本方法通过将烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫接种于马铃薯离体叶片，制备出具有自然植食性昆虫取食损伤的植物组织。随后检测该植物组织中六个转录因子同源基因在昆虫取食早期响应中的表达情况。
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摘要
摘要
昆虫食草作用的基因表达研究具有多营养级特性，需要大量生物学重复，因而要求建立更简单、更高效的食草作用实验方案。通常在整株植物系统中研究咀嚼式昆虫造成的扰动。尽管这种全生物策略较为常用，但如果能在单个离体叶片中重现类似观察结果，则并非必须采用整株系统。其基本假设是，叶片自身即含有信号转导所需的基本组分。对于信号转导的早期事件而言，细胞只需接收来自扰动的信号，并将该信号传递给邻近细胞，随后检测这些邻近细胞的基因表达情况。
该方法仅改变了离体叶片的分离时机。在整株植物实验中，幼虫被限制在单个叶片上，随后该叶片从植株上分离，并用于基因表达分析。如果将分离顺序颠倒，即在离体实验中将分离步骤由整株实验中的最后一步变为第一步，则可简化取食实验的操作流程。
Solanum tuberosum var. Kennebec 可通过简单的组织培养基进行节段转移繁殖，必要时可进一步移栽至土壤中继续生长。从母株上切取叶片并转移至培养皿中，用于与烟草天蛾（M. sexta）幼虫进行取食实验。受损的叶片组织可用于检测信号转导过程中相对较早事件的表达情况。基因表达分析鉴定出与虫害特异性相关的Cys2-His2（C2H2）型转录因子，证实了利用离体叶片研究早期响应过程的可行性。该方法相比整株植物接种更为简便，且占用空间更少。
引言
植食性昆虫取食会引发一系列分子事件，使植物能够识别攻击并启动适当的防御反应以维持生存。植物从咀嚼类昆虫处接收到两种基本信号：一种来自组织受到的物理损伤，另一种来自昆虫特有的物质。组织因幼虫口器造成损伤后，会释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而触发明确的伤口反应，导致茉莉酸激素水平升高以及防御基因的转录1。其中最著名的DAMP之一是系统素（systemin），它是一种多肽，由叶片受伤后前体蛋白prosystemin切割产生2,3。茉莉酸介导的伤口反应进一步受到植食性昆虫相关分子模式（HAMPs）的调控，这些分子可来源于鳞翅目幼虫的唾液、肠道内容物（反吐物）和粪便（frass）4。昆虫利用这些物质来增强或逃避植物的防御反应5。随后，转录因子通过调控下游防御基因的表达，将激素信号传递至防御反应通路中6,7,8。
一些在实验室环境中开展的植物-昆虫互作研究采用模拟方法，旨在近似昆虫的自然取食方式。模拟食草损伤通常通过使用各种工具对植物组织....
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方案
注意：以下实验方案设计为由一人完成设置、观察和样品采集。可将相同设置的多次运行合并，以增加生物学重复。任何额外的实验重复均应在每天同一时间进行设置，以消除基因表达可能受到的昼夜节律影响。本方案设计为针对5个不同的采收时间点，每个时间点制备3片“受侵染”叶片。每个时间点配备相应的对照叶片，共获得30个样品。实验可采用不同大小的叶片和不同龄期的幼虫，但建议在整个实验过程中保持叶片大小、幼虫龄期和侵染时间一致。
1. 马铃薯植株的准备
注意：所有需要无菌操作的步骤均须在组织培养罩内进行18,19。
- 从外植体来源制备Kennebec苗株。
- 准备扩增培养基。
- 在2 L的烧瓶中加入4.43 g含维生素的Murashige和Skoog（MS）培养基粉末、20 g蔗糖、2 g琼脂替代物及1 L经反渗透（RO）纯化的水，并放入磁力搅拌子。将烧瓶置于搅拌器上混合。持续搅拌条件下，用NaOH调节pH至5.8。
注意：琼脂在高压灭菌前不会溶解。 - 加入1 mL防腐剂/杀菌剂，于液体循环条件下高压灭菌20分钟（121 °C，101.3 kPa）。灭菌程序结束后立即从高压灭菌器中取出培养基，并冷却至50 °C。在超净工....
- 在2 L的烧瓶中加入4.43 g含维生素的Murashige和Skoog（MS）培养基粉末、20 g蔗糖、2 g琼脂替代物及1 L经反渗透（RO）纯化的水，并放入磁力搅拌子。将烧瓶置于搅拌器上混合。持续搅拌条件下，用NaOH调节pH至5.8。
- 准备扩增培养基。
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结果
叶片取食情况决定了实验方案的成败。健康且发育阶段准确的幼虫在被放置到叶片表面后应立即开始取食，并在整个接虫期间保持相对稳定的取食行为。在视频1中，上方的幼虫在放置后立即开始啃食，并在取食过程中保持稳定的速率。如果需要检测接虫后早期的基因表达变化，这一点尤为重要。下方的幼虫未取食任何叶片组织，属于接虫失败的实例。
在取食过程中通过视觉评估监控叶片消耗情况，以确保产生足够的取食损伤。可通过比较植株受害前后叶片的图像，计算叶片材料被消耗的比例，从而量化损伤程度。图2展示了不同发育阶段的M. sexta幼虫在不同类型马铃薯植株上取食速率的差异。图2A中的叶片取自2周龄的节点繁殖组织培养植株。该图中所有叶片大小相同，但在5分钟内分别暴露于不同发育阶段的幼虫取食。
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讨论
采用现有的整株植物取食方法对于实现本研究的特定目标（即筛选一组候选基因对虫害的响应）而言并非必要。使用离体叶片改良方法的明显优势在于缩短了取食实验所需的时间。该方法消除了使用夹式笼具处理整株植物时操作不便的问题，并且由于仅需两周龄的幼苗即可采收叶片，实验能够更早开展。此外，该方法在取食过程中占用空间更小，所需生长室空间也更少；当这些资源有限时，这两点尤为重要。
该实验方法的局限性在于取样时可能导致的叶片脱离问题，尤其是在检测防御基因表达时会遇到这一情况。脱离本身会引发伤口响应，因此有必要评估脱离对防御基因基础表达水平的影响。在一项模拟植食性昆虫取食的研究中，已知的防御基因蛋白酶抑制剂II(PIN2)在脱离的马铃薯叶片对照组中的转录水平意外地升高，这很可能是由于"叶片采集过程中造成的伤口"25所致。然而，施加来自M. sexta的昆虫口腔分泌物显著增强了PIN2基因的表达水平。这说明必须设置适当的对照，以区分脱离所引起的效应与虫害响应之间的差异。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Bob Farrar 和 Alexis Park 提供本研究中使用的昆虫，并感谢他们在幼虫分期方面的专业知识。此外，感谢 Michael Blackburn 和 Saikat Ghosh 对手稿的审阅。
本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之用，并不意味着美国农业部的推荐或认可。
美国农业部是一个提供平等机会的机构和雇主。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂替代物 | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | 产品为 Gelzan |
| 培养容器（6、12 或 24 孔板） | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | 许多其他公司也销售此类产品 |
| 烟草天蛾卵 | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30–50 枚卵 |
| 烟草天蛾卵 | Great Lakes Hornworm | NA | 50、100、250 或 500 枚卵 |
| 烟草天蛾幼虫 | Carolina Biological Supply Company | 具体龄期请电话咨询 | 任意龄期 |
| 烟草天蛾幼虫 | Great Lakes Hornworm | 具体龄期请电话咨询 | 任意龄期 |
| 微量离心管，1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | 已测试可在液氮中使用，不会爆炸 |
| 含维生素的 Murashige & Skoog (MS) 基础培养基 | PhytoTechnology Laboratories | M519 | 用于配制增殖培养基 |
| 营养琼脂混合物 | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | 产品为含维生素、蔗糖和 Gelzan 的 Murashige & Skoog 基础培养基 |
| 滤纸片 | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman 圆片——购买时需适配培养皿尺寸 |
| 培养皿，60×15 mm 或 100×15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A 或 FB0875712 | 根据叶片大小选择合适尺寸 |
| 马铃薯块茎 | 任意来源 | B 级（非有机） | 建议选用 Maine Farmer’s Exchange |
| 花盆，10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| 防腐剂/杀菌剂 | Plant Cell Technology | NA | 产品为 PPM（植物防腐剂混合物） |
| 用于外植体来源的种薯 | 任意来源 | B 级（非有机） | 建议选用 Maine Farmer’s Exchange |
| 缓释肥料（14-14-14） | 任意品牌 | NA | Osmocote 是常用品牌 |
| 软头镊子 | BioQuip | 4750 | |
| 土壤混合物 | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | 产品为 Sunshine LC1 混合土 |
| 无菌培养容器 | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Maganta 型容器，PTL-100 |
| 无菌培养容器 | Fisher Scientific | ICN2672206 | 产品为 MP Biomedicals Plantcon |
参考文献
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science.
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重印与许可
