Summary
Den presenterade metoden skapar naturliga växtätare skadade växtvävnad genom tillämpning av Manduca Sexta larver till fristående blad av potatis. Växt vävnaden är analyseras för uttryck av sex transkriptionsfaktor homologs inblandade i tidiga svar på insekt herbivory.
Abstract
Den multitrofiska karaktären av gen uttrycks studier av insektsherbivory kräver ett stort antal biologiska replikat, vilket skapar behovet av enklare, mer strömlinjeformade herbivory-protokoll. Perturbations av tugg insekter studeras vanligtvis i hela växt system. Även om hela denna organism strategi är populär, är det inte nödvändigt om liknande observationer kan replikeras i ett enda fristående blad. Antagandet är att grundläggande element som krävs för signaltransduktion är närvarande inom själva bladet. När det gäller tidiga händelser i signaltransduktion behöver celler bara ta emot signalen från den störning och överföra signalen till angränsande celler som analyseras för genuttryck.
Den föreslagna metoden ändrar helt enkelt tidpunkten för avlossning. I hela växt experiment är larverna begränsade till ett enda blad som så småningom lossnar från växten och analyseras för genuttryck. Om beställa av excision vändas om, från Jumbo i hela växt studier, till först i den fristående studien, det utfodra experiment förenklas.
Solanum tuberosum var. Kennebec sprids genom nodal överföring i en enkel vävnad kultur medium och överföras till jord för ytterligare tillväxt om så önskas. Bladen är censurerade från moderplantan och flyttas till petriskålar där utfodringsanalysen utförs med larv stadierna av M. Sexta. Skadad bladvävnad analyseras för att uttrycka relativt tidiga händelser i signaltransduktion. Gen uttrycks analys identifierade infestation-specifika Cys2-His2 (C2H2) transkriptionsfaktorer, vilket bekräftar framgången med att använda fristående blad i tidiga responsstudier. Metoden är lättare att utföra än hela växt infestationer och använder mindre utrymme.
Introduction
Herbivory sätter i rörelse en rad molekylära händelser under vilka en anläggning kan både identifiera attacken och montera ett lämpligt svar för sin överlevnad. En planta får två grundläggande ledtrådar från tugg insekter; en från den fysiska skadan på vävnaden och den andra från insektsspecifika ämnen. Skade-associerade molekylära mönster (damps) släpps som svar på skador som skapats av larv mouthparts och utlösa ett väldefinierat sår svar som resulterar i en ökning av hormonet bildar syra och transkription av försvarsgener1. En av de mest kända damps är Systemin, en polypeptid som bildas av klyvning av den större prosystemin protein efter ett löv såras2,3. Den bildar Acid sår svar är ytterligare moduleras av herbivor-associerade molekylära mönster (hamps), som kan härledas från Caterpillar saliv, Gut innehåll (regurgitant) och avföring (Frass)4. Insekter använder dessa ämnen för att antingen öka eller kringgå försvaret svar5. Transkriptionsfaktorerna vidarebefordrar sedan budskapet från hormon signaler i försvars reaktionen via reglering av nedströms försvarsgener6,7,8.
Vissa växt-insekt interaktionsstudier som används i laboratorie inställningar är av den simulerade typen, med ett mål att approximera den naturliga metoden för utfodring av insekten. Simulerad herbivory är vanligtvis åstadkommas genom att skapa konstgjorda skador på växt vävnader med olika verktyg som efterliknar den specifika mekanismen för insekt mouthparts tillräckligt för att orsaka frisättning av DAMPs och utlösa produktionen av försvarsgener. Andra insektsspecifika komponenter såsom muntliga sekret eller uppstötningar tillsätts ofta för att replikera bidraget från hamps9,10,11. Skapandet av en specifik storlek och typ av sår och tillämpningen av exakta mängder HAMPs är en fördel för dessa typer av studier och kan erbjuda mer reproducerbara resultat. Naturliga herbivory studier, där skador på växtvävnad åstadkoms genom tillämpning av fält förvärvade eller laboratorie-uppfödda insekter, är ofta mer utmanande eftersom sår-storlek och HAMP belopp styrs av insekt beteende och lägga variation i Data. De naturliga kontra simulerade metoderna och deras för-och nackdelar är väl debatterade i litteraturen12,13,14.
För att studera tidiga signalering händelser såsom transkriptionsfaktorer, en viss procent av bladet måste konsumeras i en relativt kort tid, så larver måste börja tugga omedelbart och bibehålla konsumtionen tills bladet är fryst för analys. M. Sexta är en glupsk matare på flera familjen Solanaceae växter under många av sina larvstadier, vilket gör den idealisk för att förmedla maximal skada i en relativt kort tid15. Detta är praktiskt när man studerar tidiga signalering händelser, som anläggningen svar sker nästan omedelbart efter en insekt kontakter blad ytan16,17. Den vanligen använda Clip Cage-metoden för inneslutning bevisar klumpig, eftersom flera burar skulle kräva kontinuerliga justeringar i hela experimentet för att möjliggöra avlägsnande eller tillsats av larver. Bladen måste också vara tillräckligt stora och tillräckligt starka för att stödja flera insekter som utfodrings på samma gång. Dessa typer av potatisväxter kräver en stor mängd utrymme för att observera utfodring. Larverna kommer ofta att flytta till undersidan av blad ytan som också gör utfodring observationer ganska svårt. Att använda hela växter för att utföra dessa experiment är klart omständligt.
Den aktuella studien använder fristående blad isolerade i petriskålar snarare än hela växter för att effektivisera och förenkla hela anläggningen strategi för att studera herbivory. Tillämpningen av protokollet i denna studie är begränsad till observation av en grupp av C2H2 transkriptionsfaktorer induceras tidigt i potatis blad efter växtätande skador av M. Sexta larver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: följande protokoll är utformat för en person att ställa in, göra observationer och samla in prover. Flera körningar av samma inställning kan kombineras för att öka biologisk replikering. Eventuella ytterligare repetitioner av experimentet bör inrättas vid samma tidpunkt på dagen för att eliminera eventuella dygns påverkan på genuttryck. Protokollet är utformat för att skapa 3 "angripet" blad för 5 separata skördetid punkter. Matchade kontrollblad för varje tidspunkt skapa totalt 30 prover. Experimentet kan utföras med en mängd olika löv storlekar och larvstadier, men det rekommenderas att bladstorlek, larv skede och angrepp tid vara konsekvent under hela förfarandet.
1. beredning av potatis plantorna
Anmärkning: alla steg som kräver steril teknik måste utföras i en vävnad kultur huva18,19.
- Förbered Kennebec plantlets från explantat källa.
- Förbered föröknings mediet.
- Tillsätt 4,43 g Murashige och Skoog (MS) med vitaminer pulver, 20 g sackaros och 2 g agar substitut till 1 L omvänd osmos (RO)-renat vatten i en 2 L kolv med en spin bar. Överför kolven till en rör platta och blanda. Justera pH till 5,8 med NaOH samtidigt som du fortsätter att röra.
Obs: agar löses inte upp förrän autoklaverat. - Tillsätt 1 mL konserveringsmedel/biocid och autoklav på vätske cykel i 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Ta bort medel från autoklav omedelbart efter att cykeln är klar och kyla den till 50 ° c. Överför 100 mL sterilt och kylt föröknings medium till sterila odlingskärl (t. ex. magenta eller Plantcon) med steril teknik i en vävnadskultur huva.
- Tillsätt 4,43 g Murashige och Skoog (MS) med vitaminer pulver, 20 g sackaros och 2 g agar substitut till 1 L omvänd osmos (RO)-renat vatten i en 2 L kolv med en spin bar. Överför kolven till en rör platta och blanda. Justera pH till 5,8 med NaOH samtidigt som du fortsätter att röra.
- Förbered explantmaterial.
- Få explantat källa som Kennebec utsäde potatis och ta bort alla spår av jord genom att tvätta med kran H2O. ta bort groddar och skär i 2 cm bitar med en steril skalpell.
- Sterilisera GRO bitar genom blötläggning för 15 s i 70% etanol, följt av 13 min i 1:1 Bleach (1 del RO-vatten: 1 del koncentrerad bakteriedödande/kommersiell kvalitet blekmedel). Skölj 5 gånger i sterilt H2O.
- Överför explantmaterial till sterila vävnad kultur fartyg med förökning medium i en vävnad kultur huva med hjälp av steril teknik. Överför fartyg till en växtvävnad kultur kammare och växa för 2 \ u20123 veckor eller tills plantlets form vid 24 ° c, 16 h ljus (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mörk fotoperiod.
- Förbered föröknings mediet.
- Förbered nodal-försprids vävnadsodling potatisväxter.
- Förbered nodal överföringsmedium.
Anmärkning: detta kommer att göra 10 vävnadsodling fartyg som kan användas samma dag eller kan göras i förväg och lagras vid 4 ° c tills nodal överföring.- Tillsätt 36,43 g näringsagar blandning till 1 liter RO-renat vatten i en 2 L kolv med en snurrande stång. Överför kolven till en rör platta och blanda. Justera pH till 5,8 med KOH samtidigt som du fortsätter att röra.
Obs: agar löses inte upp förrän autoklaverat. - Autoklav på vätske cykel i 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Ta bort medel från autoklav omedelbart efter att cykeln är klar och kyla den till 50 ° c. Överför 100 mL av steril kyld nodal överföring medium till sterila odlingskärl (se tabellen av material) med hjälp av steril teknik i en vävnad kultur huva.
- Tillsätt 36,43 g näringsagar blandning till 1 liter RO-renat vatten i en 2 L kolv med en snurrande stång. Överför kolven till en rör platta och blanda. Justera pH till 5,8 med KOH samtidigt som du fortsätter att röra.
- Förbered nodal sticklingar.
- Få Kennebec plantlets odlade från explantat material (producerad i steg 1.1.2). Plantlets bör ha minst 3 till 4 noder (gren punkter). Ta bort bladen med steril sax eller skalpell. Skär grenar nära huvudstammen, lämnar ca 2 mm av filial vävnad.
- Ta bort nodal sektioner från stjälken genom att skära ca 2 mm över och under varje gren punkt eller nod. Ordna nodal sticklingar i ett sterilt vävnads odlingskärl som innehåller nodal överföringsmedium (producerat i steg 1.2.1.2) i samma orientering som i föregående fartyg (förgreningen pekar uppåt).
- Överför fartyg med nodal sticklingar till en växtvävnad kultur kammare och växa för 2 \ u20123 veckor vid 24 ° c, 16 h ljus (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mörk fotoperiod.
Obs: varje nodal skärning kommer att växa till en ny plantlet. Antalet sticklingar i varje fartyg bestämmer löv storlek. Färre sticklingar som överförs per fartyg kommer att resultera i större löv. Tre plantor per fartyg kommer att ha 15 mm x 20 mm löv i 2 \ u20123 veckor.
- Förbered nodal överföringsmedium.
- Valfritt Förbered jordodlade Kennebec potatisväxter.
Anmärkning: för att producera större löv, kan nodal förväxade potatis plantlets överföras till jord.- Överför potatis plantlets odlas i nodal överföring medium till jord genom att försiktigt dra växten från mediet tills alla rot vävnad frigörs från agar.
- Överför till jord strax ovanför 1: a noden från rötterna och lätt packa jorden runt transplantatet. Vatten försiktigt för att säkerställa jordkontakt med rotsystemet.
- Förlägga i en tillväxt kammare med 16 h ljust (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mörker fotoperiod och 25/20 ° c dag/natt temperaturer.
Notera: växter är klara när de två översta helt expanderade bladen har nått den storlek som lämpar sig för analysen.
- Valfritt Förbered knölodlade potatisplantor.
Anm.: potatisplantor som odlas från knölar är större och robustare och kan vara användbara vid uppfödning av larver på växter eller om det önskas utfodring över natten.- Placera en potatisknölen 6 i djup i en 10 i kruka innehållande jord blanda kompletterat med 10 ml inblandning pelleterat långsam frige gödselmedel.
- Plats i en tillväxt kammare med 16 h ljus (140 μmol · m-2· s-1)/8 h mörk fotoperiod och 25/20 ° c dag/natt temperatur. Växter är klara cirka 30 \ u201240 dagar från tuber plantering.
Obs: Använd inte växter som har börjat blomma.
2. beredning av insekter för utfodring
- Få önskad larvstadium av M. Sexta.
Anmärkning: larver för denna studie var uppfödda på artificiell diet genom 5: e INSTAR20 och iscensatta av en erfaren individ från den egna insetary. Larverna kan också vara helt eller delvis uppfödda på växtvävnad. Larverna äter inte omedelbart före en molt och är mest benägna att äta rätt efter molt, så lämplig iscensättning är viktigt21. - Överför larver till ett lämpligt inneslutnings kärl (t. ex. 6-, 12-, 24-och vävnadskultur maträtt) beroende på larv storlek. Det bör finnas en larv per brunn i skålen.
Anmärkning: larver kan visa territoriella eller kannibalistiska beteenden utan en födokälla och kan skadas om de är inhysta tillsammans. - Valfritt Svälta larver i upp till 2 h eftersom detta kan förbättra larv utfodring.
Anmärkning: larver bör finnas i ett inneslutnings kärl lagrat i tillväxt kammaren under denna tid.
3. komponenter setup för angrepp experiment
Anmärkning: se den schematiska sammanfattningen i figur 1.
- Gör placeringsmallar för varje skördetid punkt.
Obs: det är bra att ställa in 5 olika brickor för varje skördetid punkt. Detta håller prover organiserade och gör att rätterna kan flyttas runt mer effektivt som en uppsättning utan att ändra deras arrangemang. Om beräkningar i procent av skador kommer att utföras är detta viktigt eftersom bilder före och efter angrepp måste fångas med samma brännvidd.- Få 5 robusta brickor som kan hålla en uppsättning av sex lämpligt storlek petriskålar och linje med vitt papper.
Observera: storleken på petriskål baseras på den bladstorlek som valts för utfodringsanalysen. Bladet ska passa lätt i skålen utan att vidröra sidorna. Till exempel, en 60 mm x 15 mm skålen är lämplig för löv upp till 50 mm i längd eller bredd. - Spåra en uppsättning av sex cirklar med lämplig storlek petriskål på papperet i varje bricka. Märk en uppsättning cirklar "kontroll" A, B och C och den andra "angripet" A, B och C. Märk också varje placerings mal len med lämplig skördetid.
- Få 5 robusta brickor som kan hålla en uppsättning av sex lämpligt storlek petriskålar och linje med vitt papper.
- Valfritt Sätta upp en kamera för ' framför infestation ' och ' efter infestation ' bild ta till fånga.
- Säkra en kamera på ett stativ vid lämplig brännvidd för bildfångst av alla petriskålar i placerings mal len.
- Märk skörde tidspunkt rören.
- Märk en uppsättning av 30, 1,7 mL mikrocentrifugrör som motsvarar varje cirkel i placerings mal len. Märk rören så att de på lämpligt sätt identifierar den störning (kontroll/angripet), anläggningens replikeringskorts (A, B eller C) och skördetiden (antal minuter efter infestations perioden).
- Förbered petriskålar som valts i steg 3.1.1.
- Placera en steril filter pappers skiva i var och en av de 30 Petriskålarna från steg 3.1.1. Tillsätt sterilt vatten för att fukta skivorna; Låt inte överflödigt vatten till poolen i skålen. Placera varje maträtt i var och en av de sex cirklarna i varje placerings mal len.
- Placera tre potatisplantor bredvid varje placerings mall. Se till att växterna är alla i samma ålder och relativa storlek.
4. utföra angrepp
En skördetid punkt/placerings mal len ställs in åt gången.
- Ta bort de två översta storlek matchade bladen från varje planta med steril sax och placera ett löv i kontrollen petriskål och en i den angripna petriskål för varje planta (A, B och C). Utför denna process så snabbt som möjligt.
- Valfritt Överför placerings mal len till kamerastativet för att fånga en "före infestation"-bild.
- Överför larver till varje angripet skålen med hjälp av Soft Touch pincett så snabbt som möjligt. Ställ in timern för önskad "infestation" tid.
Anmärkning: den tid då larver konsumerar blad vävnaden är "infestation tid". Detta är något som kan bestämmas empiriskt med hjälp av några test blad/larver innan själva infestationen påbörjas. Den valda "infestation tid" bör vara konsekvent för alla angripna blad.
Obs: larverna ska hanteras varsamt med Soft Touch-tång. 2: a till 4: e INSTAR kan vara förstått försiktigt av deras horn eller midsection. - Observera utfodring för att se till att alla larver äter. Larver bör läggas till/tas bort baserat på utfodring beteende. Håll locken på Petriskålarna så mycket som möjligt.
Obs: flera larver kan användas per blad. - Ta bort larver från bladen i slutet av angrepp tid. Starta timern för skördetiden.
- Valfritt Överför placerings mal len till kamerastativet för att fånga "after infestation"-bilden.
Obs: alla sex bladen i placerings mal len skördas vid den specifika skördetiden.
5. skörd löv
- Överför varje blad till motsvarande märkta röret i slutet av varje skördetid punkt och omedelbart frysa genom att släppa röret i flytande N2. Förvara den skördade växt vävnaden vid-80 ° c tills isoleringen av RNA.
- Upprepa steg 4 \ u 20125.1 för varje skördetid punkt.
6. bearbetning av bladvävnad för gen uttrycks analys
- Slipa den frysta blad vävnaden till ett pulver med en micropestle.
- Isolera totalt RNA och process för genuttryck som tidigare beskrivits22.
7. (valfritt) uppskatta löv skador
- Visuellt uppskatta procent av löv skador eller beräkna löv område i före-och efter infestation bilder.
- Mäta Leaf område med programvara verktyg (t. ex., Phenophyte)23.
- Från löv områdes mätningar, beräkna procentandel skador som
% Damage = [(löv område före-löv område efter)/Leaf område före] x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Löv förbrukning definierar protokollets framgång. Friska, noggrant iscensatta larver bör börja utfodra omedelbart efter placeringen på bladytan och utfodring bör fortsätta på ett ganska konsekvent sätt under hela angrepp tid. I video 1börjar larven på toppen att tugga omedelbart efter placeringen och upprätthåller en jämn takt vid utfodring. Detta är särskilt viktigt om man angriper tidiga gen uttrycks händelser efter angrepp. Larven i botten har inte förbruka något löv material och är ett exempel på ett misslyckat angrepp.
Visuella approximationer under löv förbrukning övervakas för att säkerställa tillräcklig skada produceras. Mängden löv material som förbrukas kan beräknas som andelen skador genom att använda bilder av löv före och efter infestationen. Figur 2 illustrerar den rörliga konsumtionen i olika utvecklingsstadier av M. Sexta -larver på olika typer av potatisväxter. Bladen i figur 2A var lossade från 2-veckors gamla nodal-propagerade vävnad kulturväxter. Alla bladen i denna siffra är av samma storlek men utsattes för angrepp av olika stadier av larver för 5 min. figur 2A: i-IV, video 2, video 3, Video 4och video 5 illustrerar de olika frekvenserna av konsumtion och utfodring stilar för varje larv skede från en del av infestationen. Detta är till hjälp för att avgöra hur mycket skada som är möjligt med hjälp av varje löv och larv skede kombination och illustrerar den glupsk karaktären hos de äldre larver. Användningen av 1st INSTAR larver rekommenderas inte eftersom deras underkäkarna inte utvecklas tillräckligt för att producera skador i 5 min angrepp fönster. Det är viktigt att notera att yngre mer anbud bladen härrör från vävnad-kulturodlade växter är ofta mer tilltalande för larver. Baserat på dessa resultat valdes 4: e INSTAR larver för att ytterligare bedöma skador på löv från mer mogna, jordodlade potatisplantor. Jorden odlade växter närmare approximera de som förvärvats i fältet. Figur 2b illustrerar skade intervallet när de tredje och fjärde INSTAR larverna applicerades på löv som lossnat från jordodlade potatisplantor. Två veckor gamla nodal förväxlade växter transplanterades till jord och odlas i ytterligare 3 veckors. Skadade blad från jord odlade växter föll i tre grupper; 15-20%, 20-30% och 30-40%. De tre bladen i varje grupp visas för att representera de olika nivåerna av skador för varje intervall. Bladen från mer mogna jordodlade växter behövde fler larver appliceras och en längre angrepp tid att nå samma nivå av skador som observerats i bladen från yngre nodal-förökat växter. Dessa resultat illustrerar utbudet av utfall möjligt från framgångsrika herbivory från olika typer av växter.
Efter framgångsrik herbivory är klar och procent skador bedöms, bladvävnad är analyseras för genuttryck. Resultat av genuttryck bör indikera en robust induktion eller förtryck av transkriptioner involverade i responsen på infestation. Figur 3 illustrerar genuttrycksprofiler av sex C2H2 transkriptionsfaktorer från ett lyckat herbivory experiment i fristående blad. C2H2 Zinc finger StZFP2 inducerades av M. Sexta herbivory i potatisen i föregående hela växt studier24. Även om StZFP2 inducerades av herbivory i den fristående löv analysen, var angrepp inte signifikant jämfört med effekten av själva avlossning. Emellertid, två andra StZFP2 Homologs, StZFP5 och StZFP7, var signifikant induceras vid 40 och 80 min post herbivory jämfört med fristående kontroller. StLOX3 och StMYC2 är markörgener inducerade av både skadade och herbivory och indikerar medverkan av bildar Acid reglerade försvars vägar. Målet med denna specifika studie var att identifiera infestation-Responsive transkriptionsfaktorer bland en panel av kandidatgener. Identifieringen av två C2H2 zink finger transkriptionsfaktorer som är robust lyhörd för M. Sexta herbivory stöder användningen av fristående blad för angrepp analyser.
Bild 1: flödesschema för angrepp-protokollet. Schematisk representation av de steg som ingår i det experimentella arbetsflödet för angrepp-delen av protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: blad skador orsakade av M. Sexta -larver. A) procentuella skador på vävnads kulturen lämnar vid varje larvstadium över 5 min. romerska siffror I-IV hänvisar till videor 2-5 respektive som visar varje INSTAR utfodring på bladet avbildad. (B) rad skador på jordodlade blad med 4: e INSTAR över 20 min. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: gen uttrycks analys av löv. Real tids kvantitativ polymeras kedjereaktion (RT-qPCR) gen uttrycks analys av C2H2 zink finger transkriptionsfaktorer visas. Medel avskrift jämnar är, 2− δct med (δct = CT av testar genen-CT av EXOGEN kontrollera genen). Censurerade kontrollblad i (blå) och exciderade angripet löv i (röd) visas vid varje tidpunkt. Varje värde är genomsnittet av tre biologiska replikat. Trevägsanova utfördes på ΔCt-värdena. Signifikanta skillnader i kontroll bladen över tid indikeras med versaler. Signifikanta skillnader i angripna blad över tiden anges i gemena bokstäver. Signifikanta skillnader mellan kontroll och angripna blad vid samma tidpunkt visas med en asterisk (*). PR > F-värden var alla mindre än 0,001, med undantag för StZFP6 kontroll behandling med 0,0086. Felstaplar representerar standardavvikelse. NCBI anslutningsnummer är: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. Spud DB anslutningsnummer från < http://Solanaceae.plantbiology.msu.edu > är StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. Denna siffra har modifierats från22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: videoklipp av larv utfodring. Andra INSTAR M. Sexta -larver som matar (överst) och inte matar (botten) på ett blad från två veckors gammal vävnadsodling som odlas på potatisplanta. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video 2: bild 2a videoklipp (i) av larv utfodring. Andra INSTAR M. Sexta larv utfodring på ett blad från två veckors gammal vävnadsodling odlas potatis växt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video 3: figur 2A videoklipp (II) av larv matning. Tredje INSTAR M. Sexta larv utfodring på ett blad från två veckors gammal vävnadsodling odlas potatis växt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video 4: figur 2A videoklipp (III) av larv matning. Fjärde INSTAR M. Sexta larv utfodring på ett blad från två veckors gammal vävnadsodling odlas potatis växt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Video 5: bild 2a videoklipp (IV) av larv utfodring. Femte INSTAR M. Sexta larv utfodring på ett blad från två veckors gammal vävnadsodling odlas potatis växt. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av befintliga hela växtherbivory metoder är onödigt att uppnå målet med denna särskilda studie (dvs, skärm en uppsättning av kandidatgener för deras svar på angrepp). Den uppenbara fördelen med den fristående blad förfining är förkorta den tid det tar att utföra herbivory analyser. Den otympliga naturen hos hela växter med Clip burar elimineras och analyser utförs förr, eftersom växter så unga som 2 veckor kan användas för att skörda löv. Det kräver också en mycket mindre fotavtryck under utfodring och mindre tillväxt kammare utrymme; båda är viktiga när dessa resurser är begränsade.
Begränsningen av denna analys, nämligen avlossning, påträffas när försvar-genuttryck är analyseras. Avlossning i sig orsakar ett sårsvar och det är därför viktigt att bedöma vilken effekt avlossning har på basal nivåer av försvar-genuttryck. I en studie med simulerad herbivory, avskrift nivåer av en välkänd försvar gen proteashämmare II(PIN2) var oväntat hög i kontroll bladen av fristående potatis blad sannolikt på grund av "skadade orsakade under insamling av blad" 25. emellertid, tillämpning av insekt regurgitant från M. Sexta kraftigt förbättrade nivåer av PIN2 -genuttryck. Detta illustrerar behovet av att använda kontroller för att locka fram effekten av avlossning från angrepp svar.
Fristående löv analyser utförs ofta för att spara tid, utrymme och resurser. De har använts i screening för resistens mot svampsjukdomar i vete26,27, och insekt motstånd i sojabönor28 och kikärtor29. Analysen är allmänt accepterad i studiet av patogenen som orsakar sena Blight i potatis30,31. En nyligen studie fann att fristående blad analyser var likvärdiga med hela växten analyser för att fastställa sena Blight motstånd i fältet32.
Knappa bevis finns i litteraturen, dock, för användning av fristående blad till assay för försvar-genuttryck. En studie profilerade sex försvarsgener som svar på spindel kvalster angrepp av fristående Lima Bean33. Bladen producerade också flyktiga ämnen som inducerade försvarsreaktioner i närliggande oangripet löv, en välkänd strategi för försvar-genuttryck i växter34. Till vår kännedom, ingen tugga insekt herbivory studier hittills utnyttja fristående blad till assay för genuttryck.
Den tidigare definierade angrepp Responsive C2H2 zink finger, StZFP2 var inte signifikant induceras av angrepp i den nuvarande fristående blad analysen. Bortsett från den uppenbara skillnaden av hela växten kontra fristående blad, utnyttjade den tidigare studien en kontinuerlig typ av angrepp där växtvävnad var analyseras för genuttryck omedelbart efter avlägsnande av larverna24. Detta skiljer sig från den diskontinuerliga typ av angrepp utnyttjas i den aktuella studien, där larv avlägsnande följdes av en viloperiod före blad skörd. Under denna återhämtningsperiod minskar StZFP2 nivåer snabbt och kan resultera i en lägre nivå av StZFP2 induktion. Det kan också finnas andra så långt odefinierade systemiska signalering komponenter som kan bidra till den förstärkta induktion observerats i hela växten studien. En annan möjlighet är att StZFP2 utskrifter kunde ha nått sin kulmen före 20 min skördetid. Det är dock tydligt att den imponerande induktion av StZFP5 och StZFP7 utskrifter gör denna typ av angrepp protokoll relevant. En annan begränsning av den nuvarande metoden skulle vara oförmågan att använda rot utfodring larver såsom majs Rootworm. Det skulle inte heller vara lämpligt när hela anläggningen kommunikation som root till Leaf signalering35 eller signalering från systemiska blad36,37 studeras.
Framgången för detta protokoll beror mycket på kvaliteten och korrekt iscensättning av larv som används i experimentet. Uppfostra färdigheter och grundläggande kunskaper om M. Sexta beteende är bra men inte kritisk. Men att få friska, lämpligt iscensatta larver kan direkt påverka utfodring framgång. Larverna går in i en quiescent period som föregår varje larver molt under vilken de inte matar21. Klart, sådana larver kommer inte att skada bladvävnad. Den idealiska tiden att använda larver är strax efter en molt. En utvecklingsiscensatt kohort av insekter av ett visst larv skede kommer också att förbättra reproducerbarheten av genuttryck som växter kan reagera olika på varje utvecklingsstadiet.
Tillgång till en insetary skulle vara perfekt för leverans av larver. M. Sexta ägg eller larver kan också beställas från kommersiella källor38,39 och föds upp på diet eller växtmaterial till lämpligt stadium. Det finns också flera online-verktyg som kan hjälpa till att identifiera varje INSTAR40,41,42. Larverna som föds upp i kosten kommer inte att innehålla växtspecifika komponenter såsom mikrobiella symbionter som förvärvats av larver som fötts upp på växter43. Genuttrycksprofiler kan ändras om dessa komponenter saknas. Larverna kan vara helt eller delvis uppfödda på värd växten om dessa effekter är viktiga för studien. Att undanhålla livsmedel från insekter ett par timmar före utfodring experiment kan också förbättra utfodring beteende. Fält-insamlade larver kan också vara robust och fördelaktigt eftersom de har utsatts för ordentlig trofiska nivåer, men som tillför en annan variabel som kan eller inte lämpar sig för alla studier.
Produktionen av friska, insekts-och bekämpningsmedelsfria växter är också kritisk. Växter med virus, skadeinsekter och svamp organismer kommer att introducera confounding faktorer och presentera en utmaning för att få reproducerbara data.
Många larv instars, potatis växt åldrar och löv storlekar kan kombineras för att anpassa protokollet för en viss typ av studie. Även längden på infestationen och skörde tiderna kan justeras. Potentiellt, många andra växt-insekt interaktioner kan studeras med hjälp av fristående blad om hela anläggningen observationer används som en baslinje. Den fristående löv analysen är ett relevant och värdefullt alternativ till hela växtherbivory studier för att analysera genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Bob Farrar och Alexis Park för att ge insekter som används i denna studie och för deras expertis i larv iscensättning. Ytterligare tack till Michael Blackburn och Saikat Ghosh för kritisk granskning av manuskriptet.
Omnämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande av det amerikanska jordbruksdepartementet.
USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
