Summary
De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.
Abstract
De Multitrofische aard van genexpressie studies van insecten ivoren eist grote aantallen biologische replicaten, waardoor de behoefte aan eenvoudigere, meer gestroomlijnde ivoren protocollen ontstaat. Perturbaties van vretende insecten worden meestal bestudeerd in hele planten systemen. Hoewel deze hele organisme strategie populair is, is het niet nodig als vergelijkbare waarnemingen in één vrijstaand blad kunnen worden gerepliceerd. De veronderstelling is dat de basiselementen die nodig zijn voor signaaltransductie aanwezig zijn in het blad zelf. In het geval van vroege gebeurtenissen in signaaltransductie hoeven cellen alleen het signaal van de perturbatie te ontvangen en dat signaal door te geven aan naburige cellen die worden aangevallen voor genexpressie.
De voorgestelde methode verandert eenvoudigweg de timing van het detachement. In hele planten experimenten zijn larven beperkt tot een enkel blad dat uiteindelijk loskomt van de plant en wordt aangevallen voor genexpressie. Als de volgorde van excisie wordt omgekeerd, van de laatste in hele planten studies, tot