Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

Abstract

Questo protocollo viene illustrato come uniformemente 13C, 15N-labeled fungine materiali possono essere prodotta e come questi materiali morbidi dovrebbero essere proceduti per NMR allo stato solido e sensibilità avanzata DNP esperimenti. La procedura di elaborazione del campione di biomassa vegetale è anche dettagliata. Questo metodo consente la misurazione di una serie di 1D e 2D 13C -13C / gli spettri di correlazioni15N, che consente ad alta risoluzione delucidazione strutturale dei complessi biomateriali nel loro stato nativo, con minima perturbazione. L'isotopo-etichettatura può essere esaminato da quantificare l'intensità negli spettri di 1D e l'efficienza del trasferimento di polarizzazione negli spettri di correlazione 2D. Il successo della preparazione del campione di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) possa essere valutato per il fattore di aumento di sensibilità. Ulteriori esperimenti esaminando gli aspetti strutturali del polisaccaridi e proteine porterà ad un modello dell'architettura tridimensionale. Questi metodi possono essere modificati e adattati per studiare una vasta gamma di materiali ricchi di carboidrati, tra cui le pareti della cellula naturale di piante, funghi, alghe e batteri, così come sintetizzato o progettato carboidrati polimeri e il loro complesso con altri molecole.

Introduction

Carboidrati svolgono un ruolo centrale in vari processi biologici come stoccaggio di energia, costruzione strutturale e riconoscimento cellulare e adesione. Sono arricchiti nella parete delle cellule, che è un componente fondamentale in piante, funghi, alghe e batteri1,2,3. La parete cellulare funge da una fonte centrale per la produzione di biocombustibili e biomateriali, come pure un bersaglio promettente per terapie antimicrobiche4,5,6,7,8 , 9.

La moderna comprensione di questi materiali complessi è stato sostanzialmente avanzata da decenni di sforzi che sono stati dedicati alla caratterizzazione strutturale utilizzando quattro principali metodi biochimici o genetici. Il primo metodo principale si basa su trattamenti sequenziali utilizzando sostanze chimiche aggressive o enzimi per abbattere i muri della cella in diverse porzioni, che è seguita da compositivo e analisi di linkage di zuccheri in ogni frazione10. Questo metodo mette in luce la distribuzione di dominio dei polimeri, ma l'interpretazione può essere fuorviante a causa delle proprietà chimiche e fisiche di biomolecole. Ad esempio, è difficile determinare se la frazione di alcali-estraibile ha origine da un singolo dominio di molecole meno strutturati o da molecole nello spazio separate con solubilità paragonabile. In secondo luogo, le porzioni estratte o intere pareti della cellula può anche essere misurate utilizzando soluzione NMR per determinare i legami covalenti, anche definiti come reticolazione, tra molecole diverse11,12,13, 14,15. In questo modo, potrebbe essere sondata la struttura dettagliata delle ancore covalente, ma possono esistere limitazioni a causa della bassa solubilità di polisaccaridi, il numero relativamente piccolo di reticolazione siti e l'ignoranza degli effetti non-covalente che stabilizza imballaggio di polisaccaride, inclusi legami a idrogeno, forza di van der Waals, interazione elettrostatica e dell'intrico di polimero. In terzo luogo, l'affinità di legame è stata determinata in vitro utilizzando polisaccaridi isolato16,17,18,19, ma la purificazione delle procedure possono alterare sostanzialmente la struttura e le proprietà di queste biomolecole. Questo metodo inoltre non riesce a replicare la deposizione sofisticato e l'assemblaggio di macromolecole dopo biosintesi. Infine, il fenotipo, morfologia delle cellule e proprietà meccaniche dei mutanti genetici con produzione attenuato di certo componente della parete cellulare capannone luci sulle funzioni strutturali di polisaccaridi, ma prova più molecolare è necessaria per colmare questi osservazioni macroscopiche con la funzione ingegnerizzata di proteina macchinari20.

