Summary

Beredning av svamp och växtmaterial för strukturella klarläggande använder dynamisk nukleära polarisering Solid-State NMR

Published: February 12, 2019
doi:

Summary

Ett protokoll för att förbereda 13C,15N-märkt svamp och växt prover för flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi och dynamiska nukleära polarisering (DNP) undersökningar presenteras.

Abstract

Detta protokoll visar hur jämnt 13C, 15N-märkt svamp material kan produceras och hur dessa mjuka material bör fortsättas för solid-state NMR och utökad känslighet DNP experiment. Till exempel förädling av växtbiomassa är också detaljerade. Denna metod tillåter mätning av en rad 1D och 2D 13C –13C /15N korrelationer spectra, som möjliggör högupplöst strukturella förtydligandet av komplexa biomaterial i sitt ursprungliga tillstånd, med minimal störning. Isotop-märkning kan granskas av kvantifiera intensiteten i 1D spectra och polarisering spruttryck i 2D korrelation spectra. Framgången för dynamisk nukleära polarisering (DNP) provberedning kan utvärderas av den känslighet enhancement faktorn. Ytterligare experiment att undersöka de strukturella aspekterna av polysackarider och proteiner leder till en modell av den tredimensionella arkitekturen. Dessa metoder kan ändras och anpassas för att undersöka en rad olika kolhydratrika material, inklusive naturliga cellväggarna i växter, svampar, alger och bakterier, samt syntetiserade eller utformade kolhydratpolymerer och deras komplex med andra molekyler.

Introduction

Kolhydrater har en central roll i olika biologiska processer som energilagring, strukturella byggnad, och cellulära erkännande och vidhäftning. De är berikade i cellväggen, som är en grundläggande komponent i växter, svampar, alger och bakterier1,2,3. Cellväggen fungerar som en central källa för produktion av biobränsle och biomaterial, samt en lovande måltavla för antimikrobiella terapier4,5,6,7,8 , 9.

Den samtida förståelsen av dessa komplexa material har tidigarelagts väsentligen av decenniers ansträngningar som ägnades åt strukturella karakterisering med fyra stora biokemiska eller genetiska metoder. Den första stora metoden bygger på sekventiella behandlingar med starka kemikalier eller enzymer bryta ner cellväggarna i olika delar, som följs av sammansättning och länkage analys av socker i varje bråkdel10. Denna metod belyser domän fördelningen av polymerer, men tolkningen kan vara missvisande på grund av de kemiska och fysikaliska egenskaperna av biomolekyler. Exempelvis är det svårt att avgöra huruvida den alkali-extraherbara fraktionen härstammar från en enda domän av mindre strukturerade molekyler eller rumsligt separerade molekyler med jämförbara löslighet. Andra, den extraherade delar eller hela cellväggar kan också mätas med hjälp av lösning NMR för att bestämma kovalenta kopplingarna, också betecknas som crosslinking, mellan olika molekyler11,12,13, 14,15. På detta sätt kovalent ankare detaljerad struktur kunde bli utforskad, men begränsningar kan finnas på grund av den låga lösligheten av polysackarider, det relativt lilla antalet crosslinking platser och okunnighet om icke-kovalenta effekter som stabiliserar polysackarid packning, inklusive väte-limning, van der Waals kraften, elektrostatiska växelverkan och polymer entanglement. Tredje, affinitet har varit beslutsam i vitro med isolerade polysackarider16,17,18,19, men rening förfaranden kan väsentligt förändra struktur och egenskaper hos dessa biomolekyler. Denna metod underlåter också att replikera den sofistikerade nedfall och sammansättningen av makromolekyler efter biosyntes. Slutligen den fenotyp, cellmorfologi och mekaniska egenskaper av genetiska mutanter med försvagat produktion av vissa cellväggen komponent kasta ljus på de strukturella funktionerna av polysackarider, men mer molekylära bevis behövs för att överbrygga dessa makroskopiska observationer med funktionen konstruerad av protein maskinerier20.

Senaste framstegen inom utveckling och tillämpning av flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi har infört en unik möjlighet för att lösa dessa strukturella pussel. 2D/3D solid-state NMR-experimenten aktivera högupplösta utredning av sammansättningen och arkitekturen av kolhydratrika material i native staten utan större störningar. Strukturella studier har genomförts framgångsrikt på både primära och sekundära cellväggar av växter, katalytiskt behandlade biomassa, bakteriell biofilm, pigmentet spöken i svampar och nyligen av författarna, intakta cellväggar i en patogen svamp Aspergillusfumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. utvecklingen av dynamiska nukleära polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 underlättar väsentligt NMR strukturella förtydligandet som känslighet förbättrande av DNP förkortar markant experimentella tiden på dessa komplexa biomaterial. Protokollet beskrivs här information om förfarandena för isotopen-märkning svampen A. fumigatus och förbereda svamp och växtprover för solid-state NMR och DNP karakterisering. Liknande märkning förfaranden bör vara tillämplig på andra svampar med förändrad medium, och prov förberedelse förfarandena bör vara allmänt tillämpliga på andra kolhydratrika biomaterial.

Protocol

1. tillväxt av 13C, 15N-märkt Aspergillusfumigatus flytande Medium Beredning av omärkta och 13C, 15N-märkt odlingsmediumObs: Både jäst extrakt pepton dextros medium (YPD) och den förbättra minimal medium43 användes för underhåll av svamp kultur. Alla steg efter autoklavering utförs i en LAF att minimera kontaminering. Beredning av omärkta flytande medium: lös 6,5 g YPD pulver i 100 mL destillerat vatten och se…

Representative Results

Isotopen märkning avsevärt förbättrar NMR känslighet och gör det möjligt för mäta en serie 2D 13C -13C och 13C -15N korrelation spectra att analysera den sammansättning, återfuktning, rörlighet och packning av polymerer, som kommer att integreras för att konstruera en tredimensionell modell av cellväggen arkitekturen (figur 1). Om enhetlig märkning lyckas, en komplett uppsättning 1D 13C oc…

Discussion

Jämfört med de biokemiska metoderna, har solid-state NMR fördelar som en icke-förstörande och högupplösande teknik. NMR är också kvantitativa sammansättning analys, och till skillnad från de flesta andra analysmetoder, gör inte har osäkerheten introducerades av biopolymerer begränsad löslighet. Inrättandet av det nuvarande protokollet underlättar framtida studier på kolhydratrika biomaterial och functionalized polymerer. Det bör dock noteras att resonans tilldelning och dataanalys kan vara tidskrävand…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av National Science Foundation genom NSF OIA-1833040. Nationella laboratoriet för höga magnetfält (NHMFL) stöds av National Science Foundation genom DMR-1157490 och delstaten Florida. MAS-DNP systemet på NHMFL är delvis finansierad av NIH S10 OD018519 och NSF CHE-1229170.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol – Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall – the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall – beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks – Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, &. #. 2. 2. 0. ;., Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin’s target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Play Video

Cite This Article
Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

View Video