 देशी फार्म में प्रोटीन के प्रदर्शन की अनुमति देता है और भी autoclaved के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, मौत बीजाणु19. अधिशोषण का आण्विक तंत्र अभी तक पूर्ण रूप से स्पष्ट नहीं किया गया है । 13,19,22अधिशोषण के लिए प्रासंगिक गुणों के रूप में बीजाणु की ऋणात्मक आवेश और जलविरायता का प्रस्ताव किया गया है । हाल ही में, यह दिखाया गया है कि एक मॉडल प्रोटीन, लाल autoफ्लोरोसेंट प्रोटीन कोरल डिस्कोमा के (mrfp), जब बीजाणु को अधिशोषित, सतह भीतरी कोट में स्थानीयकृत परतों के माध्यम से घुसपैठ करने में सक्षम था23। यदि अंय प्रोटीन के लिए सच साबित कर दिया, विषमजातीय प्रोटीन के आंतरिक स्थानीयकरण उनकी वृद्धि की स्थिरता की व्याख्या जब23बीजाणु को अधिशोषित सकता है ।
हाल ही के एक अध्ययन में, दो एंजाइम xylan क्षरण मार्ग के दो क्रमिक कदम उत्प्रेरक स्वतंत्र रूप से बी सबटिलिस के बीजाणु पर प्रदर्शित किए गए थे और, जब एक साथ, दोनों क्षरण कदम21प्रदर्शन करने में सक्षम थे । प्रतिक्रिया के बाद एकत्र Spores अभी भी सक्रिय थे और ताजा सब्सट्रेट21के अलावा पर xylan गिरावट जारी रखने में सक्षम. यहां तक कि अगर अंतिम उत्पाद के बारे में 15% की हानि दूसरी प्रतिक्रिया21में मनाया गया था, एकल, साथ ही बहु कदम के लिए अधिशोषित एंजाइम के reusability, प्रतिक्रियाओं बीजाणु प्रदर्शन प्रणाली का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण लाभ है ।
पैन एट अल.24 बीजाणु की सतह पर विषम प्रोटीन प्रदर्शित करने के लिए एक अतिरिक्त दृष्टिकोण की सूचना: विषमकोण प्रोटीन (एक endoglucanase प्रोटीन और एक बीटा-गैलक्टोसिडेस एक) बीजाणु के दौरान मदर सेल में उत्पादित सहज थे वाहक की आवश्यकता के बिना, बनाने बीजाणु कोट में फेब्रिक । इस अतिरिक्त बीजाणु प्रदर्शन प्रणाली दो अब तक वर्णित दृष्टिकोण का एक संयोजन है । वास्तव में, यह पुनः संयोजक के बाद से विषमजातीय प्रोटीन को स्पोर्युलेशन के दौरान मदर सेल में व्यक्त किया जा इंजीनियर थे, जबकि कोट के भीतर उनकी विधानसभा सहज था और इसलिए, nonrecombinant24। हालांकि, इस अतिरिक्त दृष्टिकोण के प्रदर्शन की दक्षता का परीक्षण किया है और एक ही विषम प्रोटीन का उपयोग करके अंय दो दृष्टिकोण के साथ तुलना में रहता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल में बीजाणु उत्पादन और शुद्धिकरण की प्रक्रियाएं शामिल नहीं हैं, जिन्हें24स्थानों पर व्यापक रूप से वर्णित किया गया है । यह अधिशोषण प्रतिक्रिया, डॉट द्वारा अधिशोषण की दक्षता का मूल्यांकन-सोख्ता और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और अतिरिक्त प्रतिक्रिया दौर के लिए अधिशोषित एंजाइम की रीसाइक्लिंग शामिल हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह बीजाणु अधिशोषण प्रोटोकॉल बहुत सरल और सीधा है । प्रतिक्रिया कड़ाई से प्रतिक्रिया बफर के पीएच पर निर्भर है और अधिशोषण की क्षमता अम्लीय पीएच मूल्यों (पीएच ५.० या कम) पर इष्टतम है । तटस्थ पीएच शर्तों पर, अ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम “finanziamento डि ricerca di ateneo” के लिए एल baccigalupi, परियोजना शीर्षक “सपा-LAY: बैक्टीरियल बीजाणु के रूप में प्रोटीन प्रदर्शन के लिए जीना मंच” द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
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