Ett protokoll för att förbereda 13C,15N-märkt svamp och växt prover för flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi och dynamiska nukleära polarisering (DNP) undersökningar presenteras.
Detta protokoll visar hur jämnt 13C, 15N-märkt svamp material kan produceras och hur dessa mjuka material bör fortsättas för solid-state NMR och utökad känslighet DNP experiment. Till exempel förädling av växtbiomassa är också detaljerade. Denna metod tillåter mätning av en rad 1D och 2D 13C –13C /15N korrelationer spectra, som möjliggör högupplöst strukturella förtydligandet av komplexa biomaterial i sitt ursprungliga tillstånd, med minimal störning. Isotop-märkning kan granskas av kvantifiera intensiteten i 1D spectra och polarisering spruttryck i 2D korrelation spectra. Framgången för dynamisk nukleära polarisering (DNP) provberedning kan utvärderas av den känslighet enhancement faktorn. Ytterligare experiment att undersöka de strukturella aspekterna av polysackarider och proteiner leder till en modell av den tredimensionella arkitekturen. Dessa metoder kan ändras och anpassas för att undersöka en rad olika kolhydratrika material, inklusive naturliga cellväggarna i växter, svampar, alger och bakterier, samt syntetiserade eller utformade kolhydratpolymerer och deras komplex med andra molekyler.
Kolhydrater har en central roll i olika biologiska processer som energilagring, strukturella byggnad, och cellulära erkännande och vidhäftning. De är berikade i cellväggen, som är en grundläggande komponent i växter, svampar, alger och bakterier1,2,3. Cellväggen fungerar som en central källa för produktion av biobränsle och biomaterial, samt en lovande måltavla för antimikrobiella terapier4,5,6,7,8 , 9.
Den samtida förståelsen av dessa komplexa material har tidigarelagts väsentligen av decenniers ansträngningar som ägnades åt strukturella karakterisering med fyra stora biokemiska eller genetiska metoder. Den första stora metoden bygger på sekventiella behandlingar med starka kemikalier eller enzymer bryta ner cellväggarna i olika delar, som följs av sammansättning och länkage analys av socker i varje bråkdel10. Denna metod belyser domän fördelningen av polymerer, men tolkningen kan vara missvisande på grund av de kemiska och fysikaliska egenskaperna av biomolekyler. Exempelvis är det svårt att avgöra huruvida den alkali-extraherbara fraktionen härstammar från en enda domän av mindre strukturerade molekyler eller rumsligt separerade molekyler med jämförbara löslighet. Andra, den extraherade delar eller hela cellväggar kan också mätas med hjälp av lösning NMR för att bestämma kovalenta kopplingarna, också betecknas som crosslinking, mellan olika molekyler11,12,13, 14,15. På detta sätt kovalent ankare detaljerad struktur kunde bli utforskad, men begränsningar kan finnas på grund av den låga lösligheten av polysackarider, det relativt lilla antalet crosslinking platser och okunnighet om icke-kovalenta effekter som stabiliserar polysackarid packning, inklusive väte-limning, van der Waals kraften, elektrostatiska växelverkan och polymer entanglement. Tredje, affinitet har varit beslutsam i vitro med isolerade polysackarider16,17,18,19, men rening förfaranden kan väsentligt förändra struktur och egenskaper hos dessa biomolekyler. Denna metod underlåter också att replikera den sofistikerade nedfall och sammansättningen av makromolekyler efter biosyntes. Slutligen den fenotyp, cellmorfologi och mekaniska egenskaper av genetiska mutanter med försvagat produktion av vissa cellväggen komponent kasta ljus på de strukturella funktionerna av polysackarider, men mer molekylära bevis behövs för att överbrygga dessa makroskopiska observationer med funktionen konstruerad av protein maskinerier20.
