Summary
该方法通过将曼杜卡性幼虫应用于马铃薯分离叶,创造出天然的草食性植物组织受损。植物组织被测定为六个转录因子同源的表达参与早期反应昆虫食草动物。
Abstract
昆虫食草动物基因表达研究的多营养性需要大量的生物复制,因此需要更简单、更简化的食草动物方案。咀嚼昆虫的扰动通常在整个植物系统中进行研究。虽然这整个有机体策略很受欢迎,但如果类似的观察结果可以在单个分离的叶子中复制,则没有必要。假设信号转导所需的基本元素存在于叶本身中。在信号转导的早期事件的情况下,细胞只需要从扰动接收信号,并将该信号传输到被测定为基因表达的相邻细胞。
建议的方法只是改变了分遣队的时间。在整个植物实验中,幼虫被限制在一片叶子中,最终从植物分离并进行基因表达的测定。如果切除的顺序颠倒,从整个植物研究的最后一个,到分离研究的第一个,喂养实验被简化。
索兰图管龙和葡萄球,Kennebec通过节点转移在简单的组织培养基中传播,并转移到土壤中,如果需要,进一步生长。叶子从母植物被切除,并转移到培养皿,在那里喂养测定进行与M.sexta的幼虫阶段。对受损的叶组织进行测定,以表达信号转导中相对早期的事件。基因表达分析确定了侵扰性特异性Cys2-His2(C2H2)转录因子,确认在早期反应研究中使用分离叶的成功。该方法比整个植物的侵扰更容易执行,并且使用更少的空间。
Introduction
Herbivory 启动一系列分子事件,在此期间,植物可以识别攻击并对其生存作出适当反应。植物从咀嚼昆虫中接收两个基本线索;一个来自对组织的物理损害,另一个来自昆虫特有的物质。损伤相关的分子模式 (DAMPs) 被释放,以响应由幼虫口腔部分造成的损伤,并触发一个明确的伤口反应,导致激素茉莉花酸的增加和防御基因1的转录。其中最著名的DamPs是系统蛋白,一种多肽,由较大的亲系统蛋白的裂解形成后,叶受伤2,3。茉莉花酸伤口反应进一步由草食相关分子模式(HAMPs)调节,可以从毛毛虫唾液、肠道内容物(胃肠)和粪便(frass)4中得出。昆虫使用这些物质来增强或逃避防御反应5。转录因子然后通过调节下游防御基因6,7,8在防御反应中传递来自激素信号的信息。
实验室设置中使用的一些植物-昆虫相互作用研究是模拟类型的,目的是接近昆虫的自然喂养方法。模拟食草动物通常是通过各种工具对植物组织造成人工损伤来实现的,这些工具模拟昆虫嘴部的特定机制,足以引起DAMPs的释放并触发防御基因的产生。其他昆虫特异性成分,如口服分泌物或回流剂,经常被添加来复制从HAMPs9,10,11的贡献。创建特定尺寸和类型的伤口以及应用精确数量的 HAMPs 是这些类型的研究的一个优势,并可提供更可重复的结果。自然草本动物研究,其中对植物组织的损害是通过应用田间获得或实验室饲养的昆虫来完成的,往往更具挑战性,因为伤口大小和HAMP量受昆虫行为控制,并增加了变化数据。自然与模拟方法及其优缺点在文献第12、13、14中得到了很好的争论。
为了研究早期信号事件,如转录因子,必须在相对短的时间内食用一定比例的叶子,因此幼虫必须立即开始咀嚼并保持食用,直到叶子被冷冻进行分析。M. sexta是多索拉动物植物的贪婪的喂食器,在其许多幼虫阶段,使它理想的在相对短的时间内给予最大的伤害15。这在研究早期信号事件时很方便,因为昆虫接触叶面16、17后,植物反应几乎立即发生。常用的夹笼围堵方法证明笨拙,因为多个笼子需要在整个实验过程中不断调整,以便去除或添加幼虫。叶子也必须足够大和足够强大,以支持多个昆虫同时觅食。这些类型的马铃薯植物需要大量的空间来观察喂养。幼虫经常搬迁到叶子表面的底面,这也使得喂食观察相当困难。使用整个工厂进行这些实验显然很麻烦。
目前的研究使用分离的叶子隔离在培养皿,而不是整个植物,以简化和简化整个植物方法,研究草本植物。本研究对该方案的应用仅限于观察M.性幼虫在草食性损伤后马铃薯叶早期诱发的一组C2H2转录因子。
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Protocol
注: 以下协议是为一个人设置、进行观察和收集样本而设计的。可以组合相同设置的多个运行,以增加生物复制。实验的任何额外重复都应在一天的同一时间进行,以消除对基因表达的可能日影响。该协议旨在为 5 个单独的收获时间点创建 3 个"受感染"的叶子。每个时间点的匹配控制叶总共创建 30 个样本。实验可以进行各种叶片大小和幼虫阶段,但建议叶的大小,幼虫阶段和侵扰时间在整个过程中保持一致。
1. 马铃薯植物的制备
注:所有需要无菌技术的步骤必须在组织培养罩18、19中执行。
- 从植物外源制备肯尼贝克植物。
- 准备传播介质。
- 在带旋转棒的 2 L 烧瓶中加入 4.43 克 Murashige 和 Skoog (MS) 维生素粉、20 克蔗糖和 2 克琼脂替代物至 1 L 反渗透 (RO) 纯化水中。将烧瓶转移到搅拌板并混合。使用 NaOH 将 pH 调节到 5.8,同时继续搅拌。
注:Agar不会溶解,直到高压灭。 - 在液体循环中加入1 mL的防腐剂/杀菌剂和高压灭菌液,使用20分钟(121°C,101.3 kPa)。循环结束后,立即从高压灭菌器中取出介质,并将其冷却至 50°C。在组织培养罩中使用无菌技术将100 mL的无菌和冷却繁殖介质转移到无菌培养容器(如品红色或植物体)。
- 在带旋转棒的 2 L 烧瓶中加入 4.43 克 Murashige 和 Skoog (MS) 维生素粉、20 克蔗糖和 2 克琼脂替代物至 1 L 反渗透 (RO) 纯化水中。将烧瓶转移到搅拌板并混合。使用 NaOH 将 pH 调节到 5.8,同时继续搅拌。
- 准备外植材料。
- 获得外植源作为Kennebec种子土豆,并通过洗涤用水龙头H2O去除芽和切成2厘米片与无菌手术刀去除土壤的所有痕迹。
- 在 70% 乙醇中浸泡 15 s,然后 1:1 漂白剂(1 部分 RO-水:1 部分浓缩杀菌/商用级漂白剂)对豆芽片进行消毒。在无菌 H2O 中冲洗 5 次。
- 使用无菌技术将脱外材料转移到无菌组织培养容器,在组织培养罩中使用繁殖培养基。将血管转移到植物组织培养室,生长2~u20123周,或直到植物在24°C、16小时光(140 μmolμm-2μs-1)/8 h暗光周期形成。
- 准备传播介质。
- 准备节点传播的组织培养马铃薯植物。
- 准备节点转移介质。
注:这将使10个组织培养容器,可以在同一天使用,或可以提前,并存储在4°C,直到节点转移。- 在带旋转棒的 2 L 烧瓶中加入 36.43 克营养琼脂混合物至 1 L RO 纯化水中。将烧瓶转移到搅拌板并混合。使用 KOH 将 pH 调节到 5.8,同时继续搅拌。
注:Agar不会溶解,直到高压灭。 - 液体循环高压灭菌20分钟(121°C,101.3 kPa)。循环结束后,立即从高压灭菌器中取出介质,并将其冷却至 50°C。在组织培养罩中使用无菌技术将100 mL的无菌冷却节点转移介质转移到无菌培养容器(见材料表)。
- 在带旋转棒的 2 L 烧瓶中加入 36.43 克营养琼脂混合物至 1 L RO 纯化水中。将烧瓶转移到搅拌板并混合。使用 KOH 将 pH 调节到 5.8,同时继续搅拌。
- 准备节点切割。
- 获得从外植材料(在步骤 1.1.2 中生产)生长的肯尼贝克植物。植物点应至少具有 3 到 4 个节点(分支点)。使用无菌剪刀或手术刀去除叶子。切下靠近主茎的树枝,留下约2毫米的分支组织。
- 通过在每个分支点或节点上方和下方切割约 2 mm,从茎上移除节点部分。将节点切割安排在含有节点转移介质的无菌组织培养容器中(在步骤 1.2.1.2 中生成),方向与前一个容器(向上的分支)相同。
- 将带有节点切口的容器转移到植物组织培养室,并在24°C、16 h光(140 μmolμm-2μs -1)/8 h暗光周期下生长2~u20123周。
注:每个节点切割将成长为一个新的植物。每艘船上的切屑数决定了叶片大小。每艘船转移的切口越少,叶子越大。每艘船三株植物在2~u20123周内将有15毫米×20毫米叶子。
- 准备节点转移介质。
- (可选)准备土壤种植肯尼贝克马铃薯植物。
注:为了生产更大的叶子,可向土壤中转移可繁殖的马铃薯小叶。- 将生长在节点上的马铃薯植物转移到土壤中,从培养基中轻轻拉出植物,直到所有根组织从琼脂中释放出来。
- 从根部转移到第一个节点正上方的土壤,并轻轻地将土壤包在移植周围。轻轻浇水,确保土壤与根系接触。
- 放置在生长室与16小时光(140 μmolμm-2μs-1)/8小时暗光周期和25/20°C日/夜温度。
注:当前两个完全膨胀的叶子达到适合测定的尺寸时,植物已经准备就绪。
- (可选)准备块茎种植的马铃薯植物。
注:从块茎生长的马铃薯植物更大、更健壮,如果需要饲养植物幼虫或需要过夜幼虫喂养,则马铃薯植物非常有用。- 将马铃薯块茎6放入含有土壤混合物的10罐中,并辅以10 mL颗粒慢释放肥料。
- 放置在生长室与16小时光(140 μmolμm-2μs -1)/8小时暗光周期和25/20°C日/夜温度。植物从块茎种植到大约30\u201240天。
注意:不要使用已经开始开花的植物。
2. 准备喂食昆虫
- 获得所需的幼虫阶段M. 性.
注:这项研究的Larvae通过第5星20的人工饮食饲养,并由一位经验丰富的昆虫个体进行。幼虫也可以部分或完全在植物组织上饲养。幼虫在蜕皮之前不立即进食,最有可能在软糖之后立即进食,因此适当的分期很重要21。 - 根据幼虫大小,将幼虫转移到适当的密封容器(例如,6、12、24井组织培养盘)。菜里每井应该有一个幼虫。
注意:没有食物来源,幼虫可能表现出属地或食人行为,如果放在一起,可能会受伤。 - (可选)饿死幼虫长达2小时,因为这可能改善幼虫喂养。
注:在此期间,幼虫应位于生长室中储存的密封容器中。
3. 侵扰实验的组件设置
注:参见图 1中的原理图摘要。
- 为每个收获时间点制作放置模板。
注:为每个收获时间点设置 5 个不同的托盘会很有帮助。这样可以保持样品的有序性,并使得菜肴能够更高效地作为一组来移动,而无需改变其排列方式。如果将执行伤害百分比计算,这一点至关重要,因为感染前后的图像必须以相同的焦距捕获。- 获得 5 个坚固的托盘,能够存放一组尺寸适中的培养皿,并配有白纸。
注: 培养皿的大小基于为喂食测定选择的叶子大小。叶子应该很容易放入盘子中,不要接触两侧。例如,60 mm x 15 mm 的盘子适用于长度或宽度高达 50 mm 的叶子。 - 在每个纸盒中使用适当尺寸的培养皿跟踪一组六个圆圈。标记一组圆圈"控制"A、B 和 C,另一组"感染"A、B 和 C。还要为每个放置模板贴上适当的收获时间。
- 获得 5 个坚固的托盘,能够存放一组尺寸适中的培养皿,并配有白纸。
- (可选)设置用于"感染前"和"侵扰后"图像捕获的摄像机。
- 将摄像机固定在合适的焦距的支架上,以便拍摄放置模板中的所有培养皿。
- 标记收获时间点管。
- 标记一组 30、1.7 mL 微离心管,对应于放置模板中的每个圆。标记管子以正确识别扰动(控制/感染)、植物复制信(A、B 或 C)和收获时间点(侵扰期后分钟数)。
- 准备步骤 3.1.1 中选择的培养皿。
- 在步骤 3.1.1 中的 30 个培养皿中放置无菌滤纸盘。加入无菌水,润湿盘;不要让多余的水汇集在盘子里。在每个放置模板的六个圆圈中放置每个菜。
- 在每个放置模板旁边放置三个马铃薯植物。确保植物的年龄和相对大小都相同。
4. 实施侵扰
注: 一次设置一个收获时间点/放置模板。
- 用无菌剪刀从每株植物中取出上两个大小匹配的叶子,并在对照培养皿中放一片叶子,在每个植物的受感染的培养皿中放一片叶子(A、B和C)。尽快执行此过程。
- (可选)将放置模板传输到摄像机支架,以捕获"感染前"图像。
- 使用柔软的触摸钳子尽快将幼虫转移到每个出没的盘子里。将计时器设置为所需的"侵扰"时间。
注:幼虫食用叶组织的时间是"侵扰时间"。在实际感染开始之前,可以使用一些测试叶/幼虫从经验上确定。所有受感染的叶子所选择的"侵扰时间"应一致。
注意:幼虫应小心处理软触摸钳。第2至第4星可以轻轻地抓住他们的角或中段。 - 观察喂食,确保所有幼虫都在进食。应根据喂食行为添加/去除幼虫。尽量在培养皿上盖上盖子。
注:每片叶可使用多只幼虫。 - 在侵扰时间结束时从叶子中取出幼虫。启动收获时间的计时器。
- (可选)将放置模板传输到摄像机支架以捕获"感染后"图像。
注:放置模板中的所有六片叶子都在特定收获时间收获。
5. 收获叶子
- 在每个收获时间点的末尾将每片叶子转移到相应的标记管中,并立即通过将管放入液体N2进行冻结。将收获的植物组织储存在-80°C,直到RNA分离。
- 对每个收获时间点重复步骤 4\u20125.1。
6. 处理叶组织进行基因表达分析
- 将冷冻的叶组织研磨为粉末状,用微虫。
- 分离总RNA和过程的基因表达如前所述22。
7. (可选) 估计叶损伤
- 在虫害前和侵扰后图像中直观地估计叶片损伤百分比或计算叶片面积。
- 使用软件工具(例如,现象)23测量叶面积。
- 从叶片面积测量中,将损坏百分比计算为
损失百分比 = [(叶前面积 = 叶面积后)/叶面积之前] x 100。
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Representative Results
叶消耗定义协议的成功。健康、准确分级的幼虫应在放置在叶面后立即开始喂食,并且在整个侵扰时间继续以相当一致的方式进食。在视频1中,顶部的幼虫在放置后立即开始咀嚼,并在喂食时保持一致的速率。如果对感染后的早期基因表达事件进行分瓶,这一点尤其重要。底部的幼虫不消耗任何叶物质,是一次不成功的侵扰。
对叶片消耗期间的目视近似进行监控,以确保产生足够的损伤。通过使用虫害前后的叶子图像,可以计算出所消耗的叶子材料的百分比。图2说明了不同类型马铃薯植物不同发育阶段M.性幼虫的可变消费率。图2A中的叶子与2周大的节点传播组织培养植物分离。这个数字中的所有叶子大小相同,但受到不同阶段幼虫的侵扰5分钟。 图2A:I-IV,视频2,视频3,视频4和视频5说明了不同的速率从部分感染的幼虫阶段消耗和喂养样式。这有助于确定使用每个叶和幼虫阶段组合可能损害多少,并说明较老幼虫的贪婪性质。不建议使用第1个星幼虫,因为它们的下颌骨发育不足,在5分钟的侵扰窗口内造成损伤。需要注意的是,从组织培养的植物中提取的更年轻的更嫩的叶子往往更容易被幼虫所接受。根据这些结果,选择第4只星幼虫,以进一步评估更成熟、土壤生长的马铃薯植物对叶子的损害。土壤生长的植物更接近在田里获得的植物。图2B说明了当第3和第4只星幼虫被应用到从土壤种植的马铃薯植物分离的叶子时的损害范围。两周大的节点繁殖植物被移植到土壤中,再生长3周。土壤生长植物的受损叶子分为三组;15-20%,20-30% 和 30-40%。每个组中的三个叶子表示每个范围的不同伤害水平。来自更成熟的土壤生长植物的叶子需要更多的幼虫和更长的侵扰时间,才能达到从幼代繁殖的植物在叶子中观察到的相同程度。这些结果说明了不同类型植物的成功草本植物可能产生的结果范围。
成功的食草动物完成并评估损伤百分比后,对叶组织进行基因表达的测定。基因表达结果应表明对感染反应中涉及的转录本有强大的诱导或抑制作用。图3说明了分离叶中一个成功的草本植物实验中六个C2H2转录因子的基因表达谱。C2H2锌指StZFP2是由M.性草本植物在马铃薯中诱导的,在以前的全植研究中24。虽然StZFP2是由草本植物在分离的叶子测定中诱导的,但与分离本身的影响相比,侵扰并不显著。然而,与分离的对照组相比,另外两个StZFP2同源性动物StZFP5和StZFP7在40分钟和80分钟被显著诱导。StLOX3和StMYC2是伤人和食草动物诱导的标记基因,表明贾斯莫尼酸调节防御途径的介入。这项新研究的目的是在候选基因小组中识别对感染反应的转录因子。两个C2H2锌指转录因子的识别,对M.性草本植物有强烈反应,支持使用分离的叶子进行侵扰性测定。
图 1:侵扰协议的流程图。协议侵扰部分的实验工作流程中包含的步骤的原理表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:由M.性幼虫引起的叶损伤。a) 每个幼虫阶段对组织培养叶的损害百分比超过5分钟。 罗马数字I-IV分别指视频2-5,显示每个星在叶子上喂食的图片。(B) 土壤生长的叶子受损范围超过20分钟。请点击此处查看这个数字的较大版本。
图3:叶子的基因表达分析。对C2H2锌指转录因子的实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)基因表达分析进行了分析。平均转录水平为,2°CT带(βCT=CT的检测基因-CT外源性对照基因)。在每个时间点显示(蓝色)中的切除控制叶(蓝色)和在 (红色)中切除的受感染的叶子。每个值是三个生物复制的平均值。三向方差分析是在 μCt 值上进行的。控制叶随时间的显著差异用大写字母表示。小写字母表示受感染的叶子随时间的显著差异。同时控制叶和受感染的叶子之间的显著差异用星号 (*) 显示。Pr > F 值均小于 0.001,StZFP6 控制处理值为 0.0086 除外。 误差条表示标准偏差。NCBI加入号码是:StLOX3-X96406.1、StZFP2- MK809525、StZFP4-CV500970.1、StZFP6-DN587601.1、StZFP7-DN59005.1。从
视频1:幼虫喂食的视频剪辑。第二星M.性幼虫喂养(上),不喂养(下)从两个星期老组织培养种植马铃薯植物的叶子。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频 2:图 2A幼虫喂养的视频剪辑 (I)。第二颗在两周前组织培养的马铃薯植物中喂养的一片叶子。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频 3:图 2A幼虫喂养的视频剪辑 (II)。第三只在两周前组织培养的马铃薯植物中喂养一片叶子的在星中M.性幼虫。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频4:图2A视频剪辑(III)的幼虫喂养。第四星M.性幼虫喂养从两个星期老组织培养种植马铃薯植物的叶子。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
视频 5:图 2A幼虫喂养的视频剪辑 (IV)。第五星M.性幼虫喂养从两个星期老组织培养种植马铃薯植物的叶子。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
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Discussion
使用现有的整个植物食草方法对于实现这一特定研究的目标(即筛选一组候选基因以对感染的反应)是不必要的。分离叶细化的明显好处是缩短了进行草本测定所需的时间。整个植物与夹笼的笨拙性质被消除,并更快地进行检测,因为植物只有2周,可以用来收获叶子。在喂食过程中,它也需要更小的占地面积和更少的生长室空间;当这些资源有限时,两者都很重要。
当对防御基因表达进行测定时,会遇到这种测定的局限性,即分离。分离本身会导致伤口反应,因此评估分离对防御基因表达的基础水平有何影响非常重要。在一项涉及模拟草本动物的研究中,一种著名的防御基因蛋白酶抑制剂II(PIN2)的抄录水平在分离的马铃薯叶的控制叶中出乎意料地高,这可能是由于"在收集叶子过程中造成的伤害"然而,从M.性塔中应用昆虫回流剂大大提高了PIN2基因表达的水平。 这表明需要使用控制来梳理脱离侵扰反应的影响。
分离的叶片测定通常是为了节省时间、空间和资源。它们已用于筛选小麦26、27和大豆28和鹰嘴豆29的抗真菌病。这种测定在马铃薯30、31的病原体研究中被广泛接受。最近的一项研究发现,分离的叶测定相当于整个植物测定在确定22号场的晚阻性。
然而,文献中几乎没有证据,可用于利用分离的叶子进行国防基因表达的测定。一项研究分析了六个防御基因,以回应分离的利马豆33的蜘蛛虫侵扰。叶子还产生挥发物,在附近的未受感染的叶子中引起防御反应,这是植物中著名的防御基因表达策略。据我们所知,到目前为止,还没有咀嚼昆虫食草动物的研究利用分离的叶子来测定基因表达。
先前定义的侵扰响应C2H2锌指,StZFP2没有明显诱发当前分离叶测定的侵扰。除了整个植物与分离叶的明显差异外,先前的研究还利用了一种连续的侵扰类型,在幼虫24被切除后,植物组织被测定为基因表达。这与目前研究中使用的不连续的侵扰类型不同,在幼虫清除之后,在叶片收获之前有一个休息期。在此恢复期间,StZFP2水平迅速下降,并可能导致StZFP2感应水平降低。可能还有其他尚未定义的系统信号组件,这些成分可能有助于在整个工厂研究中观察到增强感应。另一种可能性是StZFP2成绩单可能在20分钟收获时间之前达到顶峰。然而,很显然,StZFP5和StZFP7成绩单的令人印象深刻的感应使这种类型的侵扰协议变得相关。目前方法的另一个限制是无法使用根食幼虫,如玉米根虫。当整个植物通信,如根到叶信号35或来自系统叶36,37的信号时,它也不适合。
该协议的成功在很大程度上取决于实验中使用的幼虫的质量和准确分期。培养技能和基本知识的M.性行为是有帮助的,但不是关键的。然而,获得健康、适当分期幼虫会直接影响喂养成功。幼虫进入一个静止期,在每个幼虫蜕皮之前,在此期间,他们不喂21。显然,这种幼虫不会损害叶组织。使用幼虫的理想时间是刚在蜕皮之后。特定幼虫阶段的昆虫发育阶段队列也将提高基因表达的可重复性,因为植物可能对每个发育阶段有不同的反应。
接触昆虫是幼虫供应的理想选择。M. 性蛋或幼虫也可以从商业来源订购38,39,并饲养在饮食或植物材料到适当的阶段。还有一些在线工具,可以帮助识别每个在星40,41,42。以饮食养的幼虫不会含有植物特定的成分,如幼虫在植物43上培育的微生物共生体。如果这些组件缺失,基因表达配置文件可能会更改。如果这些影响对研究很重要,则幼虫可能部分或完全饲养在宿主植物上。在喂食实验前几个小时从昆虫身上扣留食物也可以改善进食行为。实地收集的幼虫也可以是强大和有利的,因为它们已经暴露于适当的营养水平,但这增加了另一个变量,可能或不适合所有研究。
生产健康、无昆虫和无农药的植物也至关重要。具有病毒、害虫和真菌生物的植物将引入混杂因素,并在获取可重现数据方面构成挑战。
许多幼虫星、马铃薯植物年龄和叶片大小可以结合起来,为特定类型的研究定制协议。也可调整感染和收获时间的长度。如果整个植物观测结果被用作基线,则可以使用分离的叶子来研究许多其他植物-昆虫的相互作用。分离叶测定是整个植物草本研究分析基因表达的相关和有价值的替代方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢鲍勃·法拉尔和亚历克西斯·帕克提供了在这项研究中使用的昆虫,以及他们在幼虫分期方面的专长。此外,感谢迈克尔·布莱克本和赛卡特·戈什对手稿的批判性评论。
本出版物中提及商品名称或商业产品仅用于提供特定信息,并不意味着美国农业部的建议或认可。
美国农业部是平等机会提供者和雇主。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
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