Recenti progressi nello sviluppo e applicazione della spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale hanno introdotto un'occasione unica per risolvere questi enigmi strutturali. Indagini ad alta risoluzione della composizione e architettura di materiali ricchi di carboidrati nello stato nativo senza perturbazione principali abilitare esperimenti NMR allo stato solido 2D/3D. Studi strutturali sono stati condotti con successo sia primaria e pareti di cella secondaria delle piante, la biomassa cataliticamente trattata, biofilm batterico, il pigmento fantasmi in funghi e, di recente dagli autori, le pareti della cellula intatte in un fungo patogeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. lo sviluppo di polarizzazione nucleare dinamica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 facilita sostanzialmente delucidazione strutturale NMR in quanto l'aumento di sensibilità di DNP contrassegnato riduce il tempo sperimentale su questi biomateriali complessi. Il protocollo descritto qui i dettagli le procedure per la marcatura a isotopi del fungo a. fumigatus e preparando fungine e campioni di piante per la caratterizzazione NMR e DNP a stato solido. Procedure di etichettatura simili dovrebbero essere applicabile ad altri funghi con alterato medio, e le procedure di preparazione del campione dovrebbero essere generalmente applicabile ad altri biomateriali ricchi di carboidrati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. crescita di 13C, 15N-labeled fumigatus dell'aspergillo mezzo liquido

  1. Preparazione di adenoide e 13C, 15N-labeled crescita medio
    Nota: Entrambi mezzo lievito estrarre Peptone destrosio (YPD) e il miglioramento medio minimo43 sono stati utilizzati per il mantenimento della coltura fungosa. Tutti i passaggi dopo la sterilizzazione in autoclave sono eseguiti in una cappa a flusso laminare per minimizzare la contaminazione.
    1. Preparazione del mezzo liquido senza etichetta: sciogliere 6,5 g di polvere YPD in 100 mL di acqua distillata e quindi autoclave per 25 minuti a 134 ° C.
    2. Preparazione del mezzo solido senza etichetta
      1. Aggiungere 1,5 g di agar e 6,5 g di polvere YPD in 100 mL di acqua distillata.
      2. Autoclave medio per 25 minuti a 121 ° C e poi raffreddare fino a circa 50 ° C.
      3. 13-15 mL di terreno di trasferimento in ogni capsula di Petri di plastica pre-sterile e coprire il recipiente con un coperchio immediatamente.
    3. Preparazione di 13C, 15N-labeled mezzo liquido
      Nota: Per preparare la soluzione di crescita isotopo etichettatura, un medium minimo contenente 13C-glucosio e 15N-sodio nitrato e una soluzione di oligoelementi sono preparati separatamente e poi mescolati prima dell'uso.
      1. Preparare 100 mL di terreno minimo isotopo-contenente, come elencato nella tabella 1. Regolare il pH a 6.6 usando NaOH (1m) o una soluzione di HCl (1M).
      2. Autoclave il terreno minimo per 25 min a 121 ° C.
      3. Preparare 100 mL (1, 000 x) della soluzione di oligoelementi, sciogliere i sali elencati nella tabella 2 in acqua distillata. Autoclave la soluzione per 25 minuti a 134 ° C. Raffreddare e conservare la soluzione a 4 ° C per uso a breve termine. Il pH sarà circa 6.5 e può essere controllato utilizzando un pH-metro.
      4. Aggiungere 0,1 mL di soluzione di oligoelementi per 100 mL di 13C, medium minimo di 15N-etichettato come elencato nella tabella 2 prima dell'uso.
  2. Crescita dei materiali fungini
    1. Trasferire una piccola quantità di funghi dal deposito su un piatto YPD utilizzando un'ansa da inoculo in cappa a flusso laminare. Conservare la cultura a 30 ° C per 2 giorni in un'incubatrice.
    2. Utilizzare un'ansa da inoculo per trasferire un bordo fungina crescente attivo a 13C,15N-etichettatura di soluzione in una cappa a flusso laminare. Mantenere la cultura a 30 ° C per 3-5 giorni a 220 giri/min in un incubatore d'agitazione.
    3. Centrifugare a 4.000 x g per 20 minuti rimuovere il surnatante e raccogliere il pellet.
    4. Utilizzare una pinzetta per raccogliere ~0.5 g di pellet ben idratata (> 50% di idratazione wt) per gli studi NMR. Perdita di idratazione in qualsiasi punto peggiorerà notevolmente la risoluzione spettrale.
      Nota: Se necessario, una piccola quantità (0,1 g) del micelio idratata possono essere separate e completamente essiccata sotto flusso di gas di N2 in un cappuccio o un liofilizzatori per stimare il livello di idratazione e calcolare la percentuale della massa secca. Di solito, un pellet contenenti ~0.3 g massa secca può essere ottenuta dopo 3 giorni. Se l'esperimento NMR per essere condotto è lungo (> 7 giorni) e/o se lo stato dei funghi deve essere risolto, il materiale fungo possa essere profondamente congelato in liquido N2 per 10-20 min prima del successivo trattamento. Se l'esperimento sarà breve (3-6 giorni), il congelamento può essere ignorato il campione può rimanere fresco.
    5. Mescolare il materiale in eccesso con il 20% (v/v) di glicerolo in una provetta da centrifuga e tenerlo in un congelatore-80 ᵒC per immagazzinaggio a lungo termine.

2. preparazione di a. fumigatus per NMR allo stato solido e studi di DNP

  1. Preparazione di a. fumigatus per esperimenti NMR allo stato solido
    1. Dializzare il 13C, 15N-labeled fungine campione (passo 1.2.4.) contro 1 L di tampone fosfato 10 mM (pH 7,0) a 4 ° C, con un sacchetto di dialisi con 3,5 peso molecolare kDa taglio per rimuovere piccole molecole da mezzo di crescita per un periodo complessivo di 3 giorni. Modificare il buffer due volte al giorno.
      Nota: In alternativa, il campione potrebbe essere lavato per 6 - 10 volte con acqua deionizzata per rimuovere residui piccole molecole.
    2. Trasferire il campione in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min (10.000 x g) utilizzando una centrifuga da banco. Rimuovere il supernatante e raccogliere i restanti materiali fungini.
    3. Confezione: 70-80 mg dell'uniformemente 13campione marcato C e ben idratata incollare in un di ZrO2 rotore a 4 mm o 30-50 mg per rotori di 3,2 mm per esperimenti NMR. Ripetutamente spremere l'esempio delicatamente utilizzando una bacchetta di metallo e assorbire l'acqua in eccesso con carta.
    4. Strettamente il rotore di cap e inserire il campione lo spettrometro per caratterizzazione NMR allo stato solido.
      Nota: I rotori nuovo di zecca sono suggeriti per minimizzare la possibilità di arresto del rotore e fuoriuscita nello spettrometro NMR di esempio. Se necessario, un inserto monouso di Kel-F con viti di tenuta può essere utilizzato per servire come un contenitore secondario all'interno del rotore.
  2. Preparazione di campioni di a. fumigatus per esperimenti DNP
    1. Preparare 100 µ l di DNP solventi29,44 (noto anche come la matrice DNP) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per 13C,15N-labeled fungine campioni. Questa matrice DNP contiene una miscela di d8-glicerolo/D2O/H2O (30/60/10% in volume).
      Nota: Se senza etichetta campioni sono da studiare, quindi preparare la matrice di DNP utilizzando 13C-vuotati d8-glicerolo (12C3, 99,95%; D8, 98%) e D2O e H2O per evitare 13C segnale contributo da solventi.
    2. Sciogliere 0,7 mg di AMUPol45 a 100 µ l di solventi DNP di soluzione stock radicale modulo 10 mM. Vortex per 2-3 min garantire che i radicali sono completamente dissolto nella soluzione.
    3. Ammollo 10 mg del dializzato 13C, 15N-labeled fungine materiali come descritto nei passaggi precedenti (punti 2.1.1 e 2.1.2) in 50 µ l di soluzione di AMUPol e macinare leggermente il composto con un mortaio e un pestello per garantire la penetrazione dei radicali in le pareti della cellula porose.
      Nota: Per ridurre il tasso di perdita di idratazione, la macinazione può anche avvenire in una microcentrifuga utilizzando un micropestle.
    4. Aggiungere un altro 30 µ l della soluzione radicale al pellet macinato all'ulteriore idrato il campione fungo.
    5. Imballare il pellet in un rotore di zaffiro di 3,2 mm, spremere leggermente e rimuovere l'eccesso di solvente DNP. Aggiungere un tappo di silicone 3,2 mm per evitare la perdita di idratazione. In genere, 5-30 mg di campione possono essere confezionati al rotore. L'importo esatto deve essere determinata dall'esigenza di sensibilità degli esperimenti NMR essere condotto.
    6. Inserire e girare il campione in uno spettrometro DNP, misurare un spettro di DNP-aumentata sotto irradiazione a microonde e confrontarlo con lo spettro di forno a microonde. Questo porterà ad un aumento fattore εinserita/disinserita, che dovrebbe essere di 20-40 per questi materiali complessi. Eseguire gli esperimenti progettati per determinare la struttura della parete cellulare.

3. preparazione di biomassa vegetale per NMR e studi DNP

  1. Preparazione di materiali vegetali per NMR allo stato solido
    1. Uniformemente producono 13C-etichetta piante interne utilizzando 13CO2 forniture in un crescita camera o 13C-medium del glucosio come descritto in precedenza46,47 o acquistare direttamente i materiali etichettati dai marcatura a isotopi aziende.
      Nota: 13C-glucosio utilizzabile solo in crescita scuro per evitare l'introduzione di 12C dalla fotosintesi.
    2. Tagliare l'uniformemente 13C con etichetta materiale vegetale in piccoli pezzi (in genere 1-2 mm di dimensione) utilizzando una lama di rasoio di laboratorio.
      Nota: A seconda dello scopo, le pareti della cellula estratte a volte sono usate per la caratterizzazione strutturale e i protocolli dettagliati sono riportati nel precedente studi21,46.
    3. Se il campione è stato preventivamente essiccato, aggiungere 100 µ l di acqua a 30 mg di materie vegetali in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, vortice, equilibrare a temperatura ambiente per 1 giorno. Centrifugare a 4.000 x g per 10 min e togliere l'acqua in eccesso utilizzando una pipetta.
    4. Se il campione è stato mai seccato in qualsiasi punto, utilizzare direttamente il campione senza ulteriore trattamento.
    5. Imballare i materiali di pianta risultante in 3,2 mm o 4 mm ZrO2 rotori per esperimenti NMR allo stato solido.
  2. Preparazione di materiali vegetali per studi DNP
    1. Preparare 60 µ l di soluzione di 10 mM AMUPol radicale come descritti passaggi 2.2.1 e 2.2.2.
    2. Tagliare l'uniformemente 13C con etichetta materiale vegetale da studiare in piccoli pezzi (1-2 mm di dimensione) utilizzando una lama di rasoio di laboratorio e pesano 20 mg di materiali vegetali.
    3. Mano-frantumare i pezzi di pianta in piccole particelle (~ 1-2 mm di dimensione) utilizzando un mortaio e un pestello. Le polveri finale hanno un aspetto omogeneo.
    4. Aggiungere 40 µ l di soluzione madre DNP preparato nel passaggio precedente (punto 2.2.2) e al materiale vegetale e macinare leggermente per 5 min garantire omogeneità di miscelazione con il radicale.
    5. Aggiungere un altro 20 µ l di soluzione di riserva per idratare ulteriormente il materiale vegetale dopo macinazione.
    6. Imballare il campione di pianta equilibrato in un rotore di zaffiro di 3,2 mm per esperimenti di DNP. Inserire un tappo di silicone per evitare la perdita di idratazione.