Senaste framstegen inom utveckling och tillämpning av flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi har infört en unik möjlighet för att lösa dessa strukturella pussel. 2D/3D solid-state NMR-experimenten aktivera högupplösta utredning av sammansättningen och arkitekturen av kolhydratrika material i native staten utan större störningar. Strukturella studier har genomförts framgångsrikt på både primära och sekundära cellväggar av växter, katalytiskt behandlade biomassa, bakteriell biofilm, pigmentet spöken i svampar och nyligen av författarna, intakta cellväggar i en patogen svamp Aspergillusfumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. utvecklingen av dynamiska nukleära polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 underlättar väsentligt NMR strukturella förtydligandet som känslighet förbättrande av DNP förkortar markant experimentella tiden på dessa komplexa biomaterial. Protokollet beskrivs här information om förfarandena för isotopen-märkning svampen A. fumigatus och förbereda svamp och växtprover för solid-state NMR och DNP karakterisering. Liknande märkning förfaranden bör vara tillämplig på andra svampar med förändrad medium, och prov förberedelse förfarandena bör vara allmänt tillämpliga på andra kolhydratrika biomaterial.
Jämfört med de biokemiska metoderna, har solid-state NMR fördelar som en icke-förstörande och högupplösande teknik. NMR är också kvantitativa sammansättning analys, och till skillnad från de flesta andra analysmetoder, gör inte har osäkerheten introducerades av biopolymerer begränsad löslighet. Inrättandet av det nuvarande protokollet underlättar framtida studier på kolhydratrika biomaterial och functionalized polymerer. Det bör dock noteras att resonans tilldelning och dataanalys kan vara tidskrävand…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av National Science Foundation genom NSF OIA-1833040. Nationella laboratoriet för höga magnetfält (NHMFL) stöds av National Science Foundation genom DMR-1157490 och delstaten Florida. MAS-DNP systemet på NHMFL är delvis finansierad av NIH S10 OD018519 och NSF CHE-1229170.
Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Acros Organics | 12054-85-2 | |
AMUPol | Cortecnet | C010P002 | |
Analytical weighing balance | Ohaus | B730439218 | Model PA84C |
Bioclave 16 L | VWR | 470230-598 | |
Biosafety Cabinet | Labconco corporation | 302319100 | |
Boric acid | VWR | BDH9222 | store at 15-30 °C |
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate | Honeywell|Fluka | 60820 | ≥98 % |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | BDH | BDH9312 | ≥98 % |
Corning LSE shaking incubator | Thermo Fisher Scientific | 7202152 | |
D2O | Sigma Aldrich | 151882 | 99.9 atom % D |
d6-DMSO | Sigma Aldrich | 151874 | 99.9 atom % D |
d8-glycerol | Sigma Aldrich | 447498 | ≥99 atom % D |
Dialysis tubing 3.2 kDa | Sigma Aldrich | D2272 | 132724 |
Dipotassium Phosphate | VWR | BDH9266 | ≥98 % |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | ≥99.5 % |
Heraus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 750004271 | Maximum RCF 25,830 x g |
HR-MAS Disposable Insert Kit | Bruker | B4493 | Kel-F |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 14498 | ≥99+ % |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | VWR | 10034998 | store at 18-26 °C |
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Alfa Aesar | 11563 | ≥99 % |
Monopotassium Phosphate | VWR | 470302-254 | ≥99 % |
pH Meter | Mettler Toledo | B706689216 | |
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate | Acros Organics | 13235-36-9 | ≥99.5 % |
Zinc Sulfate Heptahydrate | Alfa Aesar | 33399 | ≥98 % |
12C3, d8-glycerol | Cambridge Isotope Laboratory | CDLM-8660 | 12C3, 99.95%; D8, 98% |
13C6-glucose | Sigma Alrdrich | 364606 | ≥99 % (CP) |
15N-sodium nitrate | Sigma Aldrich | 364606 | ≥98 % 15N, ≥99 (cp) |
3.2 mm sapphire NMR rotor | Cortecnet | B6939 | |
3.2 mm Silicone plug | Bruker | B7089 | |
4 mm MAS Rotor Kit | Bruker | H14355 | Zirconia |