Summary
提出了一种用于多维固态核磁共振光谱和动态核极化 (dnp) 研究的 13 c、15个n 标记真菌和植物样品的制备方案。
Abstract
该协议显示了如何均匀地生产13c, 15n 标记的真菌材料, 以及如何进行这些软材料的固态核磁共振和敏感增强的 dnp 实验。并对植物生物质的样品处理工艺进行了详细的介绍。这种方法允许测量一系列的一维和 2d 13c-13 cp-15 n相关光谱, 从而能够以最小的扰动对其原生状态下的复杂生物材料进行高分辨率结构描述.通过量化一维光谱中的强度和二维相关谱中的偏振传递效率, 可以检测同位素标记。动态核极化 (dnp) 样品制备的成功与否可以用灵敏度增强因子来评价。进一步的实验, 研究多糖和蛋白质的结构方面将导致一个三维架构模型。这些方法可以进行修改和调整, 以研究广泛的富含碳水化合物的材料, 包括植物、真菌、藻类和细菌的天然细胞壁, 以及合成或设计的碳水化合物聚合物及其与其他物质的复合物。分子。
Introduction
碳水化合物在各种生物过程中发挥着核心作用, 如储能、结构建筑、细胞识别和粘附。它们在细胞壁中被丰富, 细胞壁是植物、真菌、藻类和细菌的基本成分 1,2,3.细胞壁是生产生物燃料和生物材料的核心来源, 也是抗菌疗法4、5、6、7、8的一个有希望的目标,9个。
几十年来, 人们一直在努力利用四种主要的生化或遗传方法进行结构表征, 从而大大促进了对这些复杂材料的当代理解。第一种主要方法依靠顺序处理使用苛刻的化学物质或酶将细胞壁分解成不同的部分, 然后对每 10分的糖进行成分和连锁分析。这种方法揭示了聚合物的域分布, 但由于生物分子的化学和物理性质, 解释可能具有误导性。例如, 很难确定碱萃取分数是来自结构较少的分子的单个域, 还是来自具有可比溶解性的空间分离分子。其次, 提取的部分或整个细胞壁也可以测量使用溶液核磁共振, 以确定共价键, 也称为交联, 不同分子之间的 11,12,13, 14,15。通过这种方法, 可以探讨共价锚杆的详细结构, 但由于多糖的溶解度较低、交联位点数量相对较少以及对稳定的非共价效应的无知, 可能会存在局限性。多糖填料, 包括氢键、范德华力、静电相互作用和聚合物纠缠。第三, 利用分离的多糖16、17、18、19 在体外测定了结合亲和力, 但纯化过程可能会发生重大变化。这些生物分子的结构和性质。这种方法也不能复制复杂的沉积和组装的大分子后的生物合成。最后, 某些细胞壁成分减毒产生的遗传突变体的表型、细胞形态和力学性质揭示了多糖的结构功能, 但需要更多的分子证据来弥补这些因素的联系。宏观观测与蛋白质机械的工程功能 20。
近年来在多维固态核磁共振光谱的发展和应用方面取得的进展为解决这些结构难题提供了一个独特的机会。通过2d/3d 固态核磁共振实验, 可以在不产生重大扰动的情况下, 对富含碳水化合物材料的成分和结构进行高分辨率研究。对植物的原生和二级细胞壁、经过催化处理的生物量、细菌生物膜、真菌中的色素鬼以及最近作者在病原真菌中的完整细胞壁进行了结构研究。熏蒸曲霉21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. 动态核两极分化的发展 32 、33、34、35、36、37、38,39,40,41,42极大地促进了核磁共振结构的阐明, 因为 dnp 的灵敏度增强明显缩短了这些复杂生物材料的实验时间。这里描述的协议详细介绍了同位素标记真菌a. 熏蒸剂的程序, 以及为固态核磁共振和 dnp 表征准备真菌和植物样品的程序。类似的标签程序应适用于其他培养基改变的真菌, 样品制备程序应普遍适用于其他富含碳水化合物的生物材料。
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Protocol
1.生长13c, 15n 标记的富米达斯下酯类液体培养基
- 未标记和13c、 15n 标记生长介质的制备
注: 酵母提取物丙酮葡萄糖培养基 (ypd) 和改进的最小培养基43均用于维持真菌培养。高压灭菌后的所有步骤都是在层流罩中执行的, 以最大限度地减少污染。- 无标记液体介质的制备: 在100毫升蒸馏水中溶解6.5 克 ypd 粉末, 在134°c 下高压灭菌25分钟。
- 无标记固体介质的制备
- 在100毫升的蒸馏水中加入1.5 克琼脂和6.5 克 ypd 粉。
- 在121°c 下, 高压灭菌介质 25分钟, 然后冷却至约50°c。
- 将培养基的13-15 毫升转移到每个预育塑料培养皿中, 并立即用盖子盖上锅盖。
- 13c、 15n 标记液体介质的制备
注: 为制备同位素标记的生长溶液, 分别制备含有13c 葡萄糖和15n-硝酸钠的最低培养基和示踪剂溶液, 然后在使用前混合。- 编制表 1所列含有同位素的最小介质的100毫升。使用 naoh (1 m) 或 hcl (1m) 溶液将 ph 值调整到6.6。
- 在121°c 下, 高压灭菌器的最小介质25分钟。
- 制备100毫升 (1000 x) 的微量元素溶液, 将表 2中列出的盐溶解在蒸馏水中。在134°c 下, 高压灭菌溶液25分钟。将溶液冷却并存放在 4°c, 以便短期使用。ph 值约为 6.5, 可使用 ph 计进行检测。
- 在使用前, 将 0.1 ml 的微量元素溶液添加到表 2中列出的13c 的100毫升、 15个n 标记的最小介质中。
- 真菌材料的生长
- 使用层流罩中的接种回路将少量真菌从储存物转移到 ypd 板上。将培养物保持在 30°c, 在孵化器中保持2天。
- 使用接种回路将活性生长的真菌边缘转移到层流罩中的 13c、15n 标记溶液中。在摇摇的孵化器中, 以220转/分的速度将培养保持在 30°c, 为期3-5天。
- 离心以 4, 000 x克20分钟, 取出上清液, 收集颗粒。
- 使用推拿器收集 ~ 0.5 克的水合颗粒 (& gt;50 wt% 水合) 用于核磁共振研究。任何时候的水合作用损失都会使光谱分辨率大大恶化。
注: 如有必要, 在 n2 气体流的情况下, 可以将少量 (0.1 克) 的水合菌丝体分离并完全干燥, 以估计水化水平并计算干质量百分比。通常情况下, 3天后可获得含有约0.3 克干质量的颗粒。如果要进行的核磁共振实验时间很长 (gt;7 天), 或者真菌的状态需要固定, 真菌材料可以在进一步加工前在 n-2 液体中深度冷冻10-20。如果实验时间较短 (3-6), 则可以跳过冷冻, 以便样品保持新鲜。 - 将多余的材料与 20% (v/v) 的甘油混合在离心管中, 并将其保存在-80°c 的冰柜中长期储存。
2.用于固态核磁共振和 dnp 研究的熏蒸剂的制备
- 用于固态核磁共振实验的熏蒸剂的制备
- 在4°C 对10mm 磷酸盐缓冲液 (ph 7.0) 的 1 l 对1升进行透析, 将 13 c、 15n 标记的真菌样品 (步骤 1.2.4) 透析, 使用具有 3.5 kda 分子量截止的透析袋, 从生长介质中去除小分子, 总共3天。每天更改缓冲区两次。
注: 或者, 可以使用去离子水清洗样品 6-10, 以去除残留的小分子。 - 使用台式离心机将样品转移到15毫升管和离心机中 5分钟 (10, 000 x g)。去除上清液, 收集剩余的真菌材料。
- 将70-80 毫克的均匀13 c 标记和良好的水合样品糊放入 4-mm zro2转子或30-50 毫克至 3.2 mm 转子中, 用于核磁共振实验。用金属棒轻轻挤压样品, 用纸吸收多余的水。
- 紧盖转子, 并将样品插入光谱仪, 以进行固态核磁共振表征。
注: 在核磁共振光谱仪中, 建议使用全新的转子, 以最大限度地减少转子碰撞和样品泄漏的可能性。如有需要, 可使用带有密封螺钉的一次性 kel-f 刀片作为转子内的二次容器。
- 在4°C 对10mm 磷酸盐缓冲液 (ph 7.0) 的 1 l 对1升进行透析, 将 13 c、 15n 标记的真菌样品 (步骤 1.2.4) 透析, 使用具有 3.5 kda 分子量截止的透析袋, 从生长介质中去除小分子, 总共3天。每天更改缓冲区两次。
- dnp 实验用熏蒸样品的制备
- 在 1.5 ml 微离心管中制备100μl 的 dnp 溶剂 29, 44 (也称为 dnp 基质), 用于13c、15个n 标记真菌样品。该 dnp 基体含有 d 8-甘油 2oyh 2o (60/60/10 vol%) 的混合物。
注: 如果要对未标记的样品进行调查, 则使用13c-耗尽 d 8-甘油(12c3,99.95;d8, 98%) 和 d 2o和 h2o,以避免来自溶剂的13c 信号的贡献。 - 在100μl 的 dnp 溶剂中溶解0.7 毫克的 amupol45 , 形成 10 mm 的自由基库存溶液。涡流 2-3分钟, 以确保自由基完全溶解在溶液中。
- 将10毫克的透析13c、 15n 标记的真菌材料浸泡在前面的步骤 (步骤2.1.1 和 2.1.2) 中, 加入50μl 的 amupol 溶液中, 并使用粘合剂和砂浆将混合物温和研磨, 以确保自由基渗透到多孔细胞壁。
注: 为了降低水化损失的速度, 研磨也可以在使用微喷管的微离心管中进行。 - 在磨碎的颗粒中再加入30μl 的自由基溶液, 以进一步补充真菌样品。
- 将颗粒放入3.2 毫米的蓝宝石转子中, 轻压并去除多余的 dnp 溶剂。添加 3.2 mm 硅胶插头, 以防止水合作用损失。通常情况下, 5-30 毫克的样品可以包装到转子。具体数量需要根据所进行的核磁共振实验的灵敏度要求来确定。
- 在 dnp 光谱仪中插入和旋转样品, 测量微波辐照下的 dnp 增强光谱, 并将其与微波光谱进行比较。这将导致增强因子关闭, 这些复杂的材料应该是20-40。运行设计的实验来确定细胞壁结构。
- 在 1.5 ml 微离心管中制备100μl 的 dnp 溶剂 29, 44 (也称为 dnp 基质), 用于13c、15个n 标记真菌样品。该 dnp 基体含有 d 8-甘油 2oyh 2o (60/60/10 vol%) 的混合物。
3. 用于核磁共振和 dnp 研究的植物生物量的制备
- 固态核磁共振植物材料的制备
- 如前面的46、47所述, 在生长室或13个c-葡萄糖培养基中使用13co 2 供应,在内部统一生产 13个 c 标记的工厂, 或直接从同位素标签公司。
注: 13c 葡萄糖只能用于暗生长, 以避免通过光合作用引入12°c。 - 使用实验室剃须刀片将 13 c 标记的植物材料切成小块 (通常为1-2 毫米)。
注: 根据用途的不同, 提取的细胞壁有时用于结构表征, 详细的协议在以前的研究21,46中报告。 - 如果样品以前是干燥的, 在室温下的 1.5 ml 微离心管、涡流、平衡剂中, 在30毫克的植物材料中加入100μl 的水, 为期1天。以 4, 000 x克离心 10分钟, 并使用移液器去除多余的水。
- 如果样品在任何时候都没有干燥, 直接使用样品, 无需进一步处理。
- 将生成的植物材料放入 3.2 mm 或 4 mm zro2转子中, 用于固态核磁共振实验。
- 如前面的46、47所述, 在生长室或13个c-葡萄糖培养基中使用13co 2 供应,在内部统一生产 13个 c 标记的工厂, 或直接从同位素标签公司。
- dnp 研究用植物材料的制备
- 准备 10 mm amupol 自由基的60μl 库存溶液, 如所述步骤2.2.1 和2.2.2。
- 使用实验室剃须刀片将要研究的13c 标记的植物材料切成小块 (尺寸为1-2 毫米), 重量为20毫克的植物材料。
- 使用砂浆和子将植物碎片手工磨成小颗粒 (大小约1-2 毫米)。最后的粉末具有均匀的外观。
- 在设备材料中加入前一步 (步骤 2.2.2) 制备的 dnp 库存溶液 40μl, 并温和研磨 5分钟, 以确保与自由基均匀混合。
- 再加入20μl 的库存溶液, 使植物材料在研磨后进一步水合。
- 将平衡的植物样品装入 3.2 mm 的蓝宝石转子, 用于 dnp 实验。插入硅胶插头, 以避免水合作用损失。
4. 用于碳酸氢富型生物材料初始表征的标准固态核磁共振实验
注: 本节简要概述了核磁共振实验。然而, 结构说明通常需要广泛的专门知识。因此, 建议与核磁共振光谱仪合作。
- 措施1d13c交叉偏振 (cp), 13c 直接偏振 (dp) 与2-s 和 35 s 回收延迟,和 1h-13c inept48,49光谱, 以获得动态的一般理解单元组件的分布 (图 1a)。细胞壁通常是相对刚性的部分, 并在 cp 光谱中表现出显性信号。
- 测量一系列标准的 2d 13c-13c相关实验, 用于13c信号的共振分配.从重新聚焦的 inadequate50, 51 开始, 以获得碳连接, 这需要得到一系列通空间实验的协助, 如 1.5 ms rfdr 52 (图 1b) 和50毫秒 cord\ darr 53实验。
注: 如果有兴趣找到含有特定成分的样品 (例如, 原生或二级细胞壁), 则可能需要单独测量多个段或多个植物, 以找到具有最佳成分的样品。 - 进行2d 15n-13c 相关实验, 可以测量, 以促进蛋白质和氮化碳水化合物的共振分配.
注: 共振分配通常非常耗时。目前正在开发一种方法, 以便利那些没有经验的科学家分配碳水化合物信号。 - 测量更专业的实验, 以确定复杂生物分子的空间接近度 (图 1c, d)、水合作用和流动性, 以确定富含碳水化合物的材料的三维结构, 如系统地描述了先前 22,29。
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Representative Results
同位素标记大大提高了核磁共振灵敏度, 并使测量一系列 2d 13c-13 c 和13c-15n 相关光谱的可能性成为可能, 以分析其组成、水化、流动性和包装。聚合物, 它将被集成来构建细胞壁结构的三维模型 (图 1)。如果统一的标签成功, 可以在1小时内收集一套完整的 1d13c和 15n 光谱, 每个标准的2d 光谱测量时间不应超过24小时。
精心准备的样品通常期望高核磁共振强度和尖锐的线。两个参数的比较表明样品制备不优化。真菌样品应以永不干燥的方式制备, 在包装步骤中的部分脱水可能会导致线宽明显扩大。如果完全包装的核磁共振样品的实验时间大大超过预期, 则标记级别可能较低。如果在 2d 13c-13c 相关谱中难以获得非对角线信号, 则可能会出现统计标记 (图 1b)。96 ppm 和 92 ppm 的两个13c 峰值是葡萄糖54 的特征碳1信号, 因此, 它们在定量的 13c直接极化 (dp) 光谱中的强强度通常表明, 在35秒的长期回收延迟下测量由于不完全透析或洗涤而导致的小分子的优势 (图 1a)。对于标记良好的样品, 可以进一步测量长距离相关性, 以检测生物分子的空间近似性 (图 1c), 并构建完整细胞壁的结构模型 (图 1c)。
| 化学名称 | 化学配方 | 浓度 (g) |
| 磷酸二钾 | k2hpo4 | 1.045 克 |
| 七水硫酸镁 | mgso4·7h2o | 0.52 克 |
| 磷酸一钾 | kh2po4 | 0.815 克 |
| 15n-硝酸钠 | 15纳诺3 | 6.0 克 |
| 氯化钾 | 氯化钾 | 0.52 克 |
| u-13c-葡萄糖 | 13c6h12o6 | 10.0 克 |
表1。最小介质的组成。
| 化学名称 | 化学配方 | 浓度 (g) |
| 四水合物钼铵 | (nh4)6mo7o24·4h2 o | 11克 |
| 硼酸 | h3bo3 | 11克 |
| 六水氯化钴 | ccl2·6h2o | 16克 |
| 硫酸铜五水 | cuso4·5h2o | 16克 |
| 硫酸亚铁七水 | feso4·7h2o | 5克 |
| 四水合物氯甲烷 | mncl2·4h2 o | 5克 |
| 四亚二胺四乙酸乙二酯 | na4EDTA·4H2o | 60克 |
| 七水硫酸锌 | znso4·7h2o | 22克 |
表2。示踪剂溶液的组成 (浓缩).请注意, 在制备未标记的真菌时, 可以使用未标记的葡萄糖和未标记的硝酸钠。