4. gli esperimenti NMR allo stato solido standard per la caratterizzazione iniziale dei biomateriali ricchi di carboidrati

Nota: Una breve descrizione degli esperimenti NMR è fornita in questa sezione. Tuttavia, delucidazione strutturale richiede in genere una vasta esperienza. Pertanto, si raccomanda agli sforzi di collaborazione con strutturisti NMR.

  1. Misura 1D 13C Cross polarizzazione (CP), 13C polarizzazione diretta (DP) con 2 s e 35-s riciclare ritardi e 1H -13C inetto49 spettri48,per ottenere una comprensione generale della dinamica distribuzione di componenti delle cellule (Figura 1a). Le pareti cellulari sono in genere parte relativamente rigida e mostrano segnali dominanti nello spettro CP.
  2. Misurare una serie di esperimenti di correlazione 2D standard 13C -13C per le assegnazioni di risonanza dei segnali 13C. Iniziare con inadeguata riorientato50,51 per ottenere la connettività di carbonio, che hanno bisogno di essere assistito da una serie di esperimenti, attraverso lo spazio come 1.5-ms RFDR52 (Figura 1b) e cavo di 50 ms/DARR53 esperimenti.
    Nota: Se è di interesse per trovare un campione ricco di un componente specifico, ad esempio, il primario o pareti di cella secondaria, quindi più segmenti o impianti multipli necessario misurare separatamente per trovare l'esempio con la composizione ottimale.
  3. Condurre esperimenti di correlazione13C 2D 15N - che possono essere misurati per facilitare le assegnazioni di risonanza di proteine e carboidrati azotate.
    Nota: L'assegnazione di risonanza è in genere molto tempo. Un metodo è attualmente in fase di sviluppo per facilitare l'assegnazione di risonanza dei segnali di carboidrati per quegli scienziati senza precedente esperienza.
  4. Misurare gli esperimenti più specializzati per determinare la prossimità spaziale (Figura 1 c, d), l'idratazione e la mobilità di biomolecole complesse per determinare la struttura tridimensionale dei materiali ricchi di carboidrati come sistematicamente descritta precedentemente22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La marcatura a isotopi sostanzialmente aumenta la sensibilità di NMR e rende possibile per una serie di 13C -15N correlazione spettri per analizzare la composizione, l'idratazione, la mobilità e 2D 13C -13C di misura e l'imballaggio di polimeri, che saranno integrati per costruire un modello tridimensionale dell'architettura della parete cellulare (Figura 1). Se l'etichettatura uniforme ha esito positivo, un set completo di 1D 13C e 15N spettri possa essere raccolti all'interno di 1 h e ogni spettro 2D standard dovrebbe richiedere non più di 24 h di misura.

Campioni ben preparati di solito si aspettano entrambi ad alta intensità di NMR e linee taglienti. Compromettere di entrambi i parametri indica la preparazione del campione-optimized. I campioni fungini devono essere preparati in un modo mai seccato e disidratazione parziale durante le operazioni di imballaggio potrebbe portare a un notevole ampliamento del linewidth. Se il tempo sperimentale è sostanzialmente più tempo del previsto per un campione di NMR completamente imballato, il livello d'etichettatura potrebbe essere basso. Se segnali di disattivare diagonale sono difficili da ottenere nello spettro di correlazione 2D 13C -13C, etichettatura statistica potrebbe essersi verificato (Figura 1b). I due picchi di 13C a 96 e 92 ppm sono segnali di carbonio 1 firma di glucosio54, pertanto, le relative intensità forte nei quantitativi 13C diretta spettro di polarizzazione (DP) misurato con riciclo lunghi ritardi di 35 s indicano in genere la dominanza di piccole molecole a causa di dialisi incompleta o lavaggio (Figura 1a). Con campioni ben identificati, correlazioni a lungo raggio possono essere misurate ulteriormente per rilevare la prossimità spaziale di biomolecole (Figura 1C) e costruire il modello strutturale delle pareti cellulari intatti (Figura 1D).

