Summary
الطريقة المعروضة يخلق الأنسجة النباتية التالفة الأعشاب الطبيعية من خلال تطبيق يرقات Manduca sexta على أوراق منفصلة من البطاطا. يتم فحص الأنسجة النباتية للتعبير عن ستة متجانسات عامل النسخ المشاركة في الاستجابات المبكرة لعشب الحشرات.
Abstract
الطبيعة المتعددة التغذية لدراسات التعبير الجيني للحشرات الأعشاب العاجية تتطلب أعدادا كبيرة من النسخ البيولوجي، وخلق الحاجة إلى بروتوكولات أكثر بساطة، وأكثر تبسيطا الأعشاب. عادة ما تدرس اضطرابات مضغ الحشرات في النظم النباتية كلها. في حين أن هذه الاستراتيجية الكائن الحي كله تحظى بشعبية، فإنه ليس من الضروري إذا كان يمكن تكرار ملاحظات مماثلة في ورقة منفصلة واحدة. والافتراض هو أن العناصر الأساسية اللازمة لنقل الإشارات موجودة داخل الورقة نفسها. في حالة الأحداث المبكرة في نقل الإشارة، تحتاج الخلايا فقط لتلقي الإشارة من الاضطراب ونقل تلك الإشارة إلى الخلايا المجاورة التي يتم اختبارها للتعبير الجيني.
والطريقة المقترحة تغير ببساطة توقيت المفرزة. في التجارب النباتية الكاملة، تقتصر اليرقات على ورقة واحدة يتم فصلها في نهاية المطاف عن النبات وإسيد هاهية للتعبير الجيني. إذا تم عكس ترتيب الختان، من الماضي في الدراسات النباتية كلها، إلى الأولى في الدراسة المنفصلة، يتم تبسيط تجربة التغذية.
يتم نشر Solanum tuberosum var. Kennebec عن طريق نقل العقدية في وسط زراعة الأنسجة بسيطة ونقلها إلى التربة لمزيد من النمو إذا رغبت في ذلك. يتم استئصال الأوراق من النبات الأم ونقلها إلى أطباق بيتري حيث يتم إجراء فحص التغذية مع مراحل اليرقات من M. sexta. يتم التحقق من تلف الأنسجة الورقية للتعبير عن الأحداث المبكرة نسبيا في نقل إشارة. حدد تحليل التعبير الجيني عوامل النسخ Cys2-His2 (C2H2) الخاصة بالإصابة، مما يؤكد نجاح استخدام الأوراق المنفصلة في دراسات الاستجابة المبكرة. الطريقة هي أسهل لأداء من غزوات النبات كله ويستخدم مساحة أقل.
Introduction
الأعشاب العاج يضع في الحركة سلسلة من الأحداث الجزيئية التي يمكن للنبات على حد سواء تحديد الهجوم وجبل استجابة مناسبة لبقائها. يتلقى النبات اثنين من العظة الأساسية من مضغ الحشرات. واحد من الضرر المادي للأنسجة والآخر من المواد الخاصة بالحشرات. يتم إطلاق الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) استجابة للضرر الناجم عن أجزاء الفم اليرقات وإثارة استجابة جرح محددة جيدا ً تؤدي إلى زيادة في حمض الجاسمونيك الهرموني ونسخ جينات الدفاع1. واحدة من DAMPs الأكثر شهرة هو systemin، وهو ببتيد التي يتم تشكيلها من قبل انشقاق أكبر بروتين بروsystemin بعد جرح ورقة2،3. يتم تعديل استجابة الجرح حمض jasmonic كذلك من قبل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالأعشاب (HAMPs)، والتي يمكن أن تستمد من اللعاب كاتربيلر، محتويات الأمعاء (regurgitant) والبراز (frass)4. الحشرات استخدام هذه المواد إما لتعزيزأو التهرب من استجابة الدفاع 5. عوامل النسخ ثم نقل الرسالة من إشارات هرمون في استجابة الدفاع عن طريق تنظيم الجينات الدفاع المصب6و7و8.
بعض دراسات التفاعل بين النبات والحشرات المستخدمة في البيئات المختبرية هي من النوع المحاكي ، بهدف تقريب الطريقة الطبيعية للتغذية من قبل الحشرة. عادة ما يتم إنجاز محاكاة الأعشاب العاجعن طريق خلق ضرر اصطناعي للأنسجة النباتية مع الأدوات المختلفة التي تحاكي آلية محددة من الفم الحشرات كافية للتسبب في إطلاق DAMPs وتحريك إنتاج الجينات الدفاعية. وغالبا ما تضاف المكونات الأخرى الخاصة بالحشرات مثل إفرازات الفم أو قلس لتكرار مساهمة HAMPs9،10،11. إنشاء حجم معين ونوع من الجرح وتطبيق كميات دقيقة من HAMPs هي ميزة واحدة لهذه الأنواع من الدراسات ويمكن أن تقدم المزيد من النتائج القابلة للاستنساخ. الدراسات العشبية الطبيعية، حيث يتم إنجاز الضرر الذي يلحق بالأنسجة النباتية من خلال تطبيق الحشرات المكتسبة في الميدان أو التي تربى مختبرًا، غالبًا ما تكون أكثر صعوبة لأن حجم الجرح وكميات HAMP يحكمها سلوك الحشرات وإضافة تباين إلى البيانات. الأساليب الطبيعية مقابل المحاكاة ومزاياها وعيوبها تناقش بشكل جيد في الأدب12،13،14.
لدراسة أحداث الإشارات المبكرة مثل عوامل النسخ، يجب استهلاك نسبة مئوية معينة من الورقة في فترة زمنية قصيرة نسبيا، لذلك يجب أن تبدأ اليرقات في المضغ على الفور والحفاظ على الاستهلاك حتى يتم تجميد الورقة لتحليلها. M. sexta هو مغذي شره على النباتات السولاناسيوس متعددة خلال العديد من مراحل اليرقات، مما يجعلها مثالية لنقل أقصى قدر من الضرر في فترة قصيرة نسبيا من الزمن15. هذا هو مريح عند دراسة الأحداث إشارة في وقت مبكر، كما يحدث استجابة النبات على الفور تقريبا بعد الحشرات يتصل سطح ورقة16،17. ويثبت أسلوب الاحتواء الشائع استخداماً في قفص المشبك أنه خرقاء، لأن الأقفاص المتعددة تتطلب تعديلات مستمرة طوال التجربة للسماح بإزالة اليرقات أو إضافتها. يجب أن تكون الأوراق أيضا كبيرة بما فيه الكفاية وقوية بما فيه الكفاية لدعم الحشرات متعددة التغذية في نفس الوقت. هذه الأنواع من نباتات البطاطا تتطلب مساحة كبيرة لمراقبة التغذية. وغالبا ما تنتقل اليرقات إلى الجانب السفلي من سطح الأوراق مما يجعل أيضا ملاحظات التغذية صعبة للغاية. ومن الواضح أن استخدام نباتات كاملة لإجراء هذه التجارب أمر مرهق.
الدراسة الحالية يستخدم أوراق منفصلة معزولة في أطباق بيتري بدلا من النباتات كلها لتبسيط وتبسيط نهج النبات كله لدراسة الأعشاب العاج. يقتصر تطبيق البروتوكول في هذه الدراسة على مراقبة مجموعة من عوامل النسخ C2H2 الناجمة في وقت مبكر في أوراق البطاطس بعد الضرر العشبي من قبل يرقات M. sexta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لشخص واحد لإعداد وإجراء ملاحظات وجمع العينات. قد يتم دمج تشغيل متعددة من نفس الإعداد لزيادة النسخ المتماثل البيولوجي. وينبغي إعداد أي تكرار إضافي للتجربة في نفس الوقت من اليوم للقضاء على التأثيرات اليومية المحتملة على التعبير الجيني. تم تصميم البروتوكول لإنشاء 3 أوراق "موبوءة" لمدة 5 نقاط زمنية منفصلة للحصاد. أوراق التحكم المتطابقة لكل نقطة زمنية إنشاء ما مجموعه 30 عينة. يمكن إجراء التجربة مع مجموعة متنوعة من أحجام الأوراق ومراحل اليرقات، ولكن من المستحسن أن يكون حجم الورقة، ومرحلة اليرقات ووقت الإصابة متسقة في جميع مراحل الإجراء.
1. إعداد نباتات البطاطا
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتطلب تقنية معقمة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة18،19.
- إعداد النباتات Kennebec من مصدر explant.
- إعداد وسيط الانتشار.
- أضف 4.43 غرام من Murashige وSkoog (MS) مع مسحوق الفيتامينات، 20 غرام من السكروز و 2 غرام من الأونصة البديلة إلى 1 لتر من التناضح العكسي (RO) المياه النقية في قارورة 2 لتر مع شريط تدور. نقل قارورة إلى طبق تحريك وتخلط. ضبط الحموضة إلى 5.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم مع الاستمرار في تحريك.
ملاحظة: أجار لن تذوب حتى الأوتوكلاف. - إضافة 1 مل من المواد الحافظة / biocide والأوتوكلاف على دورة السائل لمدة 20 دقيقة (121 درجة مئوية، 101.3 كيلوباسكال). إزالة المتوسطة من الأوتوكلاف مباشرة بعد الانتهاء من دورة وتبريده إلى 50 درجة مئوية. نقل 100 مل من الانتشار المعقمة والمبردة المتوسطة إلى أوعية الثقافة المعقمة (على سبيل المثال، أرجواني أو Plantcon) باستخدام تقنية معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.
- أضف 4.43 غرام من Murashige وSkoog (MS) مع مسحوق الفيتامينات، 20 غرام من السكروز و 2 غرام من الأونصة البديلة إلى 1 لتر من التناضح العكسي (RO) المياه النقية في قارورة 2 لتر مع شريط تدور. نقل قارورة إلى طبق تحريك وتخلط. ضبط الحموضة إلى 5.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم مع الاستمرار في تحريك.
- إعداد المواد explant.
- الحصول على مصدر explant كما بذور بذور كينيبيك وإزالة جميع آثار التربة عن طريق الغسيل مع الحنفية H2O. إزالة براعم وقطع إلى قطع 2 سم مع مشرط معقمة.
- تعقيم قطع براعم عن طريق نقع لمدة 15 ق في الإيثانول 70٪، تليها 13 دقيقة في 1:1 التبييض (1 جزء RO-المياه: 1 جزء مركزة الجرثومية / التجارية الصف التبييض). شطف 5 مرات في معقمة H2O.
- نقل المواد explant إلى الأوعية زراعة الأنسجة المعقمة مع وسيلة الانتشار في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنية معقمة. نقل السفن إلى غرفة زراعة الأنسجة النباتية وتنمو لمدة 2\u20123 أسابيع أو حتى تشكل النباتات في 24 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة.
- إعداد وسيط الانتشار.
- إعداد النباتات البطاطس زراعة الأنسجة النضوية المنتشرة.
- إعداد وسيط نقل العقدية.
ملاحظة: هذا سيجعل 10 أوعية زراعة الأنسجة التي يمكن استخدامها في نفس اليوم أو يمكن أن تكون مصنوعة في وقت مبكر وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى نقل العقدية.- أضف 36.43 غرام من مزيج أجار المغذي إلى 1 لتر من المياه النقية RO في قارورة 2 لتر مع شريط تدور. نقل قارورة إلى طبق تحريك وتخلط. ضبط الحموضة إلى 5.8 باستخدام KOH مع الاستمرار في تحريك.
ملاحظة: أجار لن تذوب حتى الأوتوكلاف. - الأوتوكلاف على دورة السائل لمدة 20 دقيقة (121 درجة مئوية، 101.3 كيلوباسكال). إزالة المتوسطة من الأوتوكلاف مباشرة بعد الانتهاء من دورة وتبريده إلى 50 درجة مئوية. نقل 100 مل من المبردة المعقمة نقل العقدية المتوسطة إلى الأوعية ثقافة معقمة (انظر جدولالمواد) باستخدام تقنية معقمة في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
- أضف 36.43 غرام من مزيج أجار المغذي إلى 1 لتر من المياه النقية RO في قارورة 2 لتر مع شريط تدور. نقل قارورة إلى طبق تحريك وتخلط. ضبط الحموضة إلى 5.8 باستخدام KOH مع الاستمرار في تحريك.
- إعداد القطع العقدية.
- الحصول على النباتات Kennebec نمت من المواد explant (المنتجة في الخطوة 1.1.2). يجب أن يكون النباتات ما لا يقل عن 3 إلى 4 العقد (نقاط الفرع). إزالة الأوراق باستخدام مقص معقمة أو مشرط. قطع فروع قريبة من الجذعية الرئيسية، وترك حوالي 2 ملم من الأنسجة فرع.
- إزالة المقاطع العقدية من الجذعية عن طريق قطع ما يقرب من 2 ملم فوق وتحت كل نقطة فرع أو عقدة. ترتيب القطع العقدية في وعاء زراعة الأنسجة المعقمة التي تحتوي على وسيط نقل العقدية (المنتجة في الخطوة 1.2.1.2) في نفس الاتجاه كما هو الحال في السفينة السابقة (فرع مشيرا إلى أعلى).
- نقل السفن مع القطع العقدية إلى غرفة زراعة الأنسجة النباتية وتنمو لمدة 2\u20123 أسابيع في 24 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة.
ملاحظة: كل قطع العقدية سوف تنمو إلى مصنع جديد. عدد القطع في كل وعاء يحدد حجم ورقة. وسيؤدي انخفاض عدد القطع المنقولة لكل سفينة إلى وجود أوراق أكبر. ثلاثة مصانع لكل سفينة سيكون لها 15 مم × 20 مم يترك في 2\u20123 أسابيع.
- إعداد وسيط نقل العقدية.
- (اختياري) إعداد التربة المزروعة نباتات البطاطا Kennebec.
ملاحظة: لإنتاج أوراق أكبر، يمكن نقل نباتات البطاطا المنتشرة العقدية إلى التربة.- نقل النباتات البطاطا المزروعة في نقل العقدية المتوسطة إلى التربة عن طريق سحب بلطف النبات من المتوسط حتى يتم تحرير جميع الأنسجة الجذرية من أجار.
- نقل إلى التربة فقط فوق العقدة 1 من الجذور وحزمة طفيفة التربة حول زرع. الماء بلطف لضمان اتصال التربة مع نظام الجذر.
- مكان في غرفة النمو مع 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة و 25/20 درجة مئوية يوم / ليلة درجات الحرارة.
ملاحظة: النباتات جاهزة عندما وصلت أعلى اثنين من الأوراق الموسعة بالكامل إلى الحجم المناسب للتبيّن.
- (اختياري) إعداد نباتات البطاطا المزروعة بالدرنات.
ملاحظة: نباتات البطاطا المزروعة من الدرنات أكبر وأكثر قوة ويمكن أن تكون مفيدة إذا تربية اليرقات على النباتات أو إذا كان من المرغوب فيه تغذية اليرقات بين عشية وضحاها.- وضع درنة البطاطا 6 في عمق 10 في وعاء يحتوي على مزيج التربة تستكمل مع 10 مل بيليه الأسمدة الإفراج البطيء.
- مكان في غرفة النمو مع 16 ساعة ضوء (140 μmol·m-2·s -1)/8 ساعة فترة ضوئية داكنة و 25/20 درجة حرارة يوم/ليلة. النباتات جاهزة حوالي 30-u201240 يوما من زراعة درنة.
ملاحظة: لا تستخدم النباتات التي بدأت في زهرة.
2. إعداد الحشرات للتغذية
- الحصول على مرحلة اليرقات المطلوبة من M. sexta.
ملاحظة: تم تربية اليرقات لهذه الدراسة على النظام الغذائي الاصطناعي من خلال 5 instar20 ونظمت من قبل فرد من ذوي الخبرة من الحشرات في المنزل. كما يمكن تربية اليرقات جزئياً أو كلياً على الأنسجة النباتية. اليرقات لا تأكل مباشرة قبل التحرش وعلى الأرجح أن تأكل مباشرة بعد التحرش، لذلك التدريج المناسب مهم21. - نقل اليرقات إلى وعاء احتواء مناسب (على سبيل المثال، 6-، 12-، 24-جيدا ً طبق زراعة الأنسجة) اعتماداً على حجم اليرقات. يجب أن يكون هناك يرقة واحدة لكل بئر في الطبق.
ملاحظة: قد تظهر اليرقات سلوكًا إقليميًا أو آكلًا للأكل دون مصدر غذائي وقد تصاب بالإصابة إذا تم إيواؤها معًا. - (اختياري) اليرقات التجويع لمدة تصل إلى 2 ساعة لأن هذا قد يحسن تغذية اليرقات.
ملاحظة: يجب أن تكون اليرقات في وعاء احتواء مخزن ة في غرفة النمو خلال هذا الوقت.
3. إعداد مكونات لتجربة الإصابة
ملاحظة: راجع الملخص التخطيطي في الشكل 1.
- قم بإجراء قوالب موضع لكل نقطة زمنية للحصاد.
ملاحظة: من المفيد إعداد 5 صواني مختلفة لكل نقطة وقت الحصاد. هذا يحافظ على عينات منظمة ويسمح للأطباق أن تتحرك في جميع أنحاء أكثر كفاءة كمجموعة دون تغيير ترتيبها. وإذا أجريت حسابات النسبة المئوية للضرر، فإن ذلك ضروري لأن الصور السابقة واللاحقة للإصابة يجب التقاطها بنفس البعد البؤري.- الحصول على 5 صواني قوي قادرة على عقد مجموعة من ستة أطباق بيتري الحجم المناسب وخط مع ورقة بيضاء.
ملاحظة: يعتمد حجم طبق بيتري على حجم الورقة المختارة لإجراء التبيء. يجب أن تناسب ورقة بسهولة في الطبق دون لمس الجانبين. على سبيل المثال، طبق 60 مم × 15 مم مناسب للأوراق التي يصل طولها إلى 50 مم أو عرضها. - تتبع مجموعة من ست دوائر باستخدام طبق بيتري الحجم المناسب على الورق في كل صينية. تسمية مجموعة واحدة من الدوائر 'التحكم' A، B و C والآخر 'الموبوءة' A، B، و C. أيضا تسمية كل قالب التنسيب مع وقت الحصاد المناسب.
- الحصول على 5 صواني قوي قادرة على عقد مجموعة من ستة أطباق بيتري الحجم المناسب وخط مع ورقة بيضاء.
- (اختياري) إعداد كاميرا لالتقاط الصور "قبل الإصابة" و"بعد الإصابة".
- تأمين كاميرا على موقف في البعد البؤري المناسب لالتقاط الصور من جميع أطباق بيتري في قالب التنسيب.
- تسمية أنابيب نقطة وقت الحصاد.
- تسمية مجموعة من 30، 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المقابلة لكل دائرة في قالب التنسيب. تسمية الأنابيب لتحديد الاضطراب (التحكم/الموبوءة) وحرف النسخ المتماثل للنبات (A أو B أو C) ونقطة وقت الحصاد (عدد الدقائق بعد فترة الإصابة).
- إعداد أطباق بيتري التي تم اختيارها في الخطوة 3.1.1.
- ضع قرص ورق فلتر معقم في كل طبق من أطباق Petri الـ 30 من الخطوة 3.1.1. إضافة الماء المعقم لترطيب الأقراص. لا تسمح المياه الزائدة لتجمع في الطبق. ضع كل طبق في كل دائرة من الدوائر الست في كل قالب موضع.
- وضع ثلاثة نباتات البطاطا بجانب كل قالب التنسيب. تأكد من أن النباتات هي كل نفس العمر والحجم النسبي.
4- الإصابة
ملاحظة: يتم إعداد قالب نقطة وقت/موضع حصاد واحد في كل مرة.
- إزالة أعلى اثنين من الأوراق المتطابقة حجم من كل مصنع مع مقص معقمة ووضع ورقة واحدة في طبق بيتري السيطرة وواحدة في طبق بيتري الموبوءة لكل مصنع (A، B و C). تنفيذ هذه العملية في أسرع وقت ممكن.
- (اختياري) نقل قالب الموضع إلى حامل الكاميرا لالتقاط صورة "قبل الإصابة".
- نقل اليرقات إلى كل طبق موبوء باستخدام ملقط لمسة ناعمة في أسرع وقت ممكن. تعيين جهاز ضبط الوقت لوقت 'غزو' المطلوب.
ملاحظة: الفترة الزمنية التي تستهلك فيها اليرقات الأنسجة الورقية هي "وقت الإصابة". هذا هو الشيء الذي يمكن تحديده تجريبيا باستخدام عدد قليل من أوراق الاختبار / اليرقات قبل بداية الإصابة الفعلية. يجب أن يكون "وقت الإصابة" المختار متناسقًا لجميع الأوراق الموبوءة.
ملاحظة: يجب التعامل مع اليرقات بعناية من قبل ملقط لمسة ناعمة. يمكن استيعاب النجم الثاني إلى الرابع بلطف من القرن أو القسم الأوسط. - مراقبة التغذية للتأكد من أن جميع اليرقات تأكل. يجب إضافة/إزالة اليرقات بناءً على سلوك التغذية. احتفظ بالأغطية على أطباق بيتري قدر الإمكان.
ملاحظة: يمكن استخدام يرقات متعددة لكل ورقة. - إزالة اليرقات من الأوراق في نهاية وقت الإصابة. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت لوقت الحصاد.
- (اختياري) نقل قالب الموضع إلى حامل الكاميرا لالتقاط صورة "بعد الإصابة".
ملاحظة: يتم حصاد جميع الأوراق الستة في قالب الموضع في وقت الحصاد المحدد.
5. أوراق الحصاد
- نقل كل ورقة إلى أنبوب المسمى المقابلة في نهاية كل نقطة وقتالحصاد وتجميد على الفور عن طريق إسقاط الأنبوب في السائل N 2. تخزين الأنسجة النباتية حصادها في -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي.
- كرر الخطوات 4\u20125.1 لكل نقطة وقت الحصاد.
6. معالجة الأنسجة الورقية لتحليل التعبير الجيني
- طحن الأنسجة ورقة المجمدة إلى مسحوق مع micropestle.
- عزل مجموع الحمض النووي الريبي وعملية التعبير الجيني كما سبق وصفه22.
7. (اختياري) تقدير تلف ورقة
- تقدير بصريا نسبة الضرر ورقة أو حساب منطقة ورقة في الصور قبل وبعد الإصابة.
- قياس مساحة الورقة باستخدام أدوات البرمجيات (على سبيل المثال، Phenophyte)23.
- من قياسات منطقة الورق، حساب النسبة المئوية للضرر كما
النسبة المئوية للضرر = [(مساحة الورقة قبل – منطقة الورقة بعد) / ورقة المنطقة قبل] × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يحدد استهلاك الورق نجاح البروتوكول. يجب أن تبدأ اليرقات الصحية والمرحلية بدقة في التغذية فور وضعها على سطح الأوراق، وينبغي أن تستمر التغذية بطريقة متسقة إلى حد ما طوال فترة الإصابة. في الفيديو 1، تبدأ اليرقة في الأعلى في المضغ مباشرة بعد التنسيب وتحافظ على معدل ثابت أثناء التغذية. وهذا مهم بشكل خاص إذا كان اختبار أحداث التعبير الجيني المبكر بعد الإصابة. اليرقات في الجزء السفلي لم تستهلك أي مادة ورقة وهو مثال على الإصابة غير ناجحة.
يتم مراقبة التقريب البصري أثناء استهلاك الأوراق لضمان إنتاج ما يكفي من الضرر. ويمكن حساب كمية المواد الورقية المستهلكة كنسبة مئوية من الضرر باستخدام صور الأوراق قبل وبعد الإصابة. ويبين الشكل 2 المعدلات المتغيرة للاستهلاك حسب المراحل الإنمائية المختلفة لليرقات M. sexta على أنواع مختلفة من نباتات البطاطا. تم فصل الأوراق في الشكل 2A من 2-أسبوع من العمر النباتات زراعة الأنسجة العقدية المنتشرة. جميع الأوراق في هذا الرقم هي من نفس الحجم ولكن تعرضت للإصابة بمراحل مختلفة من اليرقات لمدة 5 دقائق. الشكل 2A: I-IV، فيديو2، فيديو3، فيديو4، والفيديو 5 توضح معدلات مختلفة من أنماط الاستهلاك والتغذية لكل مرحلة يرقات من جزء من الإصابة. وهذا مفيد في تحديد مقدار الضرر الممكن باستخدام كل تركيبة من الأوراق واليرقات في المرحلة ويوضح الطبيعة الشرهة لليرقات القديمة. لا ينصح باستخدام يرقات النجمة الأولى حيث لا يتم تطوير الفك السفلي بما فيه الكفاية لإنتاج الضرر في نافذة الإصابة 5 دقائق. من المهم أن نلاحظ أن الأوراق الأصغر سنا أكثر العطاء المستمدة من النباتات المزروعة بالأنسجة هي في كثير من الأحيان أكثر قبولا لليرقات. واستناداً إلى هذه النتائج، تم اختيار يرقات النجمة الرابعة لمواصلة تقييم الأضرار التي لحقت بالأوراق من نباتات البطاطا المزروعة في التربة. النباتات المزروعة في التربة تقترب بشكل أوثق من تلك التي تم الحصول عليها في هذا المجال. ويوضح الشكل 2 باء نطاق الضرر عندما طُبقت يرقات النجمة الثالثة والرابعة على الأوراق المنفصلة عن نباتات البطاطا المزروعة في التربة. تم زرع النباتات العقدية المنتشرة لمدة أسبوعين في التربة وزراعتها لمدة 3 أسابيع إضافية. وسقطت الأوراق التالفة من النباتات المزروعة في التربة في ثلاث مجموعات؛ 15-20%، 20-30%، و30-40%. وتظهر الأوراق الثلاثة في كل مجموعة لتمثيل مستويات مختلفة من الضرر لكل نطاق. وتحتاج الأوراق من النباتات المزروعة في التربة أكثر نضجا ً إلى مزيد من اليرقات المطبقة وإلى وقت أطول للإصابة للوصول إلى نفس المستوى من الضرر الذي لوحظ في الأوراق من النباتات الأطول انتشارًا العقدية. توضح هذه النتائج مجموعة من النتائج الممكنة من الأعشاب الناجحة من أنواع مختلفة من النباتات.
بعد اكتمال الأعشاب الناجحة وتقييم الضرر في المئة، يتم اختبار الأنسجة الورقية للتعبير الجيني. وينبغي أن تشير نتائج التعبير الجيني إلى وجود تحريض قوي أو قمع للنصوص التي تنطوي عليها الاستجابة للإصابة. يوضح الشكل 3 ملامح التعبير الجيني لستة عوامل نسخ C2H2 من تجربة عشبية ناجحة في أوراق منفصلة. C2H2 الزنك الاصبع StZFP2 كان يسببها M. sexta herbivory في البطاطا في الدراسات النباتية كلها السابقة24. على الرغم من أن StZFP2 كان مدفوعا ً بالأعشاب العاجية في التبسي الورقي المنفصل، إلا أن الإصابة لم تكن كبيرة بالمقارنة مع تأثير المفرزة نفسها. ومع ذلك، اثنين من homologs StZFP2 أخرى، StZFP5 و StZFP7، تم حثها بشكل كبير في 40 و 80 دقيقة بعد herbivory بالمقارنة مع ضوابط منفصلة. StLOX3 و StMYC2 هي الجينات علامة الناجمة عن كل من الجرح والأعشاب العاجية وتشير إلى مشاركة حمض jasmonic مسارات الدفاع المنظمة. وكان الهدف من هذه الدراسة الخاصة هو تحديد عوامل النسخ التي تستجيب للإصابة بين فريق من الجينات المرشحة. تحديد اثنين من عوامل النسخ إصبع الزنك C2H2 التي تستجيب بقوة لM. sexta herbivory يدعم استخدام أوراق منفصلة لتجارب الإصابة.
الشكل 1: مخطط انسيابي لبروتوكول الإصابة. تمثيل تخطيطي للخطوات المضمنة في سير العمل التجريبي لقسم الإصابة من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تلف الأوراق الناجم عن يرقات M. sexta. (أ) النسبة المئوية للأضرار التي تلحق بأوراق زراعة الأنسجة في كل مرحلة من مراحل اليرقات أكثر من 5 دقائق. (ب) مجموعة من الأضرار التي لحقت الأوراق المزروعة في التربة من قبل instar 4 أكثر من 20 دقيقة.
الشكل 3: تحليل التعبير الجيني للأوراق. يظهر في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (RT-qPCR) تحليل التعبير الجيني لعوامل نسخ إصبع الزنك C2H2. متوسط مستوى النص هو، 2−ΔCT مع (ΔCT = CT من جين الاختبار - CT من جين التحكم الخارجي). وتظهر أوراق التحكم المقتطعة في الأوراق (الزرقاء) والأوراق الموبوءة المقتطعة باللون الأحمر في كل نقطة زمنية. كل قيمة هي متوسط ثلاثة نسخ بيولوجية. تم إجراء ANOVA ثلاثية الاتجاه على قيم ΔCt. ويشار إلى وجود اختلافات كبيرة في أوراق التحكم مع مرور الوقت بحروف كبيرة. ويشار إلى اختلافات كبيرة في الأوراق الموبوءة مع مرور الوقت بأحرف صغيرة. تظهر اختلافات كبيرة بين التحكم والأوراق الموبوءة في نفس الوقت مع العلامة النجمية (*). Pr > قيم F كانت جميعأقل من 0.001، باستثناء العلاج التحكم StZFP6 مع 0.0086. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. أرقام انضمام NCBI هي: StLOX3-X96406.1, StZFP2- MK809525, StZFP4-CV500970.1, StZFP6-DN587601.1, StZFP7-DN590005.1. أرقام انضمام Spud DB من
فيديو 1: فيديو كليب من تغذية اليرقات. الثاني instar M. sexta اليرقات التغذية (أعلى) وليس تغذية (أسفل) على ورقة من أسبوعين ثقافة الأنسجة القديمة نمت نبات البطاطا. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو 2: الشكل 2A فيديو كليب (I) من تغذية اليرقات. اليرقات الثانية instar M. sexta التغذية على ورقة من أسبوعين ثقافة الأنسجة القديمة نمت نبات البطاطا. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو 3: الشكل 2A فيديو كليب (II) من تغذية اليرقات. ثالث اليرقات instar M. sexta التغذية على ورقة من أسبوعين ثقافة الأنسجة القديمة نمت نبات البطاطا. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو 4: الشكل 2A فيديو كليب (III) من تغذية اليرقات. اليرقات الرابعة التي تتغذى على ورقة من زراعة الأنسجة القديمة لمدة أسبوعين نمت نبات البطاطا. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو 5: الشكل 2A فيديو كليب (IV) من تغذية اليرقات. اليرقات الخامسة التي تتغذى على ورقة من زراعة الأنسجة القديمة لمدة أسبوعين نمت نبات البطاطا. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام المنهجيات النباتية الكاملة الأعشاب غير ضرورية لتحقيق هدف هذه الدراسة بالذات (أي فحص مجموعة من الجينات المرشحة لاستجابتها للإصابة). الفائدة الواضحة من صقل ورقة منفصلة هو تقصير الوقت الذي يستغرقه لأداء الاختبارات herbivory. يتم القضاء على الطبيعة غير العملية للنباتات كلها مع أقفاص كليب ويتم تنفيذ الاختبارات في وقت أقرب، منذ النباتات في سن 2 أسابيع يمكن استخدامها لحصاد الأوراق. كما أنه يتطلب بصمة أصغر بكثير أثناء التغذية ومساحة غرفة نمو أقل؛ على حد سواء هامة عندما تكون هذه الموارد محدودة.
يتم مواجهة الحد من هذا الفرز، أي الانفصال، عندما يتم اختبار التعبير عن الجينات الدفاعية. مفرزة نفسها يسبب استجابة الجرح، وبالتالي من المهم تقييم ما هو تأثير مفرزة على المستويات القاعدية للتعبير الدفاع الجينات. في دراسة واحدة تنطوي على محاكاة herbivory، كانت مستويات نسخة من مثبط البروتياز الجينات الدفاع المعروفة الثاني(PIN2)عالية بشكل غير متوقع في أوراق التحكم من أوراق البطاطا منفصلة من المرجح بسبب "الجرح الناجم أثناء جمع ورقة" 25.ومع ذلك، فإن تطبيق الحشرات regurgitant من M. sexta عززت إلى حد كبير مستويات التعبير الجيني PIN2. وهذا يوضح الحاجة إلى استخدام الضوابط لإثارة تأثير الانفصال عن الاستجابة للإصابة.
غالبًا ما يتم إجراء الاختبارات الورقية المنفصلة لتوفير الوقت والمكان والموارد. وقد استخدمت في الكشف عن مقاومة الأمراض الفطرية في القمح26،27،ومقاومة الحشرات في فول الصويا28 والحمص29. والقبول على نطاق واسع في دراسة الممرض الذي يسبب آفة في وقت متأخر في البطاطا30،31. ووجدت دراسة حديثة أن الاختبارات الورقية المنفصلة تعادل الاختبارات النباتية الكاملة في تحديد مقاومة الآفة المتأخرة في الحقل32.
ومع ذلك، توجد أدلة ضئيلة في المؤلفات لاستخدام أوراق منفصلة للاختبار من أجل التعبير عن الجينات الدفاعية. دراسة واحدة ملامح ستة جينات الدفاع ردا على غزو عث العنكبوت من الفاصوليا ليما منفصلة33. كما أنتجت الأوراق التقلبات التي تسببت في استجابات الدفاع في الأوراق القريبة غير الموبوءة، وهي استراتيجية معروفة للتعبير عن الجينات الدفاعية في النباتات34. على حد علمنا، لا تمضغ دراسات الأعشاب العلية حتى الآن استخدام أوراق منفصلة للحصول على اختبار للتعبير الجيني.
لم يكن StZFP2، الذي تم تعريفه سابقاً، يستجيب لإصبع الزنك C2H2، مدفوعاً بشكل كبير بالإصابة في الفحص الحالي للأوراق المنفصلة. وبصرف النظر عن الفرق الواضح من النبات كله مقابل أوراق منفصلة، استخدمت الدراسة السابقة نوع مستمر من الإصابة التي تم فيها اختبار الأنسجة النباتية للتعبير الجيني مباشرة بعد إزالة اليرقات24. وهذا يختلف عن النوع المستمر من الإصابة المستخدمة في الدراسة الحالية، حيث تبعت إزالة اليرقات فترة راحة قبل حصاد الأوراق. خلال فترة الانتعاش هذه، تنخفض مستويات StZFP2 بسرعة وقد تؤدي إلى انخفاض مستوى الحث StZFP2. كما يمكن أن تكون هناك مكونات إشارة نظامية أخرى غير محددة حتى الآن يمكن أن تسهم في زيادة الحث التي لوحظت في دراسة النبات بأكملها. وهناك احتمال آخر هو أن النصوص StZFP2 يمكن أن تكون قد بلغت ذروتها قبل 20 دقيقة وقت الحصاد. ومع ذلك، من الواضح أن الحث المثير للإعجاب لنصوص StZFP5 وStZFP7 يجعل هذا النوع من بروتوكول الإصابة وثيق الصلة بالموضوع. وثمة قيد آخر للطريقة الحالية يتمثل في عدم القدرة على استخدام يرقات التغذية الجذرية مثل دودة جذر الذرة. كما أنها لن تكون مناسبة عندما يتم دراسة الاتصالات النباتية الكاملة مثل الجذر إلى ورقة إشارة35 أو إشارة من الأوراق النظامية36،37.
يعتمد نجاح هذا البروتوكول بشكل كبير على جودة ودقة التدريج لليرقات المستخدمة في التجربة. مهارات تربية والمعرفة الأساسية من سلوك M. sexta مفيدة ولكن ليست حرجة. ومع ذلك، يمكن الحصول على يرقات صحية وجيدة وعلى مراحل تؤثر بشكل مباشر على نجاح التغذية. تدخل اليرقات فترة هادئة تسبق كل موليرقات لا تتغذى خلالهاعلى 21. ومن الواضح أن مثل هذه اليرقات لن تضر الأنسجة الورقية. الوقت المثالي لاستخدام اليرقات هو فقط بعد التحرش. كما أن مجموعة من الحشرات التي يتم تنظيمها تنموياً في مرحلة يرقات معينة سوف تحسن أيضاً من إمكانية استنساخ التعبير الجيني لأن النباتات قد تستجيب بشكل مختلف لكل مرحلة من مراحل النمو.
وسيكون الوصول إلى الحشرات مثاليا ً لتوريد اليرقات. M. sexta البيض أو اليرقات يمكن أيضا أن يؤمر من المصادر التجارية38،39 وتربية على النظام الغذائي أو المواد النباتية إلى المرحلة المناسبة. وهناك أيضا العديد من الأدوات على الانترنت التي يمكن أن تساعد في تحديد كل instar40،41،42. اليرقات التي تربى على النظام الغذائي لن تحتوي على مكونات نباتية محددة مثل symbionts الميكروبية التي اكتسبتها اليرقات التي تربى على النباتات43. قد يتم تغيير ملفات تعريف التعبير الجيني إذا كانت هذه المكونات مفقودة. قد يتم تربية اليرقات جزئيًا أو كليًا على النبات المضيف إذا كانت هذه الآثار مهمة للدراسة. حجب الطعام من الحشرات قبل بضع ساعات من تجارب التغذية يمكن أيضا تحسين سلوك التغذية. كما يمكن أن تكون اليرقات التي يتم جمعها ميدانياً قوية ومفيدة لأنها تعرضت لمستويات تغذوية سليمة، ولكن ذلك يضيف متغيراً آخر قد يكون أو لا يكون مناسباً لجميع الدراسات.
كما أن إنتاج النباتات الصحية الخالية من الحشرات ومبيدات الآفات أمر بالغ الأهمية. النباتات مع الفيروسات والآفات الحشرية والكائنات الفطرية سوف تحدث عوامل مربكة وتمثل تحديا في الحصول على البيانات القابلة للاستنساخ.
ويمكن الجمع بين العديد من نجوم اليرقات، وأعمار نباتات البطاطس وأحجام الأوراق لتخصيص البروتوكول لنوع معين من الدراسة. ويمكن أيضا تعديل طول أوقات الإصابة والحصاد. ومن المحتمل أن تتم دراسة العديد من التفاعلات الأخرى بين النباتات والحشرات باستخدام أوراق منفصلة إذا استخدمت عمليات رصد النبات بأكملها كخط أساس. اختبار ورقة منفصلة هو بديل ذات الصلة وقيمة لدراسات الأعشاب النباتية بأكملها لتحليل التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا بوب فارار وأليكسيس بارك على تزويدهما بالحشرات المستخدمة في هذه الدراسة وعلى خبرتهما في تنظيم اليرقات. شكر إضافي لمايكل بلاكبيرن وسايكات غوش للمراجعة النقدية للمخطوطة.
إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض تقديم معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأميركية.
وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