图1。利用固态核磁共振表征真菌细胞壁结构的流程图.(a) 用于初始样品筛选的一维光谱。从上到下是 inept, 13c dp 具有2-s 的回收延迟, 13c dp 与 35 s 的回收延迟和 13 cp 光谱, 与被检测到的分子的流动性下降。(b) 使用1.5 毫秒rfdr 回收测量的二维13c-13c 相关谱。(c) 使用15毫秒 par 谱检测到的具有代表性的分子间交叉峰。(d) 从核磁共振数据中获得的结构模型。a 、 c和d小组的修改来自 kang 等人, nat . commun. 9, 2747 (2018年)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
与生化方法相比, 固态核磁共振作为一种无损、高分辨率的技术具有优势。核磁共振在成分分析中也是定量的, 与大多数其他分析方法不同的是, 不存在生物聚合物溶解度有限所带来的不确定性。目前协议的建立有助于今后对富含碳水化合物的生物材料和功能化聚合物的研究。然而, 应当指出, 共振分配和数据分析可能很耗时, 通常需要系统的培训。作者目前正在开发工具和数据库, 以帮助没有经验的科学家克服这一障碍。
由于 13 c 的天然同位素丰度仅为 1.1%, 使用未标记材料观测 13 c-13c交叉峰的概率仅为使用一致标记样品的 0.012 (1.1% x1.1%). 因此, 利用该协议实现的同位素浓缩大大提高了核磁共振灵敏度四个数量级, 并使二维相关实验能够进行结构测定。
优化后的水合样品应在 2d13 c-13c 相关光谱中表现出尖锐的线条. 移动组件, 如a. fumigatus中的β-葡聚糖和植物中的肌素有, 在 6000-800 mhz 核磁共振光谱仪29、31上, 应在半最大 (fwhm)线宽为 0.5 ppm 的全宽。由于构成的构象异质性、重复的糖单位和缺乏快速的分子运动, 刚性成分的峰值稍宽一些。典型的13c 线宽是 0.7-1.0 ppm 的纤维素微纤维在植物和 0.5-0.7 ppm 为甲壳素在真菌55。纤维素和甲壳素的锐利线宽主要是由聚合物结晶度引起的, 因此对脱水和温度变化有一定的耐受性, 例如 dnp 实验56、57的低温温度。矩阵聚合物的峰值锐度, 但是, 对影响聚合物流动性的样品条件的变化高度敏感, 因此, 它可以作为样品水合的指标。广泛的基质聚合物线通常表示样品中缺乏水合作用, 可通过重新加水58 全部或部分回收。通常情况下, 50-80 wt% 的水合水平足以在植物和真菌样本中提供良好的线宽。
dnp 通常是调查这些具有挑战性的全细胞系统所必需的。通常情况下, 在 600 mhz\ 95 ghz dnp 光谱仪上的优化样品上可以实现20-40倍的灵敏度增强, 而这一值随着场的减少而增加, 例如, 在 400 mz\ 263 ghz dnp26,59上几乎翻了一番.有几个因素可能会影响 dnp 效率。首先, 自由基渗透到多孔细胞壁网络是至关重要的, 这一过程可以大大促进这一过程的生物材料在含有自由基的 dnp 矩阵。其次, 样品的物理性质、刚度等影响微波功率的选择, dnp 矩阵在 12 w 辐射下 "融化", 1 h 谐振的锐化就证明了这一点, 这对更硬的植物来说不是问题 "茎60。因此, 观察到1h 溶剂峰的各向同性模式, 纺丝边带大幅降低, dnp 增强减弱。因此, 对于较软的材料, 建议使用较弱的功率。第三, 优化 dnp 矩阵的组成。事实证明, d8甘油 2 oyh2o通常是软材料的最佳溶剂, 而更简单、更便宜的 d 2 oyh2o在某些情况下也是有效的, 因为在系统中存在糖分在某种程度上起到了低温保护剂的作用。相反, d6-dsouyd2oeh2o溶液在植物和真菌样品中都失败, 灵敏度提高不到 10倍, 因此除非用于特殊目的, 否则不建议使用.最近, 由于溶剂耗尽, 一项无矩阵协议被证明是非常有效的, 这创造了额外的空间, 以容纳更多的材料34,56,61。然而, 水化的损失对生物分子的结构构成了主要的扰动, 因此这种方法可能不适合生物系统。如果要研究未标记的细胞壁, 13c 耗尽 d8甘油 2 oeh2o 是最佳溶剂, 不会产生任何天然丰度13 c 信号, 也不会牺牲任何灵敏度增强。
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Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家科学基金会通过 nsf oia-1833040 提供的支持。国家高磁场实验室 (nhmfl) 由国家科学基金会通过 dmr-117490 和佛罗里达州提供支助。nhmfl 的 mas-dnp 系统部分由 nih s10 od018519 和 nsf che-1229170 供资。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Acros Organics | 12054-85-2 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P002 | |
| Analytical weighing balance | Ohaus | B730439218 | Model PA84C |