Nome chimico Formula chimica Concentrazione (g/L)
Fosfato dipotassico K2HPO4 1,045 g
Solfato di magnesio eptaidrato MgSO4·7H2O 0,52 g
Potassio fosfato monobasico KH2PO4 0,815 g
15 N - nitrato di sodio 15 NaNO3 6,0 g
Cloruro di potassio KCl 0,52 g
U -13C-glucosio 13 C6H12O6 10,0 g

Tabella 1. La composizione del terreno minimo.

Nome chimico Formula chimica Concentrazione (g/L)
Ammonio molibdato tetraidrato (NH4) 6 Mo7O24·4H2O 11 g
Acido borico H3BO3 11 g
Cloruro di cobalto esaidrato CoCl2·6H2O 16 g
Solfato rameico pentaidrato CuSO4·5H2O 16 g
Solfato ferroso eptaidrato FeSO4·7H2O 5 g
Cloruro manganoso tetraidrato MnCl2·4H2O 5 g
Etilendiamminatetraacetato di tetrasodio Na4EDTA·4H2O 60 g
Zinco solfato eptaidrato ZnSO4·7H2O 22 g

Tabella 2. La composizione della soluzione dell'oligoelemento (concentrata). Si noti che per la preparazione di funghi senza etichetta, glucosio senza etichetta e senza etichetta nitrato di sodio può essere utilizzati.

Figure 1
Figura 1. Diagramma di flusso per la caratterizzazione di struttura di parete cellulare fungina mediante NMR allo stato solido. (un) 1 D spectra per lo screening del campione iniziale. Dall'alto verso il basso sono inetto, 13C DP con 2-s recycle ritarda, 13C DP con 35-s recycle ritardi e spettri C CP 13, con la diminuzione della mobilità per le molecole rilevate. (b) 2D 13C -13C correlazione spettro misurato utilizzando 1.5-ms RFDR accoppiamento. (c) rappresentante Croce intermolecolari picco rilevato utilizzando spettro PAR 15-ms. (d) modello strutturale ottenuto da dati NMR. Pannelli a, c e d sono state modificate da Kang et al., Naz Commun. 9, 2747 (2018). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Confrontato con i metodi biochimici, NMR allo stato solido ha vantaggi come una tecnica non distruttiva e ad alta risoluzione. NMR è anche in analisi della composizione quantitativa, e a differenza di molti altri metodi analitici, fa non sono le incertezze introdotte dalla solubilità limitata dei biopolimeri. Istituzione dell'attuale protocollo facilita gli studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Tuttavia, dovrebbe essere notato che l'analisi di dati e di assegnazione di risonanza può richiedere molto tempo e di solito richiedono una formazione sistematica. Gli autori stanno sviluppando strumenti e database per aiutare gli scienziati senza precedente esperienza a superare questa barriera.

Poiché l'abbondanza naturale dell'isotopo 13C è solo 1,1%, la probabilità di osservare un 13C -13C Croce picco utilizzando senza etichetta materiali è solo 0.012% (1,1% x 1,1%) dell'utilizzo di uniformemente etichettato campioni. Di conseguenza, l'arricchimento isotopico raggiunto utilizzando questo protocollo sostanzialmente aumenta la sensibilità di NMR di quattro ordini di grandezza e consente esperimenti di correlazione 2D per la determinazione strutturale.

I campioni ottimizzati, ben idratati dovrebbero esibire linee taglienti negli spettri di correlazione 2D 13C -13C. I componenti mobili, come i β-glucani in a. fumigatus e le pectine nelle piante dovrebbero esibire un interi a linewidth (FWHM) mezzo massimo di 0,3-0,5 ppm su 600-800 MHz NMR spettrometri29,31. I componenti rigidi hanno picchi leggermente più ampie dovuto eterogeneità conformazionale delle unità dello zucchero che costituiscono, ripetitivo e la mancanza di moti molecolari rapidi. Il tipico 13C linewidth è 0.7-1.0 ppm per cellulosa microfibrils in piante e 0,5-0,7 ppm per chitina in funghi55. Il linewidth tagliente di cellulosa e chitina sono principalmente causati da cristallinità del polimero, così è parzialmente resistente alla disidratazione e cambiamento di temperatura, ad esempio, la temperatura criogenica di DNP esperimento56,57. La nitidezza di picco di polimeri di matrice, tuttavia, sono altamente sensibili al cambiamento delle condizioni del campione che influenzano la mobilità di polimero, pertanto, può essere utilizzato come un indicatore di idratazione del campione. A grandi linee dei polimeri di matrice designano in genere la mancanza di idratazione nel campione, che può essere completamente o parzialmente recuperato aggiungendo nuovamente acqua58. In genere, un livello di idratazione del 50-80% in peso è sufficiente per fornire una buona linewidth in pianta sia campioni fungini.

DNP è spesso necessario per lo studio di questi sistemi di cellule intere impegnativi. In genere, un miglioramento di piega di 20-40 di sensibilità potrebbe essere realizzato su un campione ottimizzato su uno spettrometro DNP 600 MHz/395 GHz e questo valore aumenta con la diminuzione di campo, ad esempio, è quasi raddoppiato su un 400 MHz/263 GHz DNP26,59 . Ci sono diversi fattori che potrebbero influenzare l'efficienza DNP. In primo luogo, la penetrazione dei radicali nella rete porosa delle pareti cellulari è fondamentale e questo processo può essere facilitato sostanzialmente dalla lieve rettifica dei biomateriali nella matrice DNP contenenti radicali. In secondo luogo, le proprietà fisiche, la rigidità, ad esempio, del campione colpisce la scelta di potenza a microonde, la matrice DNP "scioglie" sotto 12 irradiazione W come testimoniano l'affilatura delle risonanze 1H, che non era un problema per la pianta più rigida nasce60. Di conseguenza, un modello più isotropo del picco solvente 1H è osservato, con sostanzialmente inferiore bande laterali di filatura e attenuato DNP valorizzazione. Di conseguenza, più debole potenza è raccomandato per materiali più morbidi. In terzo luogo, la composizione della matrice DNP dovrebbe essere ottimizzata. Si scopre che d8-glicerolo/D2O/H2O è generalmente i migliori solventi per materiali morbidi, mentre una scelta più semplice e più conveniente di D2O/H2O può anche essere efficace in alcuni casi, perché gli zuccheri presentano nel sistema serve come crioprotettori in una certa misura. In contrasto, la d6-DMSO/D2O/H2O soluzione non funziona in entrambe le piante e campioni di funghi, con meno di 10 volte dell'aumento di sensibilità, così non è consigliabile per l'uso a meno che non per gli scopi speciali. Un protocollo privo di matrice recentemente è stato dimostrato di essere altamente efficace a causa della deplezione di solvente, che crea ulteriore spazio per ospitare più materiali34,56,61. Tuttavia, la perdita di idratazione presenta una perturbazione principale alla struttura di biomolecole, quindi questo metodo potrebbe non essere adatto a sistemi biologici. Se le pareti cellulari senza etichetta sono di essere studiato, 13C-vuotati d8-glicerolo/D2O/H2O è il solvente ottimo che non contribuisce alcun segnale di 13C abbondanza naturale né sacrifica qualsiasi sensibilità miglioramento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Non abbiamo nulla di divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation attraverso NSF OIA-1833040. Il laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) è supportata dalla National Science Foundation attraverso DMR-1157490 e dello stato della Florida. Il sistema di MAS-DNP presso NHMFL è in parte finanziato dal NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Biochimica problema 144 NMR allo stato solido dinamico polarizzazione nucleare (DNP) carboidrati pareti cellulari biomateriali vegetali funghi
Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter