Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utarbeidelsen av sopp og plantemateriale for strukturelle Elucidation bruker dynamiske kjernefysiske polarisering SSD NMR

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59152
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll for å forberede 13C,15N-merket sopp og plante prøver for flerdimensjonale SSD NMR spektroskopi og dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP) undersøkelser er presentert.

Abstract

Denne protokollen viser hvordan jevnt 13C, 15N-merket fungal materialer kan være produsert og hvordan disse myke materialer bør bli fortsatte for SSD NMR og følsomhet forbedret DNP eksperimenter. Eksempel behandling prosedyren av anlegget biomasse er også detaljert. Denne metoden kan måling av en rekke 1D- og 2D 13C -13C /15N sammenhenger spectra, som gir høy oppløsning strukturelle utviklingen av kompleks biologisk materiale i sin opprinnelige tilstand, med minimal forstyrrelsene. Isotop-merking kan undersøkes av kvantifisere intensiteten i 1D spectra og polarisering overføring effektiviteten i 2D korrelasjon spectra. Suksessen til dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP) eksempel forberedelse kan evalueres med følsomhet ekstrautstyr faktor. Ytterligere eksperimenter undersøke de strukturelle aspektene av polysakkarider og proteiner vil føre til en modell av tredimensjonale arkitektur. Disse metodene kan endres og tilpasset for å undersøke en rekke karbohydrat-rik materialer, inkludert naturlig cellen vegger av, sopp, alger og bakterier, samt syntetisk eller karbohydrater polymerer og deres kompleks med andre molekyler.

Introduction

Karbohydrater spille en sentral rolle i ulike biologiske prosesser som energilagring, strukturelle bygningen, og mobilnettet anerkjennelse og vedheft. De er beriket i celleveggen, som er en grunnleggende komponent i, sopp, alger og bakterier1,2,3. Cellen vegg fungerer som en sentral kilde for produksjon av biodrivstoff og biologisk materiale, samt en lovende mål for antimikrobielle behandlinger,4,,5,,6,,7,,8 , 9.

Den moderne forståelsen av disse komplekse materialer har blitt vesentlig avanserte av tiår med innsats som var viet til strukturelle karakterisering ved hjelp av fire store biokjemiske eller genetiske metoder. Den første store metoden avhenger av sekvensiell behandlinger bruker sterke kjemikalier eller enzymer bryte ned cellen vegger i ulike deler, som er etterfulgt av komposisjonelle og koblingsanalyse av sukker i hver fraksjon10. Denne metoden belyser domene fordelingen av polymerer, men tolkningen kan det være misvisende på grunn av de kjemiske og fysiske egenskapene av biomolecules. For eksempel er det vanskelig å avgjøre om alkaliske-utvinnbare brøken stammer fra ett enkelt domene mindre strukturert molekyler eller romlig atskilt molekyler med sammenlignbare oppløselighet. Andre utdraget deler eller hele cellen vegger kan også måles bruker løsning NMR for å avgjøre kovalente sammenhengen, også betegnet som crosslinking, mellom ulike molekyler11,12,13, 14,15. På denne måten detaljert strukturen i kovalente ankere kan bli undersøkt, men begrensninger finnes p.g.a. lav oppløselighet av polysakkarider, relativt lite antall crosslinking områder og uvitenhet av ikke-kovalente effekter som stabiliserer polysakkarid pakking, inkludert hydrogen-binding, van der Waals kraft, elektrostatiske samhandling og polymer forviklinger. Tredje er forpliktende tilhørighet bestemt i vitro bruke isolert polysakkarider16,17,18,19, men rensing prosedyrer kan vesentlig endre strukturen og egenskapene til disse biomolecules. Denne metoden likeledes svikter å gjenskape sofistikert avsettelse og montering av makromolekyler etter biosyntesen. Til slutt, fenotype, celle morfologi og mekaniske egenskaper av genetisk mutanter med dempes produksjonen av visse cellen vegg komponent kaste lys på strukturelle funksjoner av polysakkarider, men mer molekylær bevis er nødvendig å bygge bro disse makroskopisk observasjoner med funksjonen utviklet av protein machineries20.

Nylige fremskritt innen utvikling og anvendelse av flerdimensjonale SSD NMR spektroskopi har innført en unik mulighet for å løse disse strukturell oppgaver. 2D/3D SSD NMR eksperimenter aktivere høyoppløselig undersøkelse av sammensetningen og arkitektur av karbohydrat-rik materialer i den opprinnelige tilstanden uten store forstyrrelsene. Strukturelle undersøkelser har blitt vellykket utført både primær og sekundær cellevegger av planter, katalytisk behandlet biomasse, bakteriell biofilm, pigment spøkelser i sopp og nylig av forfatterne, intakt cellen vegger i en sykdomsfremkallende sopp Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. utvikling av dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 muliggjør vesentlig NMR strukturelle forklaring som følsomhet styrking av DNP markert Skadetiden eksperimentelle på disse komplekse biologisk materiale. Protokollen beskrevet her detaljer prosedyrer for isotop-merking soppen A. fumigatus og forbereder sopp og plante prøver for SSD NMR og DNP karakterisering. Lignende fremgangsmåter som merking skal gjelder for andre sopp med endrede medium, og eksempel forberedelse prosedyrer bør være generelt gjelder for andre karbohydrat-rik biologisk materiale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vekst 13C, 15N-merket Aspergillus fumigatus flytende Medium

  1. Utarbeidelse av umerkede og 13C, 15N-merket oppblomstringen medium
    Merk: Begge gjær ekstra pepton druesukker medium (YPD) og den forbedrede minimal middels43 ble brukt for vedlikehold av sopp kultur. Alle trinnene etter autoklavering utføres laminær strømning hette å redusere forurensning.
    1. Utarbeidelse av umerkede flytende medium: oppløse 6.5 g av YPD pulver i 100 mL destillert vann og deretter autoklav for 25 min på 134 ° C.
    2. Utarbeidelse av umerkede solid medium
      1. Legge til 1,5 g av agar og 6.5 g YPD pulver i 100 mL destillert vann.
      2. Autoclave mediet for 25 min 121 ° C og deretter kjøle ned ca 50 ° C.
      3. Overføre 13-15 mL mediet til hver pre steril plast Petriskål og dekke parabolen med lokk umiddelbart.
    3. Utarbeidelse av 13C, 15N-merket flytende medium
      Merk: For å forberede vekst løsningen isotop merking, en minimal medium som inneholder 13C-glukose og 15N natrium nitrat og en spor-element løsning er utarbeidet separat og deretter blandet før bruk.
      1. Forberede 100 mL isotop inneholder minimal medium som er oppført i tabell 1. Justere pH til 6.6 NaOH (1 M) eller HCl (1M) løsning.
      2. Autoclave minimal mediet for 25 min på 121 ° C.
      3. Forberede 100 mL (1 000 x) av sporstoffer løsning, oppløse salter oppført i tabell 2 i destillert vann. Autoclave løsningen for 25 min på 134 ° C. Avkjøl og lagre løsningen på 4 ° C for kortvarig bruk. PH blir ca 6,5 og kan kontrolleres ved hjelp av en pH-meter.
      4. Legge til 0,1 mL av sporstoffer løsning 100 mL 13C, 15N-merket minimal medium som er oppført i tabell 2 før bruk.
  2. Vekst av sopp
    1. Overføre en liten mengde sopp fra lagring til en YPD plate med en inoculating løkke i laminær strømning hette. Hold kulturen på 30 ° C for 2 dager i en inkubator.
    2. Bruke en inoculating loop for å overføre en aktiv voksende sopp kanten til 13C,15N-merking løsning i laminær strømning hette. Holde kulturen på 30 ° C for 3-5 dager på 220 rpm i en risting inkubator.
    3. Sentrifuge 4000 x g i 20 min. Fjern nedbryting og samle pellet.
    4. Bruk en tweezer for å samle ~0.5 g godt hydrert pellet (> 50 wt % hydration) for NMR studier. Tap av fuktighet på noe tidspunkt vil vesentlig forverres spectral oppløsningen.
      Merk: Hvis nødvendig, en liten mengde (0,1 g) hydratiserte mycelia kan atskilt og helt tørket under N2 gasstrømmen hette eller en lyophilizer å anslå hydration nivå og beregne den tørr masse. Vanligvis pellets inneholder ~0.3 g tørr masse kan oppnås etter 3 dager. Hvis NMR eksperimentet gjennomføres er lang (> 7 dager) og/eller hvis staten at sopp må fikses, fungal materialet kan være dypt frosset i flytende N2 for 10-20 min før videre behandling. Hvis forsøket kort (3-6 dager), frysing kan hoppet slik at prøven kan være frisk.
    5. Bland det overskytende materialet med 20% (v/v) glyserol i en sentrifuge rør og holde den i-80 ᵒC fryser for langtidslagring.

2. utarbeidelse av A. fumigatus for Solid-state NMR og DNP studier

  1. Utarbeidelse av A. fumigatus for SSD NMR eksperimenter
    1. Dialyze 13C, 15N-merket fungal utvalg (trinn 1.2.4.) mot 1 L 10 mM fosfatbuffer (pH 7.0) ved 4 ° C med en dialyse pose med en 3,5 kDa molekylvekt cutoff for å fjerne små molekyler fra vekstmediet for en perioden på 3 dager. Endre bufferen to ganger daglig.
      Merk: Alternativt prøven kan vaskes 6 - 10 ganger bruker deionisert vann for å fjerne gjenværende små molekyler.
    2. Overføre prøven i en 15 mL tube og sentrifuger i 5 min (10 000 x g) ved hjelp av en Borstemmaskin sentrifuge. Fjern nedbryting og samle de gjenværende fungal materialene.
    3. Pakke 70-80 mg den jevnt 13C-merket og godt hydrert lime inn en 4 mm ZrO2 rotoren eller 30-50 mg til 3,2 mm rotorene for NMR eksperimenter. Full av gjentagelser klem prøven forsiktig med en metall stang og absorberer overflødig vann med papir.
    4. Tett cap rotoren og prøven inn spectrometer for SSD NMR karakterisering.
      Merk: Splitter nye rotorene er foreslo å minimere muligheten for rotoren krasj og prøve søl i NMR spectrometer. Om nødvendig kan en engangs Kel-F setter med tetting skruer brukes som en sekundær beholder inne rotoren.
  2. Utarbeidelse av A. fumigatus prøver for DNP eksperimenter
    1. Forberede 100 µL av DNP løsemidler29,44 (også kjent som DNP matrix) i en 1,5 mL microcentrifuge tube 13C,15N-merket fungal prøver. Denne DNP matrise inneholder en blanding av d8-glyserol/D2O/T2O (60/30/10 Vol %).
      Merk: Hvis umerkede prøver undersøkes, deretter forberede DNP matrisen med 13C-utarmet d8-glyserol (12C3, 99.95%. D8, 98%) og D2O og H2O for å unngå 13C signal bidrag fra løsemidlene.
    2. Oppløse 0,7 mg AMUPol45 100 µL av DNP løsemidler til skjemaet 10 mM radikale lagerløsning. Vortex i 2-3 min slik at radikaler er fullstendig oppløst i løsningen.
    3. Nyt 10 mg av de dialyzed 13C, 15N-merket fungal materialer som beskrevet i forrige trinn (trinn 2.1.1 og 2.1.2) i 50 µL AMUPol løsning, og mildt slipe blandingen med en morter en slik penetrasjon av radikalere i porøse cellevegger.
      Merk: For å redusere frekvensen av hydration tap, slipe kan også skje i et microcentrifuge rør med en micropestle.
    4. Legge til en annen 30 µL av radikale løsningen slipt pellets til ytterligere hydrat fungal prøven.
    5. Pakke pellet inn en 3,2 mm safir rotor, presse mildt og fjerne overflødig DNP løsemiddelet. Legge til en 3,2 mm silikon plugg for å hindre tap av fuktighet. Vanligvis kan 5-30 mg av prøven være pakket til rotoren. Hvor nøyaktige må bestemmes av følsomhet kravet av NMR eksperimenter gjennomføres.
    6. Sette inn og snurre eksemplet i en DNP spektrometer, måle en DNP forbedret spektrum under mikrobølgeovn bestråling og sammenligne den med mikrobølgeovn av spekteret. Dette vil føre til en forsterkning faktor εpå/av, som bør være 20-40 for disse komplekse materialer. Kjøre designet eksperimenter for å fastslå celleveggen struktur.

3. forberedelse av anlegget biomasse til NMR og DNP studier

  1. Forberedelse av plantemateriale for SSD NMR
    1. Produsere jevnt 13C-merket planter huset bruker 13CO2 forsyninger i et vekst kammer eller 13C-glukose medium som beskrevet tidligere46,47 eller kjøpe direkte merket materiale fra isotop-merking selskaper.
      Merk: 13C-glukose kan bare brukes i mørke vekst for å unngå innføring av 12C av fotosyntese.
    2. Kutt det jevnt 13C merket plantemateriale i små biter (vanligvis 1-2 mm inne dimensjonerer) med et laboratorium razor blad.
      Merk: Avhengig av formålet, utdraget cellen vegger er noen ganger brukt for strukturelle karakterisering og detaljert protokollene er rapportert i tidligere studier21,46.
    3. Hvis prøven var tidligere tørket, legge 100 µL av vann til 30 mg av plantemateriale i en 1,5 mL microcentrifuge tube, vortex, equilibrate ved romtemperatur for 1 dag. Sentrifuge 4000 x g i 10 min og fjerne overflødig vann med en pipette.
    4. Hvis utvalget var aldri tørket når som helst, direkte bruke prøven uten videre behandling.
    5. Pakk de resulterende plantemateriale til 3,2 mm eller 4 mm ZrO2 rotorene for SSD NMR eksperimenter.
  2. Forberedelse av plantemateriale for DNP studier
    1. Forberede 60 µL lagerløsning 10 mm AMUPol radikalt som beskrevet trinn 2.2.1 og 2.2.2.
    2. Kutt det jevnt 13C merket plantemateriale studier i små biter (1-2 mm inne dimensjonerer) bruker et laboratorium barberblad og veie 20 mg av anlegget.
    3. Hånd-grind anlegget bitene i små partikler (~ 1-2 mm i størrelse) med en morter. De endelige pulver har en homogen utseende.
    4. Legg til 40 µL av DNP lager løsningen forberedt i tidligere trinn (trinn 2.2.2) til plantemateriale og male mildt for 5 min å sikre homogen blanding med radikale.
    5. Legge til en annen 20 µL av lager løsningen ytterligere hydrat plantemateriale etter sliping.
    6. Pakke equilibrated anlegget prøven inn en 3,2 mm safir rotor for DNP eksperimenter. Sett inn en silikon plugg for å unngå tap av fuktighet.

4. standard SSD NMR eksperimenter for første karakteristikk av karbohydrat-rik biologisk materiale

Merk: En kort oversikt over NMR eksperimenter er gitt i denne delen. Men krever strukturelle elucidation vanligvis omfattende kompetanse. Det anbefales derfor samarbeid med NMR spectroscopists.

  1. Mål 1D 13C Cross polarisering (CP), 13C direkte polarisering (DP) med 2-s og 35-s resirkulere forsinkelser og 1H -13C UDUGELIG48,49 spectra å få en generell forståelse av den dynamiske distribusjon av cellen komponenter (figur 1a). Cellen vegger er vanligvis delen relativt stiv og utstillingen dominerende signaler i CP spekteret.
  2. Måle en rekke standard 2D 13C -13C korrelasjon eksperimenter for resonans tildelinger i 13C signaler. Start med refocused UTILSTREKKELIG50,51 å få karbon-tilkobling, som vil bli assistert av en rekke gjennom rommet eksperimenter som 1.5-ms RFDR52 (figur 1b) og 50-ms ledningen/DARR53 eksperimenter.
    Merk: Hvis det er av interesse for å finne et eksempel rik på en bestemt komponent, for eksempel den primære eller sekundære cellevegger, deretter flere segmenter eller flere planter må måles separat for å finne prøven med optimal sammensetningen.
  3. Utføre 2D 15N -13C korrelasjon eksperimenter som kan måles for å lette resonans tildelingene proteiner og nitrogenated karbohydrater.
    Merk: Resonans tildelingen er vanligvis tidkrevende. En metode bygges for tiden for å lette resonans tildelingen av karbohydrater signaler for de forskerne uten tidligere erfaring.
  4. Måle mer spesialisert eksperimenter for å bestemme romlige proximities (figur 1 c, d), fuktighet og mobilities av komplekse biomolecules å finne den tredimensjonale strukturen av karbohydrat-rik som systematisk beskrevet tidligere22,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isotop merkingen vesentlig forbedrer NMR følsomheten og gjør det mulig for å måle en rekke 2D 13C -13C og 13C -15N korrelasjon spectra analysere komposisjon, hydration, mobilitet og pakking av polymerer, som vil bli integrert for å konstruere en tredimensjonal modell av cellevegg arkitektur (figur 1). Hvis uniform merkingen lykkes, et komplett sett av 1D 13C og 15N spectra kan samles i 1 time og hver standard 2D spektrum bør ikke ta lenger enn 24 timer av måling.

Godt forberedt prøver vanligvis forventer både høy NMR intensitet og skarpe linjer. At enten parameteren angir un optimalisert eksempel forberedelse. Fungal prøvene bør være forberedt på en måte som aldri tørket, og delvis dehydrering under pakking trinnene kan føre til en betydelig utvidelse av linewidth. Hvis eksperimentelle tiden er vesentlig lengre tid enn forventet for et fullstendig fullpakket NMR utvalg, være merking nivået lav. Hvis av diagonal signaler er vanskelig å få tak i 2D 13C -13C korrelasjon spektrum, kan statistiske merking ha oppstått (figur 1b). De to 13C toppene på 96 og 92 ppm er signatur karbon 1 signaler til glukose54, derfor deres sterke intensiteter i kvantitative 13C direkte polarisering (DP) spectra målt med lang gjenvinne forsinkelser 35 s angir vanligvis dominans av små molekyler på grunn av ufullstendige dialyse eller vaske (figur 1a). Med godt merket prøver, kan langtrekkende sammenhenger videre måles for å oppdage de romlige proximities av biomolecules (figur 1 c) og lage den strukturelle modellen av intakt cellevegger (figur 1 d).

Kjemisk navn Kjemisk formel Konsentrasjon (finans)
Dipotassium fosfat K2HPO4 1.045 g
Magnesium sulfat Heptahydrate MgSO4·7H2O 0.52 g
Monopotassium fosfat KH2PO4 0.815 g
15 N - gruveselskaperne 15 NaNO3 6.0 g
Kalium klorid KCl 0.52 g
U -13C-glukose 13 C6H12O6 10,0 g

Tabell 1. Sammensetningen av minimal medium.

Kjemisk navn Kjemisk formel Konsentrasjon (finans)
Ammonium Molybdate Tetrahydrate (NH4) 6 Mo7O24·4H2O 11 g
Borsyre H3BO3 11 g
Cobaltous Chloride Hexahydrate CoCl2·6H2O 16 g
Cupric Sulfate Pentahydrate CuSO4·5H2O 16 g
Jernvitriol Heptahydrate FeSO4·7H2O 5 g
Mangansk Chloride Tetrahydrate MnCl2·4H2O 5 g
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Na4EDTA·4H2O 60 g
Sinksulfat Heptahydrate ZnSO4·7H2O 22 g

Tabell 2. Sammensetningen av spor-element løsningen (konsentrert). Merk at for å forberede umerkede sopp, umerkede glukose og umerkede gruveselskaperne kan brukes.

Figure 1
Figur 1. Flytskjema for å karakterisere fungal celleveggen struktur med SSD NMR. (et) 1 D spectra for første prøve screening. Fra toppen til bunnen er INEPT, 13C DP med 2-s gjenvinne forsinkelser, 13C DP med 35-s gjenvinne forsinkelser og 13C CP spectra, med redusert mobilitet for oppdaget molekyler. (b) 2D 13C -13C korrelasjon spektrum målt ved hjelp av 1.5-ms RFDR recoupling. (c) representant intermolekylære tvers peak oppdaget bruker 15-ms PAR spektrum. (d) strukturelle modellen fra NMR data. Paneler en c og d er endret fra Kang et al., Nat. kommunisert. 9, 2747 (2018). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med metodene biokjemiske, har SSD NMR fordeler som en ikke-destruktiv og høy oppløsning teknikk. NMR er også kvantitative kompositoriske analyse, og i motsetning til de fleste andre analytiske metoder, gjør ikke har usikkerhet introdusert av begrenset Løseligheten av biopolymers. Etablering av gjeldende protokollen forenkler fremtidige studier på karbohydrater-rik biologisk materiale og functionalized polymerer. Det bør imidlertid bemerkes at resonans tildeling og data analyse kan være tidkrevende og krever vanligvis systematisk opplæring. Forfatterne utvikler nå verktøy og databaser for å hjelpe forskere uten tidligere erfaring å overvinne denne barrieren.

Siden naturlig isotop overflod av 13C er bare 1,1%, er sannsynligheten for å observere en 13C -13C tvers peak bruker umerkede materialer bare 0.012% (1,1% x 1,1%) av det benytter jevnt merket prøver. Derfor isotop anriking ved hjelp av denne protokollen vesentlig forbedrer NMR følsomheten av fire størrelsesordener og gjør 2D korrelasjon eksperimenter for strukturelle besluttsomhet.

Optimalisert, godt hydrert prøvene skal ha skarpe linjer i 2D 13C -13C korrelasjon spectra. Mobile komponentene som β-glucans i A. fumigatus og pectins i planter bør ha en full bredde på halv-maksimale (FWHM) linewidth 0,3 til 0.5 ppm på 600-800 MHz NMR spektrometre29,31. De stive komponentene har litt bredere topper conformational heterogenitet av sukker konstituere, repeterende og mangel på rask molekylære bevegelser. Den typiske 13C linewidth er 0,7-1.0 ppm for cellulose microfibrils i planter og 0,5-0,7 ppm for chitin i sopp55. Den skarpe linewidth cellulose og chitin er hovedsakelig forårsaket av polymer crystallinity, dermed er delvis motstandsdyktige mot dehydrering og temperatur endring, for eksempel kryogene temperaturen av DNP eksperiment56,57. Topp skarpheten av matrix polymerer, men er svært følsom for endring av prøven forhold som påvirker polymer mobilitet, derfor det kan brukes som en indikator for eksempel hydration. Bred linjer med matrix polymerer vanligvis angi mangel på hydration i utvalget, kan helt eller delvis gjenopprettes ved å legge til vannet58. Et hydration nivå på 50-80 wt % er vanligvis nok for å gi en god linewidth i både plante- og fungal prøver.

DNP er ofte nødvendig for å undersøke disse utfordrende hele celle-systemene. Vanligvis, en 20-40 fold forbedring av følsomhet kan oppnås på en optimalisert prøve på en 600 MHz/395 GHz DNP spectrometer og denne verdien øker med redusert felt, for eksempel nesten doblet på en 400 MHz/263 GHz DNP26,59 . Det er flere faktorer som kan påvirke DNP effektiviteten. Først gjennomtrengning av radikaler i porøse nettverket av cellevegger er avgjørende, og denne prosessen kan være betydelig tilrettelagt av mild sliping av biologisk materiale i radikal inneholder DNP matrisen. Andre fysiske egenskaper, stivhet for eksempel av utvalget påvirker valg av mikrobølgeovn makt, DNP matrix "smelter" under 12 W bestråling som gjenspeiles av skarphet på 1H resonanser, som ikke var et problem for stivere anlegget stammer60. Som et resultat, et mer isotropic mønster av 1H løsemiddel toppen er observert, med lavere betydelig spinning sidebånd og dempes DNP ekstrautstyr. Svakere makt anbefales derfor for mykere materialer. Tredje skal sammensetningen av DNP matrix optimaliseres. Det viser seg at d8-glyserol/D2O/T2O er vanligvis de beste løsemidlene for myke materialer mens et enklere og billigere valg av D2O/T2O kan også være effektiv i noen tilfeller fordi sukker finnes i systemet fungerer som cryoprotectants til en viss grad. I kontrast, d6-DMSO/D2O/T2O løsning mislykkes i både planter og sopp prøver, med mindre enn 10-fold av sensitivitet ekstrautstyr, så det anbefales ikke for bruk med mindre til spesielle formål. En matrise-fri protokoll har nylig vist seg for å være svært effektive på grunn av løsemiddel utarming, som skaper ekstra plass til flere materialer34,56,61. Imidlertid tap av fuktighet presenterer en stor forstyrrelsene til strukturen for biomolecules, dermed denne metoden kan ikke være egnet for biologiske systemer. Hvis umerkede cellevegger er å bli studert, 13C-utarmet d8-glyserol/D2O/T2O er det optimale løsemiddelet som ikke bidrar alle naturlige overflod 13C signaler eller ofrer noen følsomhet ekstrautstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation gjennom NSF OIA-1833040. Den nasjonale høy magnetfelt Laboratory (NHMFL) støttes av National Science Foundation gjennom DMR-1157490 og delstaten Florida. MAS-DNP systemet NHMFL er finansiert delvis av NIH S10 OD018519 og NSF CHE-1229170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Biokjemi problemet 144 Solid-state NMR dynamisk kjernefysiske polarisering (DNP) karbohydrater celle vegger biologisk materiale anlegg sopp
Utarbeidelsen av sopp og plantemateriale for strukturelle Elucidation bruker dynamiske kjernefysiske polarisering SSD NMR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirui, A., Dickwella Widanage, M.… More

Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter