Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Abstract

Dit protocol laat zien hoe uniform 13C, 15N-geëtiketteerden schimmel materialen kunnen worden geproduceerd en hoe deze zachte materialen moeten worden voorafgegaan voor Solid state NMR en gevoeligheid-enhanced DNP experimenten. De monster veredeling van plantaardige biomassa is ook gedetailleerd. Met deze methode kan de meting van een reeks van 1D en 2D 13C -13C /15N correlaties spectra, waarmee de hoge resolutie structurele opheldering van complexe biomaterialen in hun oorspronkelijke staat, met minimale verstoring. De isotoop-labeling kan door het kwantificeren van de intensiteit in 1D spectra en het spuitrendement polarisatie in 2D correlatie spectra worden onderzocht. Het succes van de bereiding van de monsters van de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) kan worden geëvalueerd door de factor van de verhoging van de gevoeligheid. Verdere experimenten onderzoeken de structurele aspecten van de polysacchariden en eiwitten zal leiden tot een model van de driedimensionale architectuur. Deze methoden kunnen worden gewijzigd en aangepast om te onderzoeken van een breed scala van koolhydraat-rijke materialen, met inbegrip van de natuurlijke celwanden van planten, schimmels, algen en bacteriën, evenals gesynthetiseerd of ontworpen koolhydraten polymeren en hun complex met andere moleculen.

Introduction

Koolhydraten spelen een centrale rol in verschillende biologische processen zoals energieopslag, structurele gebouw, en cellulaire erkenning en hechting. Ze zijn verrijkt in de celwand, die is een fundamentele component in planten, schimmels, algen en bacteriën1,2,3. De celwand fungeert als een centrale bron voor de productie van biobrandstof en biomaterialen, evenals een veelbelovende doelgroep voor antimicrobiële therapie4,5,6,7,8 , 9.

Het moderne begrip van deze complexe materialen heeft aanzienlijk door decennia van inspanningen die werden gewijd aan de structurele karakterisering met behulp van vier belangrijke biochemische of genetische methoden naar voren geschoven. De eerste belangrijke methode berust op opeenvolgende behandelingen met behulp van agressieve chemicaliën of enzymen te breken de celwanden in verschillende delen, die wordt gevolgd door de samenstelling en analyse van de koppeling van suikers in elke fractie10. Deze methode werpt licht op het domein distributie van polymeren kan, maar de interpretatie misleidend zijn als gevolg van de chemische en fysische eigenschappen van biomoleculen. Bijvoorbeeld, is het moeilijk om te bepalen of de alkali-extraheerbare fractie afkomstig uit één domein van minder strak gestructureerde moleculen of ruimtelijk gescheiden moleculen met vergelijkbare oplosbaarheid is. Ten tweede, de uitgepakte gedeelten of hele celwanden kan ook worden gemeten met behulp van oplossing NMR om te bepalen van de covalente verbanden, ook aangeduid als crosslinking, tussen verschillende moleculen11,12,13, 14,15. Op deze manier de gedetailleerde structuur van covalente ankers gesondeerd kon worden, maar beperkingen kunnen bestaan als gevolg van de lage oplosbaarheid van polysacchariden, het relatief kleine aantal crosslinking sites en de onwetendheid van de niet-covalente effecten die stabiliseert polysaccharide verpakking, met inbegrip van de waterstof-bonding, van der Waals force, elektrostatische interactie en polymeer entanglement. Ten derde, de bindende affiniteit is vastbesloten in vitro met behulp van geïsoleerde polysacchariden16,17,18,19, maar de reiniging procedures kunnen ingrijpend wordt gewijzigd de structuur en eigenschappen van deze biomoleculen. Deze methode mislukt ook de geavanceerde afzetting en assemblage van macromoleculen na biosynthese wilt repliceren. Ten slotte het fenotype, cel morfologie en mechanische eigenschappen van genetische mutanten met verzwakte productie van bepaalde celwand component werpen licht op de structurele functies van polysacchariden, maar meer moleculaire bewijs is nodig om deze brug macroscopische waarnemingen met de gemodificeerde functie van eiwit machineries20.

Recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van de multidimensionale Solid state NMR spectroscopie hebben ingevoerd een unieke gelegenheid om deze structurele puzzels op te lossen. 2D/3D solid state NMR experimenten inschakelen met een hoge resolutie onderzoek naar de samenstelling en architectuur van koolhydraat-rijke materialen in de geboortestaat zonder grote perturbation. Structurele studies zijn met succes uitgevoerd op zowel de primaire als de secundaire celwanden van planten, de catalytically behandelde biomassa, bacteriële biofilm, het pigment geesten in schimmels en, onlangs door de auteurs, de intact celwanden in een pathogene schimmel Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. de ontwikkeling van dynamische nucleaire polarisatie (DNP)32,33,34,35,,36,,37,38 , 39 , 40 , 41 , NMR structurele opheldering vergemakkelijkt 42 aanzienlijk als de verhoging van de gevoeligheid door DNP aanzienlijk de experimentele tijd op deze complexe biomaterialen verkort. Het protocol hier beschreven details over de procedures voor de schimmel A. fumigatus isotoop-labeling en voorbereiden van schimmel en plant monsters voor Solid state NMR en DNP karakterisering. Soortgelijke labeling procedures gelden andere schimmels met gewijzigde medium, en de monsterbereidingsprocedures gelden over het algemeen andere koolhydraatrijke biomaterialen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. groei van 13C, 15N-geëtiketteerden Aspergillus fumigatus opgietvloeistof

  1. Voorbereiding van labelloze en 13C, 15N-geëtiketteerden groeimedium
    Opmerking: Beide gist Extract pepton Dextrose medium (YPD) en de verbeterde minimaal middellange43 werden gebruikt voor het onderhoud van schimmel cultuur. Alle stappen na autoclaaf zijn uitgevoerd in een laminaire flow kap tot een minimum beperken van verontreiniging.
    1. Bereiding van labelloze vloeibaar medium: Los 6,5 g YPD poeder in 100 mL gedestilleerd water en vervolgens autoclaaf gedurende 25 minuten op 134 ° C.
    2. Bereiding van labelloze solide medium
      1. Voeg 1,5 g agar en 6,5 g YPD poeder in 100 mL gedestilleerd water.
      2. Autoclaaf het medium voor 25 min bij 121 ° C en vervolgens afkoelen tot ongeveer 50 ° C.
      3. Pipetteer van 13-15 mL van het medium in elke vooraf steriele kunststof petrischaal en betrekking hebben op de schotel met het gebruik van een deksel onmiddellijk.
    3. Voorbereiding van 13C, 15N-geëtiketteerden opgietvloeistof
      Opmerking: De groei oplossing om voor te bereiden isotoop etikettering, een minimale voedingsbodem met 13C-glucose en 15N-Natrium nitraat en een spoorelement oplossing zijn afzonderlijk bereid en dan gemengd vóór gebruik.
      1. Bereiden 100 mL van de isotoop-bevattende minimaal medium zoals vermeld in tabel 1. Breng de pH op 6.6 met NaOH (1 M) of zoutzuur (1M).
      2. Autoclaaf de minimale voedingsbodem voor 25 min bij 121 ° C.
      3. Bereiden van 100 mL (1, 000 x) ontbinden van sporenelementen oplossing, de zouten die zijn vermeld in tabel 2 in het gedestilleerd water. Autoclaaf de oplossing gedurende 25 minuten op 134 ° C. Afkoelen en bewaar de oplossing bij 4 ° C voor kortstondig gebruik. De pH zal ongeveer 6.5 en kan worden gecontroleerd met behulp van een pH-meter.
      4. Toevoegen van sporenelementen 0,1 mL tot 100 mL 13C, 15N-geëtiketteerden minimaal medium zoals vermeld in tabel 2 vóór gebruik.
  2. Groei van de schimmel materialen
    1. Een kleine hoeveelheid schimmels overbrengen van de opslag op een bord van de YPD met behulp van een inoculating lus in een laminaire flow-kap. Houd de cultuur bij 30 ° C voor 2 dagen in een broedmachine.
    2. Gebruik een inoculating lus over te dragen van een actieve, groeiende schimmel rand voor de 13C,15N-labeling oplossing in een laminaire flow-kap. Houd de cultuur bij 30 ° C gedurende 3-5 dagen bij 220 rpm in een schudden incubator.
    3. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 20 min. Verwijder het supernatant en verzamelen de pellet.
    4. Een pincet gebruiken voor het verzamelen van ~0.5 g van goed gehydrateerd pellet (> 50 wt % hydratatie) voor NMR studies. Verlies van hydratatie op enig moment zal de spectrale resolutie aanzienlijk verergeren.
      Opmerking: Indien nodig, een kleine hoeveelheid (0,1 g) de gehydrateerd mycelia kan worden gescheiden en volledig gedroogd onder N2 gasstroming in een kap of een lyophilizer de droge massa percentage berekenen te schatten van de hydratatie niveau. Meestal een pellet met ~0.3 g droge massa kan worden verkregen na 3 dagen. Als de NMR experiment plaatsvinden lang (> 7 dagen) en/of als de staat van de schimmels worden vastgesteld moet, de schimmel materiaal diep kan worden ingevroren in vloeibare N2 voor 10-20 min vóór verdere verwerking. Als het experiment korte zullen (3-6 dagen), de bevriezing kan worden overgeslagen zodat het monster verse kan blijven.
    5. Meng het overtollig materiaal met 20% (v/v) glycerol in een centrifugebuis en bewaar deze in een vriezer-80 ᵒC voor langdurige opslag.

