Summary
La méthode présentée crée des tissus végétaux naturels endommagés par l'herbivore grâce à l'application de larves de sexta de Manduca sur des feuilles détachées de pommes de terre. Le tissu végétal est mis en ligne pour l'expression de six homologs de facteur de transcription impliqués dans les réponses précoces à l'herbivorie d'insecte.
Abstract
La nature multitrophique des études d'expression génique de l'herbivorie d'insecte exige un grand nombre de répliques biologiques, créant la nécessité de protocoles d'herbivorie plus simples et plus rationalisés. Les perturbations des insectes à mâcher sont généralement étudiées dans des systèmes végétaux entiers. Bien que cette stratégie de l'organisme entier soit populaire, il n'est pas nécessaire que des observations similaires puissent être reproduites en une seule feuille détachée. L'hypothèse est que les éléments de base requis pour la transduction du signal sont présents dans la feuille elle-même. Dans le cas d'événements précoces dans la transduction du signal, les cellules n'ont qu'à recevoir le signal de la perturbation et à transmettre ce signal aux cellules voisines qui sont astoyées pour l'expression des gènes.
La méthode proposée change simplement le moment du détachement. Dans des expériences végétales entières, les larves sont confinées à une seule feuille qui est finalement détachée de la plante et aventurée pour l'expression des gènes. Si l'ordre d'excision est inversé, de la dernière dans des études végétales entières, à la première dans l'étude détachée, l'expérience d'alimentation est simplifiée.
Solanum tuberosum var. Kennebec est propagé par transfert nodal dans un milieu de culture tissulaire simple et transféré au sol pour une croissance ultérieure si désiré. Les feuilles sont excisées de la plante mère et relocalisées dans les plats Petri où l'alimentation est effectuée avec les stades larvaires de M. sexta. Le tissu foliaire endommagé est mis en ligne pour l'expression d'événements relativement précoces dans la transduction du signal. L'analyse de l'expression génique a permis d'identifier des facteurs de transcription Cys2-His2 (C2H2) spécifiques à l'infestation, confirmant le succès de l'utilisation de feuilles détachées dans les études de réponse précoce. La méthode est plus facile à exécuter que les infestations de plantes entières et utilise moins d'espace.
Introduction
Herbivory met en branle une série d'événements moléculaires au cours desquels une plante peut à la fois identifier l'attaque et monter une réponse appropriée pour sa survie. Une plante reçoit deux indices de base des insectes à mâcher; l'un des dommages physiques au tissu et l'autre de substances spécifiques aux insectes. Les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) sont libérés en réponse aux dommages créés par les parties buccales larvaires etdéclenchent une réponse bien définie de blessure qui a comme conséquence une augmentation de l'acide jasmonique d'hormone et de la transcription des gènes de défense 1. L'un des DAMP les plus connus est la systemine, un polypeptide qui est formé par le clivage de la protéine prosystemine plus grande après une feuille est blessée2,3. La réponse de blessure d'acide jasmonique est encore modulée par des modèles moléculaires herbivore-associés (HAMPs), qui peuventêtre dérivés de la salive de chenille, du contenu d'intestin (régurgitant) et des excréments (frass) 4. Les insectes utilisent ces substances pour stimuler ou échapper à la réponse de la défense5. Les facteurs de transcription relaient alors le message des signaux hormonaux dans la réponse de défense par la régulation des gènes de défense en aval6,7,8.
Certaines études d'interaction plante-insectes utilisées en laboratoire sont du type simulé, dans le but d'approxirér la méthode naturelle d'alimentation de l'insecte. L'herbivorie simulée est généralement accomplie en créant des dommages artificiels aux tissus végétaux avec divers outils qui imitent le mécanisme spécifique des parties buccales d'insecte suffisantes pour causer la libération des DAMP et déclencher la production des gènes de défense. D'autres composants spécifiques aux insectes tels que les sécrétions orales ou régurgitants sont souvent ajoutés pour reproduire la contribution des HAMPs9,10,11. La création d'une taille et d'un type de plaies spécifiques et l'application de quantités précises de HAMP est un avantage pour ces types d'études et peuvent offrir des résultats plus reproductibles. Les études d'herbivorie naturelle, où les dommages aux tissus végétaux sont causés par l'application d'insectes acquis sur le terrain ou élevés en laboratoire, sont souvent plus difficiles parce que les quantités de plaies et de HAMP sont régies par le comportement des insectes et ajoutent de la variabilité à la données. Les méthodes naturelles par rapport aux méthodes simulées et leurs avantages et inconvénients sont bien débattus dans la littérature12,13,14.
Pour étudier les événements de signalisation précoce tels que les facteurs de transcription, un certain pourcentage de la feuille doit être consommé dans un laps de temps relativement court, de sorte que les larves doivent commencer à mâcher immédiatement et maintenir la consommation jusqu'à ce que la feuille soit congelée pour analyse. M. sexta est une mangeoire vorace sur plusieurs plantes solitaires au cours de plusieurs de ses stades larvaires, ce qui le rend idéal pour donner un maximum de dommages dans un laps de temps relativement court15. Ceci est pratique lors de l'étude des événements de signalisation précoce, comme la réponse de la plante se produit presque immédiatement après un insecte entre en contact avec la surface de la feuille16,17. La méthode de confinement couramment utilisée par la cage à agrafes s'avère maladroite, car plusieurs cages nécessiteraient des ajustements continus tout au long de l'expérience pour permettre l'enlèvement ou l'ajout de larves. Les feuilles doivent également être assez grandes et assez fortes pour supporter l'alimentation de plusieurs insectes en même temps. Ces types de plants de pommes de terre ont besoin d'une grande quantité d'espace pour observer l'alimentation. Les larves se déplacent souvent vers le dessous de la surface des feuilles, ce qui rend également les observations d'alimentation assez difficiles. L'utilisation de plantes entières pour effectuer ces expériences est clairement lourde.
L'étude actuelle utilise des feuilles détachées isolées dans les plats Petri plutôt que des plantes entières pour rationaliser et simplifier l'approche végétale entière à l'étude de l'herbivorie. L'application du protocole dans cette étude se limite à l'observation d'un groupe de facteurs de transcription C2H2 induits tôt dans les feuilles de pomme de terre après des dommages herbivores par les larves de M. sexta.
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Protocol
REMARQUE : Le protocole suivant est conçu pour qu'une personne s'installe, fasse des observations et prérecueille des échantillons. Plusieurs exécutions d'une même configuration peuvent être combinées pour augmenter la réplication biologique. Toute répétition supplémentaire de l'expérience doit être mise en place en même temps de la journée pour éliminer les influences diurnes possibles sur l'expression des gènes. Le protocole est conçu pour créer 3 feuilles « infestées » pour 5 points de temps de récolte distincts. Les feuilles de commande assorties pour chaque point de temps créent un total de 30 échantillons. L'expérience peut être réalisée avec une variété de tailles de feuilles et d'étapes larvaires, mais il est recommandé que la taille des feuilles, le stade larvaire et le temps d'infestation soient uniformes tout au long de la procédure.
1. Préparation des plants de pommes de terre
REMARQUE: Toutes les étapes nécessitant une technique stérile doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire18,19.
- Préparer les plantlets Kennebec à partir de la source d'explantation.
- Préparer le milieu de propagation.
- Ajouter 4,43 g de Murashige et Skoog (MS) avec de la poudre de vitamines, 20 g de saccharose et 2 g de substitut d'agar à 1 L d'osmose inverse (RO) purifiée dans un flacon de 2 L avec une barre de spin. Transférer le flacon dans une plaque à remuer et mélanger. Ajuster le pH à 5,8 à l'aide de NaOH tout en continuant à remuer.
REMARQUE : L'agar ne se dissoudra pas tant qu'il n'aura pas été autoclaved. - Ajouter 1 ml de conservateur/biocide et autoclave sur cycle liquide pendant 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirer le milieu de l'autoclave immédiatement après la fin du cycle et le refroidir à 50 oC. Transférer 100 ml de vaisseaux de culture stériles et refroidis de propagation moyen à stérile (p. ex. Magenta ou Plantcon) à l'aide d'une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire.
- Ajouter 4,43 g de Murashige et Skoog (MS) avec de la poudre de vitamines, 20 g de saccharose et 2 g de substitut d'agar à 1 L d'osmose inverse (RO) purifiée dans un flacon de 2 L avec une barre de spin. Transférer le flacon dans une plaque à remuer et mélanger. Ajuster le pH à 5,8 à l'aide de NaOH tout en continuant à remuer.
- Préparer le matériel d'explantation.
- Obtenir la source d'explantation comme pommes de terre de semence de Kennebec et enlever toutes les traces de sol en lavant avec le robinet H2O. Enlever les germes et les couper en morceaux de 2 cm avec un scalpel stérile.
- Stériliser les morceaux de germes en trempant pendant 15 s dans 70 % d'éthanol, suivi de 13 min dans 1:1 eau de Javel (1 partie RO-eau : 1 partie d'eau de Javel germicide/commerciale concentrée). Rincer 5 fois dans le H2O stérile.
- Transférer le matériel d'explantation aux vaisseaux stériles de culture de tissu avec le milieu de propagation dans une hotte de culture de tissu utilisant la technique stérile. Transférer les récipients dans une chambre de culture des tissus végétaux et pousser pendant 2 semaines 20123 ou jusqu'à ce que les plantules se forment à 24 oC, 16 h de lumière (140 'mol 'm-2's-1)/8 h photopériode foncée.
- Préparer le milieu de propagation.
- Préparer des plants de pommes de terre de culture tissulaire propaganés par nodal.
- Préparer le milieu de transfert nodal.
REMARQUE : Cela fera 10 récipients de culture de tissu qui peuvent être employés le même jour ou peuvent être faits à l'avance et stockés à 4 oC jusqu'au transfert nodal.- Ajouter 36,43 g de mélange d'agar nutritif à 1 L d'eau purifiée dans un flacon de 2 L avec une barre de spin. Transférer le flacon dans une plaque à remuer et mélanger. Ajuster le pH à 5,8 à l'aide de KOH tout en continuant à remuer.
REMARQUE : L'agar ne se dissoudra pas tant qu'il n'aura pas été autoclaved. - Autoclave sur cycle liquide pendant 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirer le milieu de l'autoclave immédiatement après la fin du cycle et le refroidir à 50 oC. Transférer 100 ml de récipients de transfert nodal refroidis stériles à des récipients de culture stériles (voir le Tableau des matériaux) en utilisant une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire.
- Ajouter 36,43 g de mélange d'agar nutritif à 1 L d'eau purifiée dans un flacon de 2 L avec une barre de spin. Transférer le flacon dans une plaque à remuer et mélanger. Ajuster le pH à 5,8 à l'aide de KOH tout en continuant à remuer.
- Préparer les boutures nodales.
- Obtenir des plantules Kennebec cultivées à partir de matériaux d'explantation (produits à l'étape 1.1.2). Les plantlets doivent avoir au moins 3 à 4 nœuds (points de branche). Retirer les feuilles à l'aide de ciseaux stériles ou de scalpel. Couper les branches près de la tige principale, en laissant environ 2 mm de tissu de branche.
- Enlever les sections nodale de la tige en coupant environ 2 mm au-dessus et au-dessous de chaque point de branche ou noeud. Disposer les boutures nodales dans un récipient de culture tissulaire stérile contenant le milieu de transfert nodal (produit à l'étape 1.2.1.2) dans la même orientation que dans le vaisseau précédent (branche pointant vers le haut).
- Transférer les récipients avec des boutures nodales dans une chambre de culture de tissus végétaux et pousser pendant 2'u20123 semaines à 24 'C, 16 h de lumière (140 'mol'm -2's-1)/8 h photopériode sombre.
REMARQUE : Chaque coupe nodale se transformera en nouveau plantlet. Le nombre de boutures dans chaque navire détermine la taille des feuilles. Moins de boutures transférées par navire se traduira par de plus grandes feuilles. Trois plantes par navire auront des feuilles de 15 mm x 20 mm en 2'u20123 semaines.
- Préparer le milieu de transfert nodal.
- (Facultatif) Préparer les plants de pommes de terre Kennebec cultivés dans le sol.
REMARQUE : Pour produire de plus grandes feuilles, les plantuées de pommes de terre nadiques propagées peuvent être transférées au sol.- Transférer les plantulets de pommes de terre cultivés dans le milieu de transfert nodal au sol en tirant doucement la plante du milieu jusqu'à ce que tout le tissu racinaire soit libéré de l'agar.
- Transférer au sol juste au-dessus du 1er nœud des racines et emballer légèrement le sol autour de la greffe. Arrosez doucement pour assurer le contact du sol avec le système racinaire.
- Placer dans une chambre de croissance avec une lumière de 16 h (140 'mol 'm-2's-1)/8 h photopériode sombre et 25/20 degrés Celsius de jour/nuit.
REMARQUE : Les plantes sont prêtes lorsque les deux feuilles les plus agrandies ont atteint la taille appropriée pour l'assidu.
- (Facultatif) Préparer des plants de pommes de terre cultivés dans des tubercules.
REMARQUE : Les plants de pommes de terre cultivés à partir de tubercules sont plus gros et plus robustes et peuvent être utiles si l'élevage des larves sur les plantes ou si l'alimentation larvaire de nuit est souhaitée.- Placer un tubercule de pomme de terre 6 en profondeur dans un pot de 10 contenant du mélange de sol complété par 10 ml d'engrais à libération lente granulés.
- Placer dans une chambre de croissance avec une lumière de 16 h (140 'mol 'm-2's-1)/8 h photopériode sombre et 25/20 degrés Celsius de jour/nuit de température. Les plantes sont prêtes à environ 30'u201240 jours de plantation de tubercules.
REMARQUE : N'utilisez pas de plantes qui ont commencé à fleurir.
2. Préparation des insectes pour l'alimentation
- Obtenir l'étape larvaire désirée de M. sexta.
REMARQUE : Les larves de cette étude ont été rémunées sur le régime artificiel par le 5ème instar20 et mises en scène par un individu expérimenté de l'insectaire interne. Les larves peuvent également être rémunées partiellement ou complètement sur les tissus végétaux. Les larves ne mangent pas immédiatement avant une mue et sont plus susceptibles de manger juste après la mue, de sorte que la mise en scène appropriée est importante21. - Transférer les larves dans un récipient de confinement approprié (p. ex., plat de culture tissulaire de 6, 12, 24 puits) selon la taille des larves. Il devrait y avoir une larve par puits dans le plat.
REMARQUE : Les larves peuvent afficher un comportement territorial ou cannibale sans source de nourriture et peuvent se blesser si elles sont logées ensemble. - (Facultatif) Les larves de fémin jusqu'à 2 h, car cela peut améliorer l'alimentation larvaire.
REMARQUE : Les larves doivent se siévrer dans un récipient de confinement entreposé dans la chambre de croissance pendant cette période.
3. Configuration des composants pour l'expérience d'infestation
REMARQUE : Voir le résumé schématique de la figure 1.
- Faites des modèles de placement pour chaque point de récolte.
REMARQUE: Il est utile de mettre en place 5 plateaux différents pour chaque point de temps de récolte. Cela permet d'organiser les échantillons et permet aux plats d'être déplacés plus efficacement comme un ensemble sans changer leur arrangement. Si des calculs en pourcentage des dommages sont effectués, cela est essentiel car les images avant et après l'infestation doivent être capturées à la même longueur focale.- Obtenir 5 plateaux robustes capables de tenir un ensemble de six plats Petri de taille appropriée et la ligne avec du papier blanc.
REMARQUE : La taille du plat Petri est basée sur la taille des feuilles choisie pour l'alimentation. La feuille doit s'insérer facilement dans le plat sans toucher les côtés. Par exemple, un plat de 60 mm x 15 mm convient aux feuilles jusqu'à 50 mm de longueur ou de largeur. - Tracer un ensemble de six cercles à l'aide du plat Petri de taille appropriée sur le papier dans chaque plateau. Étiquetez un ensemble de cercles « contrôle » A, B et C et l'autre « infesté » A, B et C. Étiquetez également chaque modèle de placement avec le temps de récolte approprié.
- Obtenir 5 plateaux robustes capables de tenir un ensemble de six plats Petri de taille appropriée et la ligne avec du papier blanc.
- (Facultatif) Configurez une caméra pour la capture d'images « avant l'infestation » et « après l'infestation ».
- Fixez une caméra sur un support à la longueur focale appropriée pour la capture d'image de tous les plats Petri dans le modèle de placement.
- Étiqueter les tubes de temps de récolte.
- Étiqueter un ensemble de tubes microcentrifuges de 30, 1,7 mL correspondant à chaque cercle dans le modèle de placement. Étiqueter les tubes pour identifier de façon appropriée la perturbation (contrôle/infesté), la lettre de réplication de la plante (A, B ou C) et le point de temps de récolte (nombre de minutes après la période d'infestation).
- Préparer les plats Petri choisis à l'étape 3.1.1.
- Placez un disque de papier filtre stérile dans chacun des 30 plats Petri de l'étape 3.1.1. Ajouter de l'eau stérile pour humidifier les disques; ne laissez pas l'excès d'eau s'enclenfiler dans le plat. Placez chaque plat dans chacun des six cercles dans chaque modèle de placement.
- Placez trois plants de pommes de terre à côté de chaque modèle de placement. Assurez-vous que les plantes ont tous le même âge et la même taille relative.
4. Effectuer l'infestation
REMARQUE : Un modèle de point de temps de récolte/placement est mis en place à la fois.
- Retirer les deux feuilles supérieures assorties de chaque plante avec des ciseaux stériles et placer une feuille dans le plat Petri de contrôle et une dans le plat Petri infesté pour chaque plante (A, B et C). Effectuez ce processus le plus rapidement possible.
- (Facultatif) Transférer le modèle de placement sur le support de la caméra pour capturer une image « avant l'infestation ».
- Transférer les larves dans chaque plat infesté à l'aide de forceps tactiles douces le plus rapidement possible. Définir la minuterie pour le temps d'infestation souhaité.
REMARQUE : La période pendant laquelle les larves consomment le tissu foliaire est le « temps d'infestation ». C'est quelque chose qui peut être déterminé empiriquement à l'aide de quelques feuilles/larves d'essai avant le début de l'infestation réelle. Le « temps d'infestation » choisi doit être uniforme pour toutes les feuilles infestées.
REMARQUE : Les larves doivent être manipulées avec soin par des forceps tactiles douces. 2ème à 4ème instar peut être saisi doucement par leur corne ou section médiane. - Observez l'alimentation pour vous assurer que toutes les larves mangent. Les larves doivent être ajoutées/enlevées en fonction du comportement alimentaire. Gardez les couvercles sur la vaisselle Petri autant que possible.
REMARQUE : Plusieurs larves peuvent être utilisées par feuille. - Retirer les larves des feuilles à la fin du temps d'infestation. Démarrer la minuterie pour le temps de récolte.
- (Facultatif) Transférer le modèle de placement sur le support de la caméra pour capturer l'image « après l'infestation ».
REMARQUE : Les six feuilles du modèle de placement sont récoltées au moment précis de la récolte.
5. Récolte des feuilles
- Transférer chaque feuille dans le tube étiqueté correspondant à la fin de chaque point de récolte et congeler immédiatement en laissant tomber le tube dans le liquide N2. Conserver les tissus végétaux récoltés à -80 oC jusqu'à l'isolement de l'ARN.
- Répétez les étapes 4-u20125.1 pour chaque point de récolte.
6. Traitement du tissu foliaire pour l'analyse de l'expression génique
- Broyer le tissu foliaire congelé en poudre à l'eau à l'eau.
- Isoler l'ARN total et le processus pour l'expression des gènes comme décrit précédemment22.
7. (facultatif) Estimation des dommages causés aux feuilles
- Estimer visuellement le pourcentage des dommages causés aux feuilles ou calculer la superficie des feuilles dans les images avant et après l'infestation.
- Mesurer la zone des feuilles à l'égard d'outils logiciels (p. ex. Phénophyte)23.
- À partir des mesures de la zone foliaire, calculez le pourcentage des dommages
% de dommages - [(zone de feuille avant la zone des feuilles après)/zone de la feuille avant] x 100.
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Representative Results
La consommation de feuilles définit le succès du protocole. Les larves saines et bien mises en scène devraient commencer à se nourrir immédiatement après le placement à la surface des feuilles et l'alimentation devrait se poursuivre de façon assez cohérente tout au long du temps d'infestation. Dans la vidéo 1, la larve au sommet commence à mâcher immédiatement après le placement et maintient un taux constant pendant l'alimentation. Ceci est particulièrement important si l'analyse des événements précoces d'expression génique après l'infestation. La larve au fond n'a consommé aucun matériau foliaire et est un exemple d'infestation infructueuse.
Les approximations visuelles pendant la consommation des feuilles sont surveillées pour s'assurer qu'il y a suffisamment de dommages. La quantité de matière foliaire consommée peut être calculée comme le pourcentage de dommages en utilisant des images de feuilles avant et après l'infestation. La figure 2 illustre les taux variables de consommation par différents stades de développement des larves de M. sexta sur différents types de plants de pommes de terre. Les feuilles de la figure 2A ont été détachées de plantes de culture tissulaire nodales vieilles de deux semaines. Toutes les feuilles de cette figure sont de la même taille, mais ont été soumises à une infestation par différents stades de larves pendant 5 min. Figure 2A: I-IV, Vidéo 2, Vidéo 3, Vidéo 4, et Vidéo 5 illustrent les différents taux de la consommation et les styles d'alimentation pour chaque stade larvaire d'une partie de l'infestation. Ceci est utile pour déterminer combien de dommages est possible en utilisant chaque combinaison de feuilles et de stade silaval et illustre la nature vorace des larves plus âgées. L'utilisation de larves 1ère instar n'est pas recommandée car leurs mandibules ne sont pas suffisamment développées pour produire des dommages dans la fenêtre d'infestation de 5 min. Il est important de noter que les feuilles plus jeunes et plus tendres dérivées de plantes cultivées en culture tissulaire sont souvent plus appétissantes pour les larves. Sur la base de ces résultats, les larves de 4e étoiles ont été choisies pour évaluer davantage les dommages causés aux feuilles par des plants de pommes de terre plus matures cultivés dans le sol. Les plantes cultivées de sol se rapprochent plus étroitement de celles acquises dans le champ. La figure 2B illustre l'étendue des dommages lorsque des larves 3e et 4e ont été appliquées sur des feuilles détachées des plants de pommes de terre cultivés dans le sol. Des plantes nodal propagées vieilles de deux semaines ont été transplantées dans le sol et cultivées pendant 3 semaines supplémentaires. Les feuilles endommagées des plantes cultivées dans le sol sont tombées en trois groupes; 15-20%, 20-30%, et 30-40%. Les trois feuilles de chaque groupe représentent les différents niveaux de dégâts pour chaque plage. Les feuilles des plantes plus matures cultivées dans le sol avaient besoin de plus de larves appliquées et d'un temps d'infestation plus long pour atteindre le même niveau de dommages observés dans les feuilles des plantes plus jeunes propagées par nodal. Ces résultats illustrent l'éventail des résultats possibles à partir de l'herbivorie réussie de différents types de plantes.
Une fois que l'herbivorie réussie est complète et que les dommages en pourcentage sont évalués, le tissu foliaire est évalué pour l'expression des gènes. Les résultats d'expression génique devraient indiquer une induction robuste ou une répression des transcriptions impliquées dans la réponse à l'infestation. La figure 3 illustre les profils d'expression génique de six facteurs de transcription C2H2 d'une expérience réussie d'herbivorie dans les feuilles détachées. C2H2 zinc doigt StZFP2 a été induit par M. sexta herbivore dans la pomme de terre dans les études végétales entières précédentes24. Bien que StZFP2 ait été induit par l'herbivorie dans l'effort de la feuille détachée, l'infestation n'était pas significative par rapport à l'effet du détachement lui-même. Cependant, deux autres homologs StZFP2, StZFP5 et StZFP7, ont été significativement induits à 40 et 80 min post herbivo par rapport aux contrôles détachés. StLOX3 et StMYC2 sont des gènes marqueurs induits par la blessure et l'herbivorie et indiquent la participation des voies de défense régulées par l'acide jasmonique. L'objectif de cette étude particulière était d'identifier les facteurs de transcription sensibles à l'infestation parmi un panel de gènes candidats. L'identification de deux facteurs de transcription de doigt de zinc C2H2 qui sont fortement sensibles à l'herbivorie de M. sexta soutient l'utilisation des feuilles détachées pour des essais d'infestation.
Figure 1 : Diagramme de flux pour le protocole d'infestation. Représentation schématique des étapes incluses dans le flux de travail expérimental de la section infestation du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dommages causés par les feuilles par les larves de M. sexta. (A) Pourcentage de dommages aux feuilles de culture tissulaire à chaque stade larvaire de plus de 5 min. Les chiffres romains I-IV se réfèrent à des vidéos 2-5 respectivement qui montrent chaque instar se nourrissant sur la feuille illustrée. (B) Gamme des dommages aux feuilles cultivées dans le sol par 4e instar plus de 20 min. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse de l'expression génique des feuilles. L'analyse quantitative en temps réel de réaction en chaîne de polymérase (RT-qPCR) des facteurs de transcription de doigt de zinc de C2H2 est montrée. Le niveau moyen de transcription est, 2'CT avec (CT ' CT du gène de test - CT du gène de contrôle exogène). Les feuilles de contrôle excisées dans (bleu) et les feuilles infestées excisées dans (rouge) sont montrées à chaque moment. Chaque valeur est la moyenne de trois répliques biologiques. ANOVA à trois voies a été menée sur les valeurs de ct. Des différences significatives dans les feuilles de contrôle au fil du temps sont indiquées avec des majuscules. Des différences significatives dans les feuilles infestées au fil du temps sont indiquées dans les lettres minuscules. Des différences significatives entre le contrôle et les feuilles infestées en même temps sont montrées avec un astérisque. Les valeurs de Pr et F étaient toutes inférieures à 0,001, à l'exception du traitement anticontrôle StZFP6 avec 0,0086. Les barres d'erreur représentent l'écart type. Les numéros d'adhésion NCBI sont: StLOX3-X96406.1, StZFP2- MK809525, StZFP4-CV500970.1, StZFP6-DN587601.1, StZFP7-DN590005.1. Spud DB numéros d'adhésion de lt;http://solanaceae.plantbiology.msu.edu -gt; sont StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT4000401444. Ce chiffre a été modifié à partir de22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1: Clip vidéo de l'alimentation larvaire. Deuxième instar M. sexta larves se nourrissant (en haut) et ne se nourrissant pas (en bas) sur une feuille de deux semaines de culture de tissu cultivée plante de pomme de terre. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2 : Figure 2Un clip vidéo (I) de l'alimentation larvaire. Deuxième larve instar M. sexta se nourrissant d'une feuille de deux semaines vieille culture de tissu plante de pomme de terre cultivée. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 3 : Figure 2Un clip vidéo (II) de l'alimentation larvaire. Troisième larve instar M. sexta se nourrissant d'une feuille de deux semaines vieille culture de tissu plante de pomme de terre cultivée. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 4 : Figure 2Un clip vidéo (III) de l'alimentation larvaire. Quatrième instar M. sexta larve se nourrissant d'une feuille de deux semaines vieille culture de tissu plante de pomme de terre cultivée. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 5 : Figure 2Un clip vidéo (IV) de l'alimentation larvaire. Cinquième instar M. sexta larve se nourrissant d'une feuille de deux semaines culture tissulaire cultivé plante de pomme de terre. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
L'utilisation de méthodes d'herbivorie végétale s'enclenchent ensemble n'est pas nécessaire pour atteindre l'objectif de cette étude particulière (c.-à-d. examiner un ensemble de gènes candidats pour leur réponse à l'infestation). L'avantage évident du raffinement détaché de feuille est de raccourcir le temps qu'il prend pour effectuer des essais d'herbivorie. La nature lourde des plantes entières avec des cages à clip est éliminée et les essais sont effectués plus tôt, puisque des plantes aussi jeunes que 2 semaines peuvent être utilisées pour récolter les feuilles. Il exige également une empreinte beaucoup plus petite pendant l'alimentation et moins d'espace de chambre de croissance ; deux importants lorsque ces ressources sont limitées.
La limitation de cet test, à savoir le détachement, est rencontrée lorsque l'expression de la défense-gène est astoyée. Le détachement lui-même provoque une réponse de blessure et il est donc important d'évaluer quel effet le détachement a sur les niveaux basaux de l'expression de la défense-gène. Dans une étude portant sur l'herbivorie simulée, les niveaux de transcription d'un inhibiteur bien connu de la protéase du gène de défense II(PIN2) étaient étonnamment élevés dans les feuilles de contrôle des feuilles de pommes de terre détachées probablement en raison de « blessures causées lors de la collecte de la feuille » 25. Cependant, l'application du régurgitant d'insecte de M. sexta a considérablement augmenté des niveaux d'expression de gène de PIN2. Cela illustre la nécessité d'utiliser des contrôles pour démêler l'effet du détachement de la réponse à l'infestation.
Des essais de feuilles détachés sont souvent effectués pour gagner du temps, de l'espace et des ressources. Ils ont été utilisés dans le dépistage de la résistance aux maladies fongiques dans le blé26,27, et la résistance aux insectes dans le soja28 et pois chiches29. L'accusé est largement accepté dans l'étude de l'agent pathogène qui cause le mildiou dans la pomme de terre30,31. Une étude récente a révélé que les essais de feuilles détachées équivalaient à des essais de plantes entières pour déterminer la résistance au mildiou dans le champ32.
Peu de preuves existent dans la littérature, cependant, pour l'utilisation de feuilles détachées à l'analyse pour l'expression de la défense-gène. Une étude a dressé le profil de six gènes de défense en réponse à l'infestation d'acariens d'un haricot de Lima détaché33. Les feuilles ont également produit des volatiles qui ont induit des réponses de défense dans les feuilles non infestées voisines, une stratégie bien connue d'expression de défense-gène dans les usines34. À notre connaissance, aucune étude d'herbivore d'insecte de mastication à ce jour n'utilise des feuilles détachées pour essayer d'essayer pour l'expression de gène.
L'infestation précédemment définie sensible au zinc C2H2, StZFP2 n'a pas été significativement induite par l'infestation dans l'assay détaché courant de feuille. Mis à part la différence évidente entre les feuilles entières et les feuilles détachées, l'étude précédente a utilisé un type continu d'infestation dans lequel le tissu végétal a été évalué pour l'expression des gènes immédiatement après l'enlèvement des larves24. Ceci est différent du type d'infestation discontinue utilisé dans la présente étude, où l'enlèvement des larvaires a été suivi d'une période de repos avant la récolte des feuilles. Pendant cette période de récupération, les niveaux de StZFP2 diminuent rapidement et peuvent entraîner un niveau inférieur d'induction StZFP2. Il pourrait également y avoir d'autres composants de signalisation systémique jusqu'ici indéfinis qui peuvent contribuer à l'induction augmentée observée dans l'étude de la plante entière. Une autre possibilité est que les transcriptions StZFP2 auraient pu culminer avant le temps de récolte de 20 minutes. Il est clair, cependant, que l'intronisation impressionnante des transcriptions StZFP5 et StZFP7 rend ce type de protocole d'infestation pertinent. Une autre limite de la méthode actuelle serait l'incapacité d'utiliser des larves d'alimentation des racines comme le ver racine du maïs. Il ne serait pas non plus approprié lorsque la communication végétale entière telle que la signalisation racine à feuille35 ou la signalisation des feuilles systémiques36,37 est à l'étude.
Le succès de ce protocole dépend fortement de la qualité et de la précision de la mise en scène de la larve utilisée dans l'expérience. Les compétences d'élevage et les connaissances de base du comportement de M. sexta sont utiles, mais pas critique. Cependant, l'obtention de larves saines et bien mises en scène peut avoir une incidence directe sur le succès de l'alimentation. Les larves entrent dans une période quiescente qui précède chaque mue larvaire au cours de laquelle elles ne se nourrissent pas21. De toute évidence, ces larves n'endommageront pas les tissus foliaires. Le moment idéal pour utiliser les larves est juste après une mue. Une cohorte d'insectes par étapes de développement d'un stade larvaire particulier améliorera également la reproductibilité de l'expression génique, car les plantes peuvent réagir différemment à chaque stade de développement.
L'accès à un insecte serait idéal pour l'approvisionnement en larves. Les œufs ou larves de M. sexta peuvent également être commandés à partir de sources commerciales38,39 et été rémunères sur le régime alimentaire ou le matériel végétal au stade approprié. Il existe également plusieurs outils en ligne qui peuvent aider à identifier chaque instar40,41,42. Les larves rémunées au régime ne contiendront pas de composants spécifiques aux plantes, comme les symbiotes microbiens acquis par les larves rémunées sur les plantes43. Les profils d'expression génique peuvent être modifiés si ces composants sont manquants. Les larves peuvent être partiellement ou complètement rémunées sur leur plante hôte si ces effets sont importants pour l'étude. Le fait de retenir les aliments des insectes quelques heures avant les expériences d'alimentation peut également améliorer le comportement alimentaire. Les larves recueillies sur le terrain pourraient également être robustes et avantageuses puisqu'elles ont été exposées à des niveaux trophiques appropriés, mais cela ajoute une autre variable qui peut ou non convenir à toutes les études.
La production de plantes saines, exemptes d'insectes et de pesticides est également essentielle. Les plantes qui présentent des virus, des insectes nuisibles et des organismes fongiques introduisent des facteurs de confusion et présentent un défi dans l'obtention de données reproductibles.
De nombreuses instars larvaires, les âges des plantes de pommes de terre et la taille des feuilles peuvent être combinés pour personnaliser le protocole pour un type spécifique d'étude. La durée de l'infestation et les temps de récolte peuvent également être ajustés. Potentiellement, de nombreuses autres interactions plantes-insectes pourraient être étudiées à l'aide de feuilles détachées si des observations de plantes entières sont utilisées comme référence. L'analyse des feuilles détachées est une alternative pertinente et précieuse aux études entières d'herbivorie végétale pour analyser l'expression des gènes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tenons à remercier Bob Farrar et Alexis Park d'avoir fourni des insectes utilisés dans cette étude et de leur expertise dans la mise en scène larvaire. Merci également à Michael Blackburn et Saikat Ghosh pour l'examen critique du manuscrit.
La mention des noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cette publication vise uniquement à fournir des renseignements précis et n'implique pas de recommandation ou d'approbation par le ministère de l'Agriculture des États-Unis.
L'USDA est un fournisseur et un employeur de l'égalité des chances.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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