| Bioclave 16 L | VWR | 470230-598 | |
| Biosafety Cabinet | Labconco corporation | 302319100 | |
| Boric acid | VWR | BDH9222 | store at 15-30 °C |
| Cobalt(II) Chloride Hexahydrate | Honeywell|Fluka | 60820 | ≥98 % |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | BDH | BDH9312 | ≥98 % |
| Corning LSE shaking incubator | Thermo Fisher Scientific | 7202152 | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | 99.9 atom % D |
| d6-DMSO | Sigma Aldrich | 151874 | 99.9 atom % D |
| d8-glycerol | Sigma Aldrich | 447498 | ≥99 atom % D |
| Dialysis tubing 3.2 kDa | Sigma Aldrich | D2272 | 132724 |
| Dipotassium Phosphate | VWR | BDH9266 | ≥98 % |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | ≥99.5 % |
| Heraus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 750004271 | Maximum RCF 25,830 x g |
| HR-MAS Disposable Insert Kit | Bruker | B4493 | Kel-F |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 14498 | ≥99+ % |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | VWR | 10034998 | store at 18-26 °C |
| Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Alfa Aesar | 11563 | ≥99 % |
| Monopotassium Phosphate | VWR | 470302-254 | ≥99 % |
| pH Meter | Mettler Toledo | B706689216 | |
| Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | Acros Organics | 13235-36-9 | ≥99.5 % |
| Zinc Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 33399 | ≥98 % |
| 12C3, d8-glycerol | Cambridge Isotope Laboratory | CDLM-8660 | 12C3, 99.95%; D8, 98% |
| 13C6-glucose | Sigma Alrdrich | 364606 | ≥99 % (CP) |
| 15N-sodium nitrate | Sigma Aldrich | 364606 | ≥98 % 15N, ≥99 (cp) |
| 3.2 mm sapphire NMR rotor | Cortecnet | B6939 | |
| 3.2 mm Silicone plug | Bruker | B7089 | |
| 4 mm MAS Rotor Kit | Bruker | H14355 | Zirconia |
References
- Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
- Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
- Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
- Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
- Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
- Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
- Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
- Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
- Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
- Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
- Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
- Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
- Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
- Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
- Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
- Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
- Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
- Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
- Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
- Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
- Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
- Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
- Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
- Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
- Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
- Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
- Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
- Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
- Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
- Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
- Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
- Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
- Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
- Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
- Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
- Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
- White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
- Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
- Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
- Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
- Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
- Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
- Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
- Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
- Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
- Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
- Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
- Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
- Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
- Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
- Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).