2. voorbereiding van A. fumigatus Solid-state NMR en DNP Studies

  1. Voorbereiding van A. fumigatus voor Solid state NMR experimenten
    1. Dialyze de 13C, 15N-geëtiketteerden schimmel monster (stap 1.2.4.) tegen 1 L van 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) bij 4 ° C met behulp van een zak van de dialyse met een 3,5 kDa moleculair gewicht cutoff kleine moleculen verwijderd in het groeimedium voor een totale duur van 3 dagen. De buffer tweemaal dagelijks veranderen.
      Opmerking: U kunt ook het monster kan worden gewassen voor 6 - 10 keer met gedeïoniseerd water te verwijderen van de resterende kleine moleculen.
    2. Breng het monster in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 min (10.000 x g) met behulp van een benchtop centrifuge. Verwijder het supernatant en verzamelen van de resterende schimmel materialen.
    3. Pak van 70-80 mg van het uniform 13C-gelabeld en goed gehydrateerde monster plakken in een 4-mm ZrO2 rotor of 30-50 mg te 3.2 mm remschijven voor NMR experimenten. Herhaaldelijk knijp het voorzichtig met een metalen staaf monster en absorberen het overtollige water met behulp van papier.
    4. Strak cap van de rotor en invoegen van het monster in de spectrometer voor Solid state NMR karakterisering.
      Opmerking: De gloednieuwe rotors worden voorgesteld om te minimaliseren de mogelijkheid van rotor crash en proef van de lekkage in de NMR spectrometer. Indien nodig kan een wegwerp Kel-F invoegen met het afdichten van de schroeven worden gebruikt om te dienen als een secundaire container binnen de rotor.
  2. Bereiding van de monsters van de A. fumigatus voor DNP experimenten
    1. Voorbereiden op 100 µL van DNP oplosmiddelen29,44 (ook bekend als de DNP-matrix) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge 13C,15N-geëtiketteerden schimmel monsters. Deze DNP matrix bevat een mengsel van d8-glycerol/D2O/H2O (60/30/10 Vol %).
      Opmerking: Als labelloze monsters worden onderzocht, dan bereiden de DNP-matrix met 13C-verarmd d8-glycerol (12C3, 99,95%; D8, 98%) en D2O en H2O te vermijden 13C signaal bijdrage van de oplosmiddelen.
    2. Los 0.7 mg AMUPol45 in 100 µL van DNP oplosmiddelen op formulier 10 mM radicale stamoplossing. Vortex gedurende 2-3 minuten om ervoor te zorgen dat de radicalen volledig worden opgelost in de oplossing.
    3. Geniet van 10 mg van de dialyzed 13C, 15N-geëtiketteerden schimmel materialen zoals wordt beschreven in de voorafgaande stappen (stap 2.1.1 en 2.1.2) naar 50 µL van AMUPol oplossing, en mild vermalen het mengsel met behulp van een stamper en een mortier om te zorgen voor een penetratie van de radicalen in de poreuze celwanden.
      Opmerking: Verklein de snelheid van hydratatie verlies en het slijpen kan ook plaatsvinden in een buis van de microcentrifuge met behulp van een micropestle.
    4. Voeg een andere 30 µL van de radicale oplossing aan de gemalen pellet aan verdere hydraat het schimmel monster.
    5. De pellet in een sapphire rotor van 3.2 mm pak, knijp voorzichtig uit te drukken en verwijder het overtollige DNP oplosmiddel. Voeg een stekker 3.2-mm siliconen om te voorkomen dat het verlies van hydratatie. Meestal kan 5-30 mg van het monster worden verpakt aan de rotor. Het exacte bedrag moet worden bepaald door de eis van de gevoeligheid van de NMR experimenten te worden uitgevoerd.
    6. Invoegen en spin van het monster in een DNP spectrometer, meet een spectrum van DNP-enhanced onder magnetron bestraling en vergelijk het met het spectrum magnetron-off. Dit zal leiden tot een verhoging van de factor εaan/uit, die 20-40 voor deze complexe materialen moeten worden. Voer de ontworpen experimenten om te bepalen van de structuur van de celwand.

3. bereiding van plantaardige biomassa NMR en DNP Studies

  1. Voorbereiding van plantaardig materiaal voor Solid state NMR
    1. Produceren van uniform 13C-gelabeld planten in-house met behulp van 13CO2 leveringen in een kamer of 13C-glucose groeimedium zoals eerder beschreven46,47 of rechtstreeks kopen gelabelde materialen uit isotoop-labeling bedrijven.
      Opmerking: 13C-glucose kan alleen worden gebruikt in donkere groei om te voorkomen dat de invoering van 12C door fotosynthese.
    2. Snijd de uniform 13C label plantaardig materiaal in kleine stukjes (meestal 1-2 mm in afmeting) met behulp van een scheermesje laboratorium.
      Opmerking: Afhankelijk van het doel, de uitgepakte celwanden worden soms gebruikt voor structurele karakterisering en de gedetailleerde protocollen worden gemeld in vorige studies21,46.
    3. Als het monster was vooraf gedroogd, 100 µL van water toevoegen tot 30 mg van plantaardig materiaal in een 1,5 mL microcentrifuge buis, vortex, equilibreer bij kamertemperatuur gedurende 1 dag. Centrifugeer bij 4000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het overtollige water met behulp van een precisiepipet.
    4. Als het monster nooit gedroogd op elk moment was, direct gebruik te maken van het monster zonder verdere behandeling.
    5. Pak de resulterende plantaardig materiaal in 3.2- of 4-mm ZrO2 rotoren voor Solid state NMR experimenten.
  2. Voorbereiding van plantaardig materiaal voor DNP studies
    1. Bereiden 60 µL stockoplossing van 10 mM AMUPol radicaal als beschreven stappen 2.2.1 en 2.2.2.
    2. Snijd de uniform 13C label plantaardig materiaal in kleine stukjes (1-2 mm in afmeting) worden bestudeerd met behulp van een scheermesje laboratorium en weeg 20 mg van het plantaardig materiaal.
    3. Hand-grind de plant stukken in kleine deeltjes (~ 1-2 mm in grootte) met behulp van een mortier en een stamper. De definitieve poeders hebben een homogene uitstraling.
    4. Voeg 40 µL van de stockoplossing van DNP voorbereid in de voorgaande stap (2.2.2) aan het plantmateriaal en mild voor 5 min om homogeen mengen met de radicale slijpen.
    5. Voeg een ander 20 µL van de stockoplossing om verder het plantmateriaal hydrateren na fijnmaken.
    6. Pak de plant geëquilibreerd monster in een 3.2-mm saffier rotor voor DNP experimenten. Steek de stekker van een siliconen om te voorkomen dat het verlies van hydratatie.

4. standaard solid state NMR experimenten voor eerste karakterisering van koolhydraat-rijke biomaterialen

Opmerking: Een kort overzicht van de NMR experimenten vindt u in deze sectie. Structurele opheldering vereist echter meestal een uitgebreide expertise. Gezamenlijke inspanningen met NMR spectroscopists wordt daarom aangeraden.

  1. Maatregel 1D 13C Cross polarisatie (CP), 13C directe polarisatie (DP) met 2-s en 35-s recycle vertragingen, en 1H -13C ONBEHOLPEN48,49 spectra te verkrijgen van een algemeen begrip van de dynamische distributie van celbestanddelen (Figuur 1a). De celwanden zijn meestal het relatief rigide gedeelte en dominante signalen in het spectrum van CP vertonen.
  2. Een reeks standaard 2D 13C -13C correlatie experimenten voor resonantie toewijzingen van 13C signalen meten. Beginnen met heroriëntatie onvoldoende50,51 te verkrijgen van koolstof connectiviteit, die moet worden bijgestaan door een reeks van door-ruimte-experimenten zoals 1.5-ms RFDR52 (Figuur 1b) en 50-ms SNOER/DARR53 experimenten.
    Opmerking: Als het is van belang voor het vinden van een monster rijk in een bepaald onderdeel, bijvoorbeeld de primaire of secundaire celwanden, meerdere segmenten of meerdere planten kunnen moet afzonderlijk worden gemeten om te zoeken naar het monster met de optimale samenstelling.
  3. Uitvoering van 2D 15N -13C correlatie experimenten die ter vergemakkelijking van de toewijzingen van de resonantie van eiwitten en koolhydraten nitrogenated kunnen worden gemeten.
    Opmerking: De toewijzing van resonantie is meestal tijdrovend. Momenteel wordt een methode ontwikkeld om de toewijzing van de resonantie van koolhydraten signalen voor die wetenschappers zonder voorafgaande ervaring.
  4. Meten van meer gespecialiseerde experimenten om de ruimtelijke proximities (Figuur 1 c, d), hydratatie en mobiliteiten van complexe biomoleculen om te bepalen van de driedimensionale structuur van de koolhydraat-rijke materialen als te bepalen eerder beschreven systematisch22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De isotoop labeling aanzienlijk verbetert de gevoeligheid van de NMR en maakt het mogelijk voor het meten van een reeks 2D 13C -13C en 13C -15N correlatie spectra voor het analyseren van de samenstelling, hydratatie, mobiliteit en verpakking van polymeren, die zal worden geïntegreerd om te bouwen van een driedimensionaal model van de celwand het platform (Figuur 1). Als de uniforme etikettering slaagt, moet een complete set van 1D 13C en 15N spectra kan worden verzameld binnen 1 uur en elke standaard 2D spectrum langer dan 24 uur voor de meting.

Goed geprepareerde monsters meestal verwachten beide hoge intensiteiten van de NMR en scherpe lijnen. Afbreuk te doen aan van beide parameter geeft aan VN-geoptimaliseerde monstervoorbereiding. De schimmel monsters moeten worden voorbereid op een wijze die nooit gedroogd, en gedeeltelijke dehydratatie tijdens de verpakking stappen kan leiden tot een aanzienlijke verbreding van de linewidth. Als de experimentele tijd aanzienlijk langer is dan verwacht voor een volledig verpakt NMR-monster, de labeling niveau mogelijk te weinig. Als af-diagonaal signalen moeilijk zijn te verkrijgen in het spectrum van 2D 13C -13C correlatie, zou kunnen statistische labeling hebben voorgedaan (Figuur 1b). De twee 13C pieken bij 96 en 92 pag/min zijn handtekening koolstof 1 signalen van glucose54, daarom hun sterke intensiteiten in de kwantitatieve 13C direct polarisatie (DP) spectra gemeten met lange recycle vertragingen van 35 s doorgaans aangeven de dominantie van kleine moleculen als gevolg van onvolledige dialyse of wassen (Figuur 1a). Met goed gelabelde monsters, kunnen lange-afstands correlaties verder worden gemeten om te ontdekken de ruimtelijke proximities van biomoleculen (Figuur 1 c) en het structurele model van intact celwanden (Figuur 1 d) construeren.

Chemischenaam Chemische formule Concentratie (g/L)
Dipotassium fosfaat K2HPO4 1.045 g
Magnesiumsulfaat-heptahydraat MgSO4·7H2O 0.52 g
Monokalium fosfaat KH2PO4 0.815 g
15 N - natriumnitraat P.a. 15 NaNO3 6.0 g
Kaliumchloride KCl 0.52 g
U -13C-Glucose 13 C6H12O6 10,0 g

Tabel 1. De samenstelling van de minimale voedingsbodem.

Chemischenaam Chemische formule Concentratie (g/L)
Ammonium molybdaat tetrahydraat (NH4) 6 Ma7O24·4H2O 11 g
Boorzuur H3BO3 11 g
Kobalt Chloride-hexahydraat CoCl2·6H2O 16 g
Cupri-sulfaat, pentahydraat CuSO4·5H2O 16 g
Ferro-sulfaat, heptahydraat FeSO4·7H2O 5 g
Manganous Chloride tetrahydraat MnCl2·4H2O 5 g
Tetranatriumethyleendiaminetetraacetaat Na4EDTA·4H2O 60 g
Zinksulfaat-heptahydraat ZnSO4·7H2O 22 g

Tabel 2. De samenstelling van de oplossing van de spoorelementen (geconcentreerd). Merk op dat voor het voorbereiden van labelloze schimmels, labelloze glucose en labelloze natriumnitraat p.a. kunnen worden gebruikt.

Figure 1
Figuur 1. Stroomdiagram voor het karakteriseren van de schimmel celwand structuur met behulp van Solid state NMR. (een) 1 D spectra voor screening van de eerste steekproef. Van boven naar onder zijn INEPT, 13C DP met 2-s recycle vertragingen, 13C DP met 35-s recycle vertragingen en 13C CP spectra, met afnemende mobiliteit voor de gedetecteerde moleculen. (b) 2D 13C -13C correlatie spectrum gemeten met behulp van 1.5-ms RFDR herkoppeling. (c) vertegenwoordiger intermoleculaire Kruis piek gedetecteerd met behulp van 15-ms PAR spectrum. (d) structurele model NMR gegevens verkregen. Panelen een, c en d zijn gewijzigd van Kang et al., Nat. Commun. 9, 2747 (2018). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vergeleken met de biochemische methoden, heeft Solid state NMR voordelen als een niet-destructieve en hoge resolutie techniek. NMR is ook kwantitatieve samenstelling analyse, en in tegenstelling tot de meeste andere analytische methoden, doet niet hebben de onzekerheden ingevoerd door de beperkte oplosbaarheid van biopolymeren. Oprichting van het huidige protocol vergemakkelijkt toekomstige studies op koolhydraat-rijke biomaterialen en matiemaatschappij polymeren. Echter moet worden opgemerkt dat de resonantie-toewijzing en data-analyse kan tijdrovende worden en gewoonlijk systematische training vereisen. De auteurs ontwikkelen momenteel tools en databases om wetenschappers zonder voorafgaande ervaring te overwinnen deze barrière te helpen.

Aangezien de overvloed van de natuurlijke isotoop 13C is slechts 1,1%, is de kans voor het observeren van een 13C -13C Kruis piek met ongelabelde materialen slechts 0,012% (1,1% x 1,1%) van welk using uniform label monsters. Dus, de verrijking van de isotoop bereikt met behulp van dit protocol aanzienlijk verbetert de gevoeligheid van de NMR door vier ordes van grootte en maakt 2D correlatie experimenten voor structurele bepaling.

De geoptimaliseerde, goed gehydrateerd monsters moeten scherpe lijnen in 2D 13C -13C correlatie spectra vertonen. De mobiele componenten, zoals de β-glucanen in het dieet in A. fumigatus en de pectines in planten moeten vertonen een volle breedte op halve-maximaal (FWHM) linewidth van 0.3-0,5 ppm op 600-800 MHz NMR spectrometers29,31. De starre onderdelen hebben iets ruimere pieken als gevolg van conformationele heterogeniteit van de samenstellende, repetitief suiker-eenheden en het ontbreken van snelle moleculaire bewegingen. De typische 13C linewidth is 0,7-1.0 ppm voor cellulose microvezels in planten en 0,5-0,7 ppm voor chitine in schimmels55. De scherpe linewidth van cellulose en chitine worden voornamelijk veroorzaakt door polymeer kristalliniteit, daarom gedeeltelijk resistent tegen uitdroging en temperatuurverandering, bijvoorbeeld de cryogene temperatuur van DNP experiment56,57. De scherpte van de piek van matrix polymeren, echter, zijn zeer gevoelig voor de verandering van monster voorwaarden die invloed hebben op de polymeer-mobiliteit, dus het kan worden gebruikt als een indicator van monster hydratatie. Grote lijnen van de matrix polymeren wijst doorgaans het ontbreken van hydratie in de steekproef, die geheel of gedeeltelijk door opnieuw toe te voegen water58kan worden teruggevorderd. Typisch, een niveau van de hydratatie van 50-80 wt % volstaat voor het verstrekken van een goede linewidth in zowel planten als schimmel monsters.

DNP is vaak nodig voor het onderzoeken van deze uitdagende geheel-cel-systemen. Typisch, een 20-40 vouwen verhoging van de gevoeligheid kan worden bereikt op een geoptimaliseerde monster op een 600 MHz/395 GHz DNP spectrometer en deze waarde toeneemt met afnemende veld, bijvoorbeeld bijna verdubbeld op een 400 MHz/263 GHz DNP26,59 . Er zijn verschillende factoren die invloed kunnen hebben op de efficiëntie van DNP. Ten eerste, de penetratie van de radicalen in het poreuze netwerk van celwanden is cruciaal en dit proces aanzienlijk kan worden vereenvoudigd door het milde slijpen van de biomaterialen in de radicaal-bevattende DNP matrix. Ten tweede, de fysieke eigenschappen, de stijfheid bijvoorbeeld van het monster is van invloed op de keuze van de magnetron macht, de DNP matrix "smelt" onder 12 W bestraling, zoals blijkt uit de verscherping van 1H resonanties, dat was geen probleem voor de stijvere plant stengels60. Dientengevolge, een meer isotrope patroon van de 1H oplosmiddel piek wordt waargenomen, met aanzienlijk lagere spinnen sidebands en verzwakte DNP verbetering. Zwakkere macht wordt daarom aanbevolen voor zachtere materialen. Ten derde, de samenstelling van DNP matrix moet worden geoptimaliseerd. Het blijkt dat d8-glycerol/D2O/H2O is over het algemeen de beste oplosmiddelen voor zachte materialen, terwijl een eenvoudiger en goedkoper keuze D2O/H2O ook doeltreffend in sommige gevallen kunnen omdat de suikers aanwezig in het systeem fungeert als cryoprotectant tot op zekere hoogte. In contrast, de d6-DMSO/D2O/H2O-oplossing mislukt in zowel planten als schimmel monsters, met minder dan 10-fold van de verhoging van de gevoeligheid, dus het is niet aanbevolen voor gebruik tenzij voor speciale doeleinden. Een matrix-gratis protocol heeft onlangs aangetoond dat zeer effectief is als gevolg van oplosmiddelen uitputting, waardoor extra ruimte om meer materialen34,-56,61aan te passen. Echter misschien het verlies van hydratatie presenteert een grote verstoring de structuur van biomoleculen, dus deze methode niet geschikt voor biologische systemen. Als labelloze celwanden om te worden bestudeerd zijn, 13C-verarmd d8-glycerol/D2O/H2O is de optimale oplosmiddel dat draagt niet bij elke natuurlijke overvloed 13C signalen noch enige gevoeligheid offert toebehoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Wij hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation via NSF OIA-1833040. Het nationale laboratorium voor hoog magnetisch veld (NHMFL) wordt ondersteund door de National Science Foundation via het DMR-1157490 en de staat Florida. Het systeem van de MAS-DNP bij NHMFL wordt gedeeltelijk gefinancierd door de NIH S10 OD018519 en NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Biochemie kwestie 144 Solid-state NMR dynamische nucleaire polarisatie (DNP) koolhydraten celwanden biomaterialen planten schimmels
Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter