Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Forberedelse af svampe og plantematerialer for strukturelle udredning ved hjælp af dynamisk nuklear polarisering Solid-State NMR

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

En protokol for at forberede 13C,15N-mærket svampe og vegetabilske prøver til multidimensional solid-state NMR spektroskopi og dynamisk nuklear polarisering (DNP) undersøgelser er præsenteret.

Abstract

Denne protokol viser hvordan ensartet 13C, 15N-mærket svampe materialer kan være produceret og hvordan disse bløde materialer bør være gået for solid-state NMR og følsomhed-forstærket DNP eksperimenter. Prøven forædling af plantebiomasse er også detaljeret. Denne metode giver mulighed for måling af en serie af 1D og 2D 13C -13C /15N korrelationer spektre, som giver høj opløsning strukturelle udredning af komplekse biomaterialer i deres oprindelige tilstand, med minimal undertrykkelse af netbårne. Isotop-mærkning kan blive undersøgt af kvantificere intensitet i 1D spectra og polarisering overførsel effektivitet i 2D korrelation spektre. Succes dynamisk nuklear polarisering (DNP) til forberedelse af prøven kan vurderes af følsomhed enhancement faktor. Yderligere eksperimenter undersøger de strukturelle aspekter af polysaccharider og proteiner vil føre til en model af de tre-dimensionelle arkitektur. Disse metoder kan ændres og tilpasses for at undersøge en lang række kulhydratrige materialer, herunder de naturlige cellevægge af planter, svampe, alger og bakterier, såvel som syntetiseres eller designet kulhydratpolymerer og deres komplekse med andre molekyler.

Introduction

Kulhydrater spiller en central rolle i forskellige biologiske processer såsom energilagring, strukturelle opbygning og cellular anerkendelse og vedhæftning. De er beriget i cellevæggen, hvilket er en grundlæggende komponent i planter, svampe, alger og bakterier1,2,3. Cellens væg fungerer som en central kilde til produktion af biobrændstoffer og biomaterialer samt et lovende mål for antimikrobielle behandlingsformer4,5,6,7,8 , 9.

Den moderne forståelse af disse komplekse materialer har været betydeligt avancerede af årtiers bestræbelser, der var afsat til strukturel karakterisering ved hjælp af fire større biokemiske eller genetiske metoder. Den første store metode bygger på sekventiel behandlinger ved hjælp af barske kemikalier eller enzymer til at nedbryde cellevægge i forskellige dele, der efterfølges af kompositoriske og kobling analyse af sukker i hver fraktion10. Denne metode belyser domæne fordelingen af polymerer, men fortolkningen kan være misvisende på grund af de kemiske og fysiske egenskaber af biomolekyler. For eksempel, er det vanskeligt at afgøre, om den alkali-ekstraherbare brøkdel stammer fra et enkelt domæne af mindre struktureret molekyler eller rumligt separerede molekyler med sammenlignelige opløselighed. For det andet den udpakkede dele eller hele cellevægge kan også måles ved hjælp af løsning NMR til at bestemme de kovalente forbindelser, også betegnes som crosslinking, mellem forskellige molekyler11,12,13, 14,15. På denne måde, kovalente ankre detaljerede struktur kunne blive aftestede, men begrænsninger kan findes på grund af den lave Opløselighed af polysaccharider, det relativt lille antal crosslinking websteder og uvidenhed om non-kovalente effekter, der stabiliserer polysaccharid pakning, herunder hydrogenbindende, van der Waals kraft, elektrostatiske interaktion og polymer entanglement. For det tredje har bindende affinitet været beslutsom in vitro- ved hjælp af isolerede polysaccharider16,17,18,19, men rensning procedurer kan væsentligt ændre struktur og egenskaber af disse biomolekyler. Denne metode også undlader at replikere sofistikerede deposition og samling af makromolekyler efter biosyntesen. Endelig, fænotype, celle morfologi og mekaniske egenskaber af genetiske mutanter med svækkede produktionen af visse cellevæg komponent kaste lys på de strukturelle funktioner af polysaccharider, men mere molekylære beviser er nødvendige for at slå bro over disse makroskopiske observationer med funktionen manipuleret af protein machineries20.

Seneste fremskridt inden for udvikling og anvendelse af multidimensional solid-state NMR spektroskopi har indført en enestående lejlighed til at løse disse strukturelle opgaver. 2D/3D solid-state NMR eksperimenter aktiverer høj opløsning undersøgelse af sammensætningen og arkitektur af kulhydrat-rige materialer i den native tilstand uden større undertrykkelse af netbårne. Strukturelle undersøgelser er gennemført med succes på både primær og sekundær cellevægge af planter, katalytisk behandlede biomassen, bakterielle biofilm, pigment spøgelser i svampe og for nylig af forfattere, intakt cellevægge i en patogen svamp Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. udvikling af dynamiske nukleare polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 letter væsentligt NMR strukturelle udredning som følsomhed styrkelse af DNP markant forkorter den eksperimentelle tid på disse komplekse biomaterialer. Protokollen beskrevet her detaljer procedurerne for isotop-mærkning svamp A. fumigatus og forberede svampe og vegetabilske prøver for solid-state NMR og DNP karakterisering. Lignende mærkning procedurer bør finde anvendelse på andre svampe med ændrede medium, og prøven forberedelse procedurer bør gælde generelt for andre kulhydratrige biomaterialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vækst af 13C, 15N-mærket Aspergillus fumigatus flydende Medium

  1. Forberedelse af umærket og 13C, 15N-mærket vækstmediet
    Bemærk: Begge gær Extract pepton Dextrose medium (YPD) og den forbedrede minimal medium43 blev brugt til vedligeholdelse af svampe kultur. Alle trin efter autoklavering er udført i en laminar flow hood at minimere forurening.
    1. Forberedelse af umærket flydende medium: opløses 6,5 g YPD pulver i 100 mL destilleret vand og derefter autoklave i 25 min ved 134 ° C.
    2. Forberedelse af umærket solid medium
      1. Tilføj 1,5 g agar og 6,5 g YPD pulver i 100 mL destilleret vand.
      2. Autoklave medium i 25 min ved 121 ° C og derefter køle ned til ca. 50 ° C.
      3. 13-15 mL af medium overføres til hver pre sterile plastik petriskål og Dæk fadet med et låg straks.
    3. Forberedelse af 13C, 15N-mærket flydende medium
      Bemærk: For at forberede vækst løsning for isotop mærkning, en minimal medium indeholdende 13C-glukose og 15N-natrium nitrat og et mikronaeringsstof løsning er udarbejdet separat og derefter blandes inden brug.
      1. Forberede 100 mL af isotop-holdige minimal medium, som anført i tabel 1. PH indstilles til 6,6 ved hjælp af NaOH (1 M) eller HCl (1M) løsning.
      2. Autoklave minimal medium i 25 min ved 121 ° C.
      3. Forberede 100 mL (1, 000 x) af sporstoffer løsning, opløses de salte, der er anført i tabel 2 i destilleret vand. Autoklave løsning i 25 min ved 134 ° C. Køle ned og gemme løsningen ved 4 ° C til kortvarig brug. PH-værdi vil være ca 6,5 og kan kontrolleres ved hjælp af et pH-meter.
      4. Tilsættes 0,1 mL sporstoffer til 100 mL af 13C, 15N-mærket minimal medium, som anført i tabel 2 før brug.
  2. Vækst af svampe materialer
    1. Overføre en lille mængde af svampe fra opbevaring på en YPD tallerken ved hjælp af en inoculating loop i en laminar flow hætte. Holde kulturen ved 30 ° C i 2 dage i en inkubator.
    2. Bruge en inoculating løkke til at overføre en aktiv voksende svampe kant til 13C,15N-mærkning løsning i en laminar flow hætte. Holde kulturen ved 30 ° C i 3-5 dage på 220 rpm i en rystende inkubator.
    3. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 20 min. Fjern supernatanten og indsamle pelleten.
    4. Bruge en pincet til at indsamle ~0.5 g godt hydreret pellet (> 50 wt % hydrering) for NMR undersøgelser. Tab af hydrering på noget tidspunkt bliver væsentligt forværre den spektrale opløsning.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, en lille mængde (0,1 g) af de hydreret mycelia kan adskilles og fuldt tørret under N2 gasflow i en hætte eller en lyophilizer at vurdere niveauet hydrering og tør masse beregnes. Normalt, en pellet, der indeholder ~0.3 g tør masse kan opnås efter 3 dage. Hvis NMR forsøget skal gennemføres er lang (> 7 dage) og/eller hvis tilstanden af svampene skal fastsættes, svampe materialet kan fryses dybt og flydende N2 i 10-20 min. før videre behandling. Hvis eksperimentet vil være kort (3-6 dage), indefrysning kan hoppet, således at prøven kan stadig frisk.
    5. Bland det overskydende materiale med 20% (v/v) af glycerol i et centrifugeglas, og holde det i en-80 ᵒC fryser til langtidsopbevaring.

2. forberedelse af A. fumigatus for Faststof NMR og DNP undersøgelser

  1. Forberedelse af A. fumigatus for solid-state NMR eksperimenter
    1. Dialyze 13C, 15N-mærket svampe prøve (trin 1.2.4.) mod 1 L 10 mM fosfat buffer (pH 7,0) ved 4 ° C ved hjælp af en dialyse taske med en 3,5 kDa Molekylær vægt cutoff til at fjerne små molekyler fra vækstmediet for en samlet periode på 3 dage. Ændre bufferen to gange dagligt.
      Bemærk: Alternativt stikprøven kunne blive vasket 6 - 10 gange ved hjælp af deioniseret vand til at fjerne tilbageværende små molekyler.
    2. Overføre prøven i en 15 mL rør og centrifugeres i 5 min (10.000 x g) ved hjælp af en benchtop centrifuge. Fjern supernatanten og indsamle de resterende svampe materialer.
    3. Pack 70-80 mg af den ensartet 13C-mærket og godt hydreret prøve indsætte i en 4-mm ZrO2 rotoren eller 30-50 mg til 3,2 mm rotorer for NMR eksperimenter. Gentagne gange klemme prøve forsigtigt ved hjælp af en metalstang og absorbere det overskydende vand ved hjælp af papir.
    4. Stramt cap rotoren og indsætte prøven i spektrometeret for solid-state NMR karakterisering.
      Bemærk: De helt nye rotorer er foreslået at minimere muligheden for rotoren crash og prøve olieudslip i NMR-spektrometer. Hvis det er nødvendigt, kan en engangs Kel-F indsætte med forsegling skruer bruges til at tjene som en sekundær beholder inde i rotoren.
  2. Forberedelse af A. fumigatus prøver for DNP eksperimenter
    1. Forberede 100 µL af DNP opløsningsmidler29,44 (også kendt som DNP matrix) i 1,5 mL microcentrifuge rør til 13C,15N-mærket svampe prøver. Denne DNP matrix indeholder en blanding af d8-glycerol/D2O/H2O (60/30/10 Vol %).
      Bemærk: Hvis umærkede prøver skal undersøges, derefter forberede DNP matrix ved hjælp af 13C-forarmet d8-glycerol (12C3, 99,95%; D8, 98%) og D2O og H2O undgå 13C signal bidrag fra opløsningsmidler.
    2. Opløse 0,7 mg AMUPol45 i 100 µL af DNP opløsningsmidler til form 10 mM radikale stamopløsning. Vortex for 2-3 min. til at sikre, at radikale er helt opløst i løsningen.
    3. Sættetid 10 mg af det dialyzed 13C, 15N-mærket svampe materialer som beskrevet i forudgående trin (trin 2.1.1 og 2.1.2) i 50 µL af AMUPol løsning, og mildt male blandingen med en støder og en morter for at sikre udbredelsen af radikale i de porøse cellevægge.
      Bemærk: For at reducere antallet af hydrering tab, slibning kan også finde sted i et microcentrifuge rør ved hjælp af en micropestle.
    4. Tilføje en anden 30 µL af den radikale løsning til den slebne pellet til yderligere hydrat svampe prøven.
    5. Emballere pellet i en 3.2-mm safir rotor, klemme mildt og fjerne den overskydende DNP opløsningsmiddel. Tilføje et 3.2-mm silikone stik for at forhindre tab af hydrering. Typisk kan 5-30 mg af prøven pakkes til rotoren. Det nøjagtige beløb skal fastsættes af kravet følsomhed af NMR eksperimenter skal gennemføres.
    6. Indsæt og spin op prøven i et DNP spektrometer, måle en DNP-udvidet spektrum under mikrobølgeovn bestråling og sammenligne det med mikrobølgeovn-off spektrum. Dette vil føre til en forbedring faktor εTænd/sluk, som skulle være 20-40 for disse komplekse materialer. Køre de designede eksperimenter for at bestemme cellens væg struktur.

3. forberedelse af plantebiomasse for NMR og DNP undersøgelser

  1. Forberedelse af plantematerialer for solid-state NMR
    1. Producere ensartet 13C-mærket planter in-house bruger 13CO2 leverancer i et kammer eller 13C-glucose vækstmedium som tidligere beskrevet46,47 eller direkte købe mærket materialer fra isotop mærkning virksomheder.
      Bemærk: 13C-glucose kan kun bruges i mørke vækst for at undgå indførelsen af 12C ved fotosyntese.
    2. Skære den ensartet 13C mærket plantemateriale i små stykker (typisk 1-2 mm i dimentional) ved hjælp af et laboratorium barberblad.
      Bemærk: Afhængigt af formålet, de udpakkede cellevægge er undertiden bruges til strukturel karakterisering og de detaljerede protokoller er rapporteret i tidligere undersøgelser21,46.
    3. Hvis prøven var forinden tørret, tilføje 100 µL vand til 30 mg af plantematerialer i 1,5 mL microcentrifuge rør, vortex, Blandingen henstår ved stuetemperatur i 1 dag. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 10 min. og fjerne det overskydende vand ved hjælp af en pipette.
    4. Hvis prøven blev aldrig tørrede på ethvert tidspunkt, direkte bruge prøve uden yderligere behandling.
    5. Pack de resulterende plantematerialer i 3.2-mm eller 4 mm ZrO2 rotorer for solid-state NMR eksperimenter.
  2. Forberedelse af plantematerialer for DNP undersøgelser
    1. Forberede 60 µL stamopløsning af 10 mM AMUPol radikale som beskrevet trin 2.2.1 og 2.2.2.
    2. Skære den ensartet 13C mærket plantemateriale studeres i små stykker (1-2 mm i dimentional) ved hjælp af et laboratorium barberblad og vejer 20 mg af plantematerialer.
    3. Hånd-grind plante stykker i små partikler (~ 1-2 mm i størrelsen) ved hjælp af en morter og pistil. De endelige pulver har en homogen udseende.
    4. Tilføje 40 µL af DNP stamopløsningen forberedt i forudgående trin (trin 2.2.2) til plantematerialet og male mildt for 5 min at sikre homogen blanding med radikale.
    5. Tilføje en anden 20 µL af stamopløsningen til yderligere fugte plantematerialet efter slibning.
    6. Pakke eksemplet afbalancerede plante ind i en 3.2-mm safir rotor for DNP eksperimenter. Indsæt en silikone stik for at undgå tab af hydrering.

4. standard Solid-State NMR eksperimenter for første karakterisering af kulhydrat-rige biomaterialer

Bemærk: En kort oversigt over NMR eksperimenter er fastsat i denne afdeling. Strukturelle udredning kræver dog typisk omfattende ekspertise. Derfor, kollaborativ indsats med NMR spectroscopists anbefales.

  1. Foranstaltning 1D 13C Cross polarisering (CP), 13C direkte polarisering (DP) med 2-s og 35 genanvende forsinkelser, og 1H -13C UDUELIGE48,49 spektre at opnå en generel forståelse af den dynamiske distribution af celle komponenter (figur 1a). Cellevægge er typisk relativt stiv del og udstille dominerende signaler i CP-spektrum.
  2. Måle en række standard 2D 13C -13C korrelation eksperimenter for resonans tildelinger af 13C signaler. Start med præcisering UTILSTRÆKKELIG50,51 at få CO2-forbindelse, som skal bistås af en række gennem rumforsøgene såsom 1,5-ms RFDR52 (figur 1b) og 50-ms ledning/DARR53 eksperimenter.
    Bemærk: Hvis det er af interesse at finde en stikprøve rig i en bestemt komponent, for eksempel, den primære eller sekundære cellevægge, derefter flere segmenter eller flere planter kan skal måles separat for at finde eksemplet med den optimale sammensætning.
  3. Udføre 2D 15N -13C korrelation eksperimenter, der kan måles til at lette resonans tildelinger af proteiner og nitrogenated kulhydrater.
    Bemærk: Resonans tildeling er typisk tidskrævende. En metode er i øjeblikket ved at blive udviklet for at lette resonans tildelingen af kulhydrat signaler for disse forskere uden forudgående erfaring.
  4. Måle mere specialiseret forsøgene for at bestemme den rumlige proximities (figur 1 c, d), hydrering og mobiliteter af komplekse biomolekyler til at bestemme den tre-dimensionelle struktur af de kulhydratrige materialer som systematisk beskrevet tidligere22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isotop mærkning væsentligt forbedrer NMR følsomhed og gør det muligt for måling af en serie af 2D 13C -13C og 13C -15N korrelation spectra at analysere sammensætningen, hydrering, mobilitet og pakning af polymerer, som vil blive integreret til at konstruere en tre-dimensionelle model af cellevæggen arkitektur (figur 1). Hvis den ensartede mærkning lykkes, et komplet sæt af 1D 13C og 15N spektre kan afhentes inden for 1 time og hver standard 2D spektrum bør tage længere end 24 timer af måling.

Velforberedt prøver normalt forvente både høje NMR intensiteter og skarpe linjer. At gå på kompromis med enten parameteren angiver un-optimeret prøveforberedelse. Svampe prøverne bør være forberedt på en måde, aldrig tørrede, og delvis dehydrering under pakning trin kan føre til en bemærkelsesværdig udvidelse af linewidth. Hvis den eksperimentelle tid er væsentligt længere end forventet for et fuldt pakket NMR prøve, kan niveauet mærkning være lavt. Hvis off diagonal signaler er vanskeligt at opnå i 2D 13C -13C korrelation spektrum, kan statistiske mærkning være opstået (figur 1b). De to 13C toppe på 96 og 92 ppm er signatur carbon 1 signaler af glucose54, derfor deres stærke intensitet i den kvantitative 13C direkte polarisering (DP) spectra målt med lange genanvende forsinkelser af 35 s typisk angive dominans af små molekyler som følge af ufuldstændig dialyse eller vask (figur 1a). Med godt mærket prøver, kan langtrækkende korrelationer måles yderligere for at opdage de rumlige nærliggende af biomolekyler (figur 1 c) og bygge den strukturelle model af intakt cellevægge (fig. 1 d).

Kemisk navn Kemiske formel Koncentration (g/L)
Dikalium fosfat K2HPO4 1.045 g
Magnesium-sulfat en MgSO4·7H2O 0,52 g
Monokaliumphosphat fosfat KH2PO4 0.815 g
15 N - natriumnitrat 15 NaNO3 6,0 g
Kalium klorid KCl 0,52 g
U -13C-glukose 13 C6H12O6 10,0 g

Tabel 1. Sammensætningen af den minimale medium.

Kemisk navn Kemiske formel Koncentration (g/L)
Ammonium molybdat tetrahydrat (NH4) 6 Mo7O24·4H2O 11 g
Borsyre H3BO3 11 g
Cobaltous chlorid hexahydrat CoCl2·6H2O 16 g
Kobberforbindelser sulfat pentahydrat CuSO4·5H2O 16 g
Jernholdige sulfat en FeSO4·7H2O 5 g
Manganous chlorid tetrahydrat Frihedsbevægelse2·4H2O 5 g
Tetranatrium ethylendiamintetraacetat Na4EDTA·4H2O 60 g
Zinksulfat en ZnSO4·7H2O 22 g

Tabel 2. Sammensætningen af mikronaeringsstoffer løsning (koncentreret). Bemærk, at for at forberede umærkede svampe, umærket glukose og umærkede natriumnitrat kan bruges.

Figure 1
Figur 1. Rutediagram for kendetegner svampe cellevæg struktur ved hjælp af solid-state NMR. (en) 1 D spektre for første prøve screening. Fra top til bund er INEPT, 13C DP med 2-s genanvende forsinkelser, 13C DP med 35-s genanvende forsinkelser og 13C CP spektre, med faldende mobilitet for de fundne molekyler. (b) 2D 13C -13C korrelation spektrum målt ved hjælp af 1,5-ms RFDR produktionsnedgang. (c) repræsentative intermolekylære tværs peak registreret bruger 15-ms PAR spektrum. (d) strukturelle model fremstillet af NMR data. Paneler en, c og d er blevet ændret fra Kang et al., Nat. Commun. 9, 2747 (2018). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med de biokemiske metoder, har solid-state NMR fordele som en ikke-destruktiv og høj opløsning teknik. NMR er også kvantitative sammensætning analyse, og i modsætning til de fleste andre analysemetoder, gør ikke har usikkerheden indført af begrænset opløseligheden af Biopolymerer. Oprettelsen af den nuværende protokol letter fremtidige undersøgelser på kulhydratrige biomaterialer og functionalized polymerer. Dog skal det bemærkes, at resonans tildeling og data analyse kan være tidskrævende og kræver normalt systematisk uddannelse. Forfatterne er i øjeblikket ved at udvikle værktøjer og databaser til at hjælpe forskere uden forudgående erfaring til at overvinde denne barriere.

Da den naturlige isotop overflod af 13C er kun 1,1%, er sandsynligheden for at observere en 13C -13C cross peak ved hjælp af umærket materialer kun 0,012% (1,1% x 1,1%) at bruge ensartet mærket prøver. Derfor, isotop berigelse opnås ved hjælp af denne protokol betydeligt forbedrer NMR følsomhed af fire størrelsesordener og muliggør 2D korrelation eksperimenter for Strukturbestemmelse.

De optimeret, godt hydreret prøver skal udstille skarpe linjer i 2D 13C -13C korrelation spektre. De mobile komponenter, såsom β-glucaner i A. fumigatus og Pektiner i planter skal udstille en fuld bredde på halv-maksimum (FWHM) linewidth af 0,3-0,5 ppm på 600-800 MHz NMR spektrometre29,31. De stive komponenter har lidt bredere toppe konformationelle heterogenitet af sukker-enheder udgør, repetitive og manglen på hurtige molekylære bevægelser. Den typiske 13C linewidth er 0,7-1,0 ppm for cellulose microfibrils i planter og 0,5-0,7 ppm for kitin i svampe55. Den skarpe linewidth af cellulose og chitin er hovedsageligt forårsaget af polymer crystallinity, derfor er delvist resistente til dehydrering og temperaturforandringer, for eksempel, den kryogene temperatur DNP eksperiment56,,57. Peak skarpheden af matrix polymerer, men er meget følsom over for ændringen af prøven forhold, der påvirker polymer mobilitet, derfor, det kan bruges som en indikator for prøven hydrering. Hovedlinjerne i matrix polymerer udpege typisk manglen hydrering i stikprøven, hvilket kan være helt eller delvis genoprettet af tilføje vand58. Typisk, en hydrering niveau på 50-80 wt % er nok til at give en god linewidth i både planter og svampe prøver.

DNP er ofte nødvendige for at undersøge disse udfordrende hele-celle systemer. Typisk, en 20-40 fold forbedring af følsomheden kan opnås på en optimeret prøve på en 600 MHz/395 GHz DNP spektrometret og denne værdi stiger med faldende felt, for eksempel, næsten fordoblet på en 400 MHz/263 GHz DNP26,59 . Der er flere faktorer, der kan påvirke DNP effektivitet. Først radikaler indtrængen i den porøse netværk af cellevægge er afgørende, og denne proces kan lettes betydeligt ved mild slibning af biomaterialer i matrixen radikal-holdige DNP. For det andet de fysiske egenskaber, stivhed f.eks af prøven påvirker valget af mikrobølgeovn magt, DNP matrix "smelter" under 12 W bestråling som det fremgår af slibning af 1H resonanser, hvilket ikke var et problem for den stivere plante stammer60. Som et resultat, en mere isotropic mønster af 1H opløsningsmidlets top er observeret, med lavere væsentligt spinning sidebands og svækkede DNP ekstraudstyr. Derfor anbefales svagere magt for blødere materialer. For det tredje, sammensætningen af DNP matrix skal optimeres. Det viser sig, at d8-glycerol/D2O/H2O er generelt de bedste opløsningsmidler for bløde materialer, mens en enklere og billigere valg af D2O/H2O kan også være effektiv i nogle tilfælde fordi sukker til stede i systemet tjener som cryoprotectants til en vis grad. I kontrast, den d6-DMSO/D2O/H2O løsning mislykkes i både planter og svampe prøver, med mindre end 10-fold følsomhed ekstraudstyr, således det ikke anbefales til brug medmindre til særlige formål. En matrix-fri protokol har for nylig vist sig for at være meget effektiv på grund af opløsningsmiddel udtynding, hvilket skaber ekstra plads til at rumme flere materialer34,56,61. Men tabet af hydrering præsenterer en større undertrykkelse af netbårne i biomolekylers struktur, således denne metode kan ikke være egnet til biologiske systemer. Hvis umærkede cellevægge er at blive undersøgt, 13C-forarmet d8-glycerol/D2O/H2O er den optimale opløsningsmiddel, der bidrager ikke nogen naturlig overflod 13C signaler eller ofrer noget følsomhed ekstraudstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem NSF OIA-1833040. Nationale høj magnetfelt Laboratory (NHMFL) er støttet af National Science Foundation gennem DMR-1157490 og staten Florida. MAS-DNP system på NHMFL er delvis finansieret af NIH S10 OD018519 og NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Biokemi spørgsmålet 144 Faststof NMR dynamisk nuklear polarisering (DNP) kulhydrater cellevægge biomaterialer plante svampe
Forberedelse af svampe og plantematerialer for strukturelle udredning ved hjælp af dynamisk nuklear polarisering Solid-State NMR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter