Summary
Den præsenterede metode skaber naturlige planteædende beskadigede plante vævet gennem anvendelse af manduca Sexta larver til fritliggende blade af kartoffel. Planten væv er analyseret for udtryk for seks transkriptionsfaktor homologer involveret i tidlige reaktioner på insekt herbivory.
Abstract
Den multitrofiske natur af genekspression undersøgelser af insekt æderne kræver et stort antal biologiske replikater, hvilket skaber behovet for enklere, mere strømlinede æderne protokoller. Perturbationer af gnavende insekter undersøgt normalt i hele plantesystemer. Mens hele denne organisme strategi er populær, er det ikke nødvendigt, hvis lignende observationer kan replikeres i en enkelt fritliggende blad. Forudsætningen er, at de grundlæggende elementer, der kræves for signaltransduktion, er til stede i selve bladet. I tilfælde af tidlige begivenheder i signaltransduktion, behøver cellerne kun at modtage signalet fra perturbationen og sende signalet til tilstødende celler, som er analyseret for genekspression.
Den foreslåede metode blot ændrer timing af løsrivelse. I hele planten eksperimenter, larver er begrænset til et enkelt blad, som i sidste ende løsrevet fra planten og analyseret for genekspression. Hvis rækkefølgen af excision er vendt, fra sidste i hele planten undersøgelser, at først i den fritliggende undersøgelse, fodring eksperiment forenkles.
Solanum tuberosum var. Kennebec er formeret ved knude overførsel i et simpelt vævskultur medium og overføres til jord for yderligere vækst, hvis det ønskes. Bladene er fjernet fra moderplanten og flyttet til Petri skåle, hvor foder analysen udføres med larvestadierne i M. Sexta. Beskadiget blad væv er analyseret for ekspression af relativt tidlige begivenheder i signaltransduktion. Genekspression analyse identificerede infestation-specifikke Cys2-His2 (C2H2) transkriptionsfaktorer, bekræfter succesen med at bruge fritliggende blade i tidlig respons undersøgelser. Metoden er lettere at udføre end hele planten angreb og bruger mindre plads.
Introduction
Herbivory sætter i gang en række molekylære begivenheder, hvor en plante kan både identificere angrebet og montere en passende respons for dens overlevelse. Et anlæg modtager to grundlæggende signaler fra gnavende insekter; en fra den fysiske beskadigelse af vævet og den anden fra insekt-specifikke stoffer. Skade-associerede molekylære mønstre (DAMPs) frigives som reaktion på skader skabt af larve munddele og udløse en veldefineret sårrespons, der resulterer i en stigning i hormonet jasmoninsyre og transkriptionen af forsvars gener1. En af de mest kendte damps er systemIn, et polypeptid, der dannes ved kavalergang af de større prosystemin protein efter et blad er såret2,3. Den jasmoninsyre sårrespons er yderligere moduleret af herbivore-associerede molekylære mønstre (HAMPs), som kan udledes af Caterpillar spyt, tarmindhold (regurgitant) og afføring (Frass)4. Insekter bruger disse stoffer til enten at øge eller unddrage sig forsvaret svar5. Transkriptionsfaktorer derefter viderebringe budskabet fra hormon signaler i forsvaret svar via regulering af downstream Defense gener6,7,8.
Nogle plante-insekt interaktion undersøgelser, der anvendes i laboratorie-indstillinger er af simuleret type, med et mål om at tilnærme den naturlige metode til fodring af insektet. Simuleret æderne opnås normalt ved at skabe kunstige skader på plantevæv med forskellige værktøjer, der efterligner den specifikke mekanisme af insekt munddele tilstrækkelig til at forårsage frigivelse af damps og udløse produktionen af forsvars gener. Andre insekt-specifikke komponenter såsom orale sekreter eller regurgitant tilsættes ofte for at replikere bidraget fra hamps9,10,11. Skabelsen af en specifik størrelse og type af sår og anvendelsen af nøjagtige mængder af HAMPs er en fordel for disse typer af undersøgelser og kan tilbyde mere reproducerbare resultater. Naturlige æderne undersøgelser, hvor skader på plantevæv opnås ved anvendelse af felt-erhvervet eller laboratorium-opdrættet insekter, er ofte mere udfordrende, fordi sårstørrelse og hamp beløb styres af insekt adfærd og tilføje variation til Data. De naturlige versus simulerede metoder og deres fordele og ulemper er godt debatteret i litteraturen12,13,14.
For at studere tidlige signalerings hændelser, såsom transkriptionsfaktorer, skal en vis procentdel af bladet indtages i relativt kort tid, så larverne skal begynde at tygge straks og opretholde forbruget, indtil bladet er frosset til analyse. M. Sexta er en glubende feeder på flere natskygge-planter i mange af sine larvestadier, hvilket gør den ideel til at give maksimal skade på relativt kort tid15. Dette er praktisk, når man studerer tidlige signalerings hændelser, da anlæggets respons forekommer næsten umiddelbart efter et insekt kontakter blad overfladen16,17. Den almindeligt anvendte Clip Cage metode til indeslutning viser klodset, da flere bure ville kræve løbende justeringer i hele eksperimentet for at muliggøre fjernelse eller tilsætning af larver. Bladene skal også være store nok og stærke nok til at støtte flere insekter fodring på samme tid. Disse typer af kartoffelplanter kræver en stor mængde plads til at observere fodring. Larverne vil ofte flytte til undersiden af blad overfladen, hvilket også gør fodring observationer ganske vanskeligt. Det er helt klart besværligt at bruge hele planter til at udføre disse eksperimenter.
Den nuværende undersøgelse bruger fritliggende blade isoleret i Petri skåle snarere end hele planter til at strømline og forenkle hele planten tilgang til at studere herbivory. Anvendelsen af protokollen i denne undersøgelse er begrænset til observation af en gruppe af C2H2 transkriptionsfaktorer induceret tidligt i kartoffel blade efter planteædende skader af M. Sexta larvae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: følgende protokol er beregnet til én person til at oprette, foretage observationer og indsamle prøver. Flere kørsler af samme opsætning kan kombineres for at øge biologisk replikering. Eventuelle yderligere gentagelser af forsøget bør oprettes på samme tidspunkt af dagen for at eliminere mulige døgn påvirkninger på genekspression. Protokollen er designet til at skabe 3 ' angrebne ' blade til 5 separate høst tidspunkter. Matchede kontrol blade for hvert tidspunkt skaber i alt 30 prøver. Eksperimentet kan udføres med en række forskellige blad størrelser og larvestadier, men det anbefales, at blad størrelse, larve Stage og infestationstid er konsistente under hele proceduren.
1. fremstilling af kartoffel planterne
Bemærk: alle trin, der kræver steril teknik, skal udføres i en vævskultur hætte18,19.
- Forbered Kennebec plantlets fra explant source.
- Forbered formerings medium.
- Tilsæt 4,43 g Murashige og Skoog (MS) med vitamin pulver, 20 g saccharose og 2 g agar erstatning til 1 L omvendt osmose (RO)-renset vand i en 2 L kolbe med en spin bar. Overfør kolben til en røre plade og bland. Justér pH til 5,8 ved hjælp af NaOH, mens du fortsætter med at røre.
Bemærk: agar vil ikke opløses før autoklave. - Tilsæt 1 mL konserveringsmiddel/biocid og autoklave på væske cyklussen i 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Fjern medium fra autoklave umiddelbart efter cyklussen er færdig og afkøles til 50 °C. Overfør 100 mL steril og afkølet formerings medium til sterile kultur beholdere (f. eks. magenta eller Plantcon) ved hjælp af steril teknik i en vævskultur hætte.
- Tilsæt 4,43 g Murashige og Skoog (MS) med vitamin pulver, 20 g saccharose og 2 g agar erstatning til 1 L omvendt osmose (RO)-renset vand i en 2 L kolbe med en spin bar. Overfør kolben til en røre plade og bland. Justér pH til 5,8 ved hjælp af NaOH, mens du fortsætter med at røre.
- Forbered forklarende materiale.
- Få forklarings kilde som Kennebec læggekartofler og fjerne alle spor af jord ved vask med TAP H2O. Fjern spirer og skær i 2 cm stykker med en steril skalpel.
- Sterilisere spire stykker ved iblødsætning for 15 s i 70% ethanol, efterfulgt af 13 min i 1:1 blegemiddel (1 del RO-vand: 1 del koncentreret bakteriedræbende/kommerciel kvalitet blegemiddel). Skyl 5 gange i steril H2O.
- Overfør forklarings materiale til sterile vævskultur beholdere med formerings medium i en vævskultur hætte ved hjælp af steril teknik. Overfør fartøjer til et plantevævs kultur kammer og vokse i 2 \ u20123 uger eller indtil plantlets form ved 24 °C, 16 h lys (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mørk fotoperiode.
- Forbered formerings medium.
- Forbered nodal-formeret vævskultur kartoffelplanter.
- Forbered knude Transfer medium.
Bemærk: Dette vil gøre 10 vævskultur beholdere, som kan anvendes samme dag eller kan være fremstillet før tid og opbevares ved 4 °c indtil knude overførsel.- Tilsæt 36,43 g næringsstof agar mix til 1 liter RO-renset vand i en 2 L kolbe med en spin stang. Overfør kolben til en røre plade og bland. Justér pH til 5,8 ved hjælp af KOH, mens du fortsætter med at røre.
Bemærk: agar vil ikke opløses før autoklave. - Autoklave på væske cyklussen i 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Fjern medium fra autoklave umiddelbart efter cyklussen er færdig og afkøles til 50 °C. Overfør 100 ml steril afkølet knude Transfer medium til sterile kultur beholdere (Se tabellen over materialer) ved hjælp af steril teknik i en vævskultur hætte.
- Tilsæt 36,43 g næringsstof agar mix til 1 liter RO-renset vand i en 2 L kolbe med en spin stang. Overfør kolben til en røre plade og bland. Justér pH til 5,8 ved hjælp af KOH, mens du fortsætter med at røre.
- Forbered knude stiklinger.
- Få Kennebec plantlets dyrket fra forklarende materiale (produceret i trin 1.1.2). Plantlets skal have mindst 3 til 4 noder (forgrenings punkter). Fjern blade ved hjælp af steril saks eller skalpel. Skær grene tæt på hovedstammen, forlader omkring 2 mm gren væv.
- Fjern knude sektioner fra stammen ved at skære ca. 2 mm over og under hvert forgrenings punkt eller node. Arranger knude-stiklinger i et sterilt vævskultur fartøj, der indeholder knude Transfer medium (fremstillet i trin 1.2.1.2) i samme retning som i det foregående fartøj (gren opad).
- Overfør fartøjer med knude stiklinger til et plantevævs kultur kammer og vokse i 2 \ u20123 uger ved 24 °c, 16 h lys (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mørk fotoperiode.
Bemærk: hver knude skæring vil vokse til en ny plantlet. Antallet af stiklinger i hvert fartøj bestemmer blad størrelse. Færre stiklinger overført pr. fartøj vil resultere i større blade. Tre planter pr. fartøj vil have 15 mm x 20 mm blade i 2 \ u20123 uger.
- Forbered knude Transfer medium.
- Valgfri Forbered jord dyrket Kennebec kartoffelplanter.
Bemærk: for at producere større blade kan knude opformeret kartoffel planteter overføres til jord.- Overfør kartoffel planteter dyrket i knude Transfer medium til jord ved forsigtigt at trække planten fra mediet, indtil alle rodvævet er frigivet fra agar.
- Overfør til jord lige over 1st node fra rødderne og let pakke jorden omkring transplantationen. Vand forsigtigt for at sikre jordkontakt med rodsystemet.
- Placer i et vækstkammer med 16 h lys (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mørk fotoperiode og 25/20 °c dag/nat temperaturer.
Bemærk: planterne er klar, når de øverste to fuldt ekspanderede blade har nået den størrelse, der passer til analysen.
- Valgfri Forbered knold-dyrkede kartoffelplanter.
Bemærk: kartoffelplanter, der dyrkes fra knolde, er større og mere robuste og kan være nyttige, hvis der opdrættes larver på planter, eller hvis det er ønskeligt at fodre med larve.- Placer en kartoffel knold 6 i dyb i en 10 i pot indeholdende jordblanding suppleret med 10 ml foderpiller langsom frigivelse gødning.
- Placer i et vækstkammer med 16 h lys (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mørk fotoperiode og 25/20 °c dag/nat temperatur. Planterne er klar ca. 30 \ u201240 dage fra knold plantning.
Bemærk: Brug ikke planter, der er begyndt at blomstre.
2. fremstilling af insekter til fodring
- Opnå den ønskede larve fase af M. Sexta.
Bemærk: larverne til denne undersøgelse blev opdrættet på kunstig kost gennem den 5. INSTAR20 og iscenesat af en erfaren person fra in-House insectary. Larverne kan også opdrættes helt eller delvist på plante vævet. Larver spiser ikke umiddelbart før en molt og er mest tilbøjelige til at spiselige efter Molt, så passende iscenesættelse er vigtigt21. - Larverne overføres til et passende indeslutnings fartøj (f. eks. 6-, 12-, 24-brønd vævs kulturfad) afhængigt af larve tørrelse. Der bør være en larve per brønd i skålen.
Bemærk: larverne kan udvise territorial eller kannibalistisk opførsel uden en fødekilde og kan blive såret, hvis de huses sammen. - Valgfri I op til 2 timer, da dette kan forbedre larve fodring.
Bemærk: larverne skal være i et indeslutnings fartøj, der opbevares i vækst kammeret i denne periode.
3. opsætning af komponenter til angreb-eksperimentet
Bemærk: Se skematisk oversigt i figur 1.
- Lav placeringsskabeloner for hvert høsttidspunkt.
Bemærk: det er nyttigt at opsætte 5 forskellige bakker for hvert høsttidspunkt. Dette holder prøverne organiseret og gør det muligt for retterne at blive flyttet rundt mere effektivt som et sæt uden at ændre deres arrangement. Hvis beregningerne i procent af skaderne vil blive udført, er dette vigtigt, da billeder før og efter infestation skal optages på samme brændvidde.- Få 5 robuste bakker, der kan holde et sæt af seks passende størrelse Petri skåle og line med hvidt papir.
Bemærk: størrelsen af Petri skålen er baseret på den blad størrelse, der er valgt til foder analysen. Bladet skal passe let i skålen uden at røre siderne. For eksempel, en 60 mm x 15 mm skål er egnet til blade op til 50 mm i længde eller bredde. - Spor et sæt af seks cirkler ved hjælp af den passende størrelse Petri skål på papiret i hver bakke. Mærk et sæt af cirkler ' Control ' A, B og C og den anden ' angrebne ' A, B, og C. Du bør også mærke hver placeringsskabelon med den relevante høsttid.
- Få 5 robuste bakker, der kan holde et sæt af seks passende størrelse Petri skåle og line med hvidt papir.
- Valgfri Indstil et kamera til billedoptagelse ' før infestation ' og ' After infestation '.
- Fastgør et kamera på en stander i den relevante brændvidde for billedoptagelse af alle Petri skåle i placeringsskabelonen.
- Mærk høst tidspunkt rørene.
- Mærk et sæt på 30, 1,7 mL mikrocentrifuge glas svarende til hver cirkel i placeringsskabelonen. Mærk rørene for på passende vis at identificere perturbationen (kontrol/inficeret), plantens replikeringsbogstav (A, B eller C) og høsttidspunktet (antal minutter efter infestationsperioden).
- Forbered Petri skåle valgt i trin 3.1.1.
- Anbring en steril filtrerpapir skive i hver af de 30 Petri skåle fra trin 3.1.1. Tilsæt sterilt vand for at fugte diskene; Lad ikke overskydende vand til at pool i skålen. Placer hver skål i hver af de seks cirkler i hver placeringsskabelon.
- Placer tre kartoffelplanter ved siden af hver placeringsskabelon. Sørg for, at planterne har samme alder og relative størrelse.
4. udførelse af angreb
Bemærk: en høst tidspunkt/placeringsskabelon er sat op ad gangen.
- Fjern de øverste to størrelses matchede blade fra hver plante med steril saks, og Placer et blad i kontrol Petri skålen og et i den angrebne petriskål for hvert anlæg (A, B og C). Gennemføre denne proces så hurtigt som muligt.
- Valgfri Overfør placeringsskabelonen til kameraets stander for at tage et billede af ' Before infestation '.
- Overfør Larverne til hver inficeret skål med bløde berørings pincet så hurtigt som muligt. Indstil timeren for den ønskede ' infestation ' tid.
Bemærk: den periode, hvor larverne indtager blad vævet, er "infestationstid". Dette er noget, der kan bestemmes empirisk ved hjælp af et par test blade/larver før starten af den egentlige infestation. Den valgte» infestationstid «bør være konsistent for alle angrebne blade.
Bemærk: larverne skal håndteres med forsigtighed ved hjælp af soft touch-tang. 2. til 4. INSTAR kan blive grebet forsigtigt af deres horn eller midtersektion. - Overhold fodring for at sikre, at alle larver spiser. Larver bør tilsættes/fjernes baseret på fodring adfærd. Opbevar låg på Petri skålene så meget som muligt.
Bemærk: der kan anvendes flere larver pr. blad. - Fjern larverne fra bladene ved slutningen af infestationstid. Start timeren for høsttiden.
- Valgfri Overfør placeringsskabelonen til kameraets stander for at tage billedet "efter infestation".
Bemærk: alle seks blade i placeringsskabelonen høstes på den specifikke høst tid.
5. høst blade
- Overføre hvert blad til det tilsvarende mærkede rør ved slutningen af hver høst tidspunkt og straks fryse ved at droppe røret i flydende N2. Opbevar det høstede plantevæv ved-80 °C indtil isolationen af RNA.
- Gentag trin 4 \ u 20125.1 for hvert høsttidspunkt.
6. behandling af blad vævet til analyse af genekspression
- Grind det frosne blad vævet til et pulver med en mikropestle.
- Isoler total RNA og processen for genekspression som tidligere beskrevet22.
7. (valgfrit) vurdering af blad skader
- Visuelt anslå procent af blad skader eller Beregn Leaf område i før-og efter-infestation billeder.
- Mål blad området med softwareværktøjer (f. eks. Phenophyte)23.
- Fra målinger af bladareal, Beregn procentdel af skaderne som
% skade = [(blad område før-blad område efter)/blad område før] x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blad forbrug definerer protokollens succes. Sunde, præcist iscenesat larver bør begynde fodring umiddelbart efter placering på blad overfladen og fodring bør fortsætte på en temmelig konsekvent måde i hele infestationstid. I video 1begynder Larven i toppen at tygge umiddelbart efter placering og opretholder en konsekvent hastighed under fodring. Dette er især vigtigt, hvis bestemmelse tidlige genekspression begivenheder efter infestation. Larven i bunden ikke forbruge noget blad materiale og er et eksempel på en mislykket infestation.
Visuelle tilnærninger under bladets forbrug overvåges for at sikre, at der produceres tilstrækkelig skade. Mængden af blade materiale forbruges kan beregnes som den procentdel af skaden ved hjælp af billeder af blade før og efter infestation. Figur 2 illustrerer de variable forbrugsrater i forskellige udviklingsmæssige stadier af M. Sexta larverne på forskellige typer kartoffelplanter. Bladene i figur 2a blev udskillet fra 2-ugers-gamle nodal-formeret vævskultur planter. Alle bladene i denne figur er af samme størrelse, men blev udsat for angreb af forskellige stadier af larverne i 5 min. figur 2a: i-IV, video 2, video 3, video 4og video 5 illustrerer de forskellige grader af forbrug og fodring stilarter for hver larve fase fra en del af infestation. Dette er nyttigt til at bestemme, hvor meget skade er muligt ved hjælp af hver blad og larve scenen kombination og illustrerer den glubende natur af de ældre larver. Brugen af 1. INSTAR larver anbefales ikke, da deres mandibler ikke er udviklet nok til at producere skader i 5 min angreb vindue. Det er vigtigt at bemærke, at yngre mere møre blade afledt af væv-kultur-dyrkede planter er ofte mere spiselig for larver. Baseret på disse resultater, 4 th INSTAR larver blev valgt til yderligere at vurdere skader på blade fra mere modne, jord dyrkede kartoffelplanter. Jorden dyrkes planter tættere tilnærmelsesvis de erhvervede i marken. Figur 2b illustrerer omfanget af skader, når 3rd og 4th INSTAR larver blev anvendt til blade løsrevet fra jord dyrkede kartoffelplanter. To-ugers-gamle knude opformeret planter blev transplanteret til jord og dyrkes i yderligere 3 uger. Beskadigede blade fra jord dyrkede planter faldt i tre grupper; 15-20%, 20-30% og 30-40%. De tre blade i hver gruppe er vist til at repræsentere de forskellige niveauer af skader for hvert område. Bladene fra mere modne jord dyrkede planter havde brug for mere larver anvendt og en længere angreb tid til at nå det samme niveau af skader observeret i bladene fra yngre nodal-formeret planter. Disse resultater illustrerer de mulige resultater fra vellykket æderne fra forskellige typer planter.
Efter vellykket æderne er komplet og procent skade vurderes, blad vævet er analyseret for genekspression. Resultaterne af genekspression bør indikere en robust induktion eller undertrykkelse af udskrifter, der er involveret i reaktionen på infestation. Figur 3 illustrerer genekspressions profilerne for seks C2H2 transkriptionsfaktorer fra et vellykket æderne-eksperiment i løsrevne blade. C2H2 zink finger StZFP2 blev induceret af M. Sexta æderne i kartoffel i tidligere hele planten undersøgelser24. Selv om StZFP2 blev induceret af æderne i den udskilne blad assay, angreb var ikke signifikant i forhold til effekten af selve løsrivelse. Men, to andre StZFP2 homologer, StZFP5 og StZFP7, blev signifikant induceret på 40 og 80 min post æderne sammenlignet med fritliggende kontroller. StLOX3 og StMYC2 er markørgener induceret af både såret og æderne og angive inddragelsen af jasmonic Acid regulerede forsvars veje. Målet med denne særlige undersøgelse var at identificere infestation-Responsive transkriptionsfaktorer blandt et panel af kandidat gener. Identifikationen af to C2H2 zink finger transkriptionsfaktorer, der er robust lydhør over for M. Sexta æderne understøtter brugen af fritliggende blade til angreb assays.
Figur 1: rutediagram for angreb Protocol. Skematisk gengivelse af de trin, der er inkluderet i den eksperimentelle arbejdsgang i afsnittet angreb i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: blad skader forårsaget af M. Sexta larvae. (A) procentvise skader på vævskultur blade i hvert larve stadie over 5 min. romertal I-IV refererer til videoer 2-5 henholdsvis, der viser hver INSTAR fodring på bladet afbilledet. (B) rækkevidde af skader på jord-dyrket blade af 4th INSTAR over 20 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af genekspression af blade. Real-time kvantitativ polymerase kædereaktion (RT-qPCR) Gen ekspression analyse af C2H2 zink finger transkriptionsfaktorer er vist. Gennemsnitligt transskriptniveau er, 2− δct med (δct = CT af test-gen-CT af eksogene kontrol-gen). De fjernede kontrol blade i (blå) og de opskåret, angrebne blade i (rød) vises på hvert tidspunkt. Hver værdi er gennemsnittet af tre biologiske replikater. Tre-vejs ANOVA blev udført på ΔCt-værdierne. Betydelige forskelle i kontrol bladene over tid er angivet med store bogstaver. Signifikante forskelle i angrebne blade over tid er angivet med små bogstaver. Signifikante forskelle mellem kontrol og angrebne blade på samme tidspunkt er vist med en asterisk (*). Pr > F-værdier var alle mindre end 0,001, bortset fra StZFP6 kontrol behandling med 0,0086. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. NCBI-tiltrædelses numre er: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. Spud DB tiltrædelses numre fra < http://Solanaceae.plantbiology.msu.edu > er StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. Dette tal er blevet ændret fra22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: videoklip af larve fodring. Anden INSTAR M. Sexta larver fodring (top) og ikke fodring (bund) på et blad fra to uger gamle vævskultur dyrket kartoffel plante. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 2: figur 2a videoklip (i) af larve fodring. Anden INSTAR M. Sexta larve fodring på et blad fra to uger gamle vævskultur dyrket kartoffel plante. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 3: figur 2a videoklip (II) af larve fodring. Tredje INSTAR M. Sexta larve fodring på et blad fra to uger gamle vævskultur dyrket kartoffel plante. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 4: figur 2a videoklip (III) af larve fodring. Fjerde INSTAR M. Sexta larve fodring på et blad fra to uger gamle vævskultur dyrket kartoffel plante. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 5: figur 2a videoklip (IV) af larve fodring. Femte INSTAR M. Sexta larve fodring på et blad fra to uger gamle vævskultur dyrket kartoffel plante. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er unødvendigt at anvende eksisterende plantebeskyttelsesmetoder for hele planten for at nå målet med denne særlige undersøgelse (dvs. screene et sæt kandidat gener for deres reaktion på infestation). Den indlysende fordel ved den fritliggende blad raffinement er afkortning den tid, det tager at udføre æderne assays. Den tunge natur af hele planter med Clip bure elimineres og assays udføres hurtigere, da planter så unge som 2 uger kan bruges til at høste blade. Det kræver også en meget mindre fodaftryk under fodring og mindre vækstkammer plads; begge vigtige, når disse ressourcer er begrænsede.
Begrænsningen af denne analyse, nemlig løsrivelse, opstår, når forsvaret-genekspression er analyseret. Løsrivelse selv forårsager et sårrespons, og det er derfor vigtigt at vurdere, hvilken effekt udstationering har på basale niveauer af forsvar-genekspression. I en undersøgelse, der involverer simuleret herbivory, transskription niveauer af en velkendt Defense gen proteasehæmmer II(PIN2) var uventet høj i kontrol bladene af fritliggende kartoffel blade sandsynligvis på grund af "sårede forårsaget under samlingen af bladet" 25. anvendelsen af insekt regurgitant fra M. Sexta har dog forbedret niveauet af PIN2 -genekspression betydeligt. Dette illustrerer behovet for at bruge kontrol til at drille ud effekten af løsrivelse fra angreb respons.
Fritliggende blad assays udføres ofte for at spare tid, plads og ressourcer. De er blevet anvendt til screening for resistens over for svampesygdomme i hvede26,27og insektresistens i sojabønner28 og kikærter29. Analysen er bredt accepteret i studiet af patogenet, der forårsager forsinket skamplet i kartoffel30,31. En nylig undersøgelse viste, at fritliggende blad analyser svarede til hele plante assays ved fastsættelsen af forsinket skamplet-resistens i marken32.
Scant beviser findes i litteraturen, men for brugen af fritliggende blade til assay for Defense-genekspression. En undersøgelse profilerede seks forsvars gener som reaktion på Spider mide angreb af fritliggende Lima Bean33. Bladene producerede også flygtige stoffer, der inducerede forsvarsreaktioner i nærliggende ikke-angrebne blade, en velkendt strategi for forsvar-genekspression i planter34. Til vores viden, ingen tygge insekt æderne undersøgelser til dato udnytte fritliggende blade til assay for genekspression.
Den tidligere definerede angreb lydhør C2H2 zink finger, StZFP2 var ikke signifikant induceret af angreb i den nuværende fritliggende blad assay. Bortset fra den indlysende forskel på hele planten versus fritliggende blade, udnyttede den tidligere undersøgelse en kontinuerlig type angreb, hvor plante vævet blev analyseret for genekspression umiddelbart efter fjernelsen af larverne24. Dette er forskelligt fra den diskontinuerlig type angreb udnyttet i den nuværende undersøgelse, hvor larve fjernelse blev efterfulgt af en hvileperiode før blad høst. I denne restitutionsperiode falder StZFP2 niveauer hurtigt og kan resultere i et lavere niveau af StZFP2 induktion. Der kan også være andre så-langt udefineret systemisk signalerings komponenter, der kan bidrage til den forstørrede induktion observeret i hele planten undersøgelse. En anden mulighed er, at StZFP2 udskrifter kunne have toppet før 20 min høst tid. Det er imidlertid klart, at den imponerende induktion af StZFP5 og StZFP7 udskrifter gør denne type angreb protokol relevant. En anden begrænsning af den nuværende metode ville være den manglende evne til at bruge root fodring larver såsom majs rootworm. Det ville heller ikke være egnet, når hele anlægget kommunikation såsom rod til blad signalering35 eller signalering fra systemiske blade36,37 er ved at blive undersøgt.
Succesen med denne protokol afhænger i høj grad af kvaliteten og nøjagtig iscenesættelse af larve, der anvendes i forsøget. Opdræt færdigheder og grundlæggende kendskab til M. Sexta adfærd er nyttige, men ikke kritisk. Men at opnå sunde, passende iscenesat larver kan direkte påvirke fodring succes. Larver indtaste en lysende periode, der går forud for hver larve Molt, hvor de ikke fodre21. Det er klart, at sådanne larver ikke vil beskadige blad vævet. Den ideelle tid til at bruge larver er lige efter en molt. En udviklingsmæssigt iscenesat kohorte af insekter i et bestemt larve stadie vil også forbedre genekspressions reproducerbarhed, da planterne kan reagere forskelligt på de enkelte udviklingsstadier.
Adgangen til en insekt bekæmpende virksomhed ville være ideel til levering af larver. M. Sexta æg eller larver kan også bestilles fra kommercielle kilder38,39 og opdrættet på kost eller plantemateriale til det rette Stadium. Der er også flere online-værktøjer, der kan hjælpe med at identificere hver INSTAR40,41,42. Larver, som opdrættes på diæt, vil ikke indeholde plante specifikke bestanddele såsom mikrobielle symbionter erhvervet af larver, som opdrættes på planter43. Genekspressions profiler kan ændres, hvis disse komponenter mangler. Larverne kan helt eller delvis opdrættes på deres værts anlæg, hvis disse virkninger er vigtige for undersøgelsen. Tilbageholdelse af mad fra insekter et par timer før fodring eksperimenter kan også forbedre fodring adfærd. Felt indsamlede larver kan også være robuste og fordelagtige, da de har været udsat for passende trofiske niveauer, men det tilføjer en anden variabel, som måske eller ikke egner sig til alle undersøgelser.
Produktionen af sunde, insekt-og pesticid frie planter er også afgørende. Planter med vira, insekt skadedyr og svampe organismer vil introducere forstyrrende faktorer og udgøre en udfordring i at opnå reproducerbare data.
Mange larve instars, kartoffel plante aldre og blad størrelser kan kombineres for at tilpasse protokollen til en bestemt type undersøgelse. Længden af angreb og høst tider kan også justeres. Potentielt, mange andre plante-insekt interaktioner kunne undersøgt ved hjælp af fritliggende blade, hvis hele planten observationer anvendes som en baseline. Den fritliggende blad analyse er et relevant og værdifuldt alternativ til hele plante æderne undersøgelser for at analysere genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Bob Farrar og Alexis Park for at levere insekter, der anvendes i denne undersøgelse, og for deres ekspertise i larve iscenesættelse. Yderligere tak til Michael Blackburn og Saikat Ghosh for kritisk gennemgang af manuskriptet.
Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med henblik på at give specifikke oplysninger og ikke indebærer anbefaling eller godkendelse af det amerikanske landbrugsministerium.
USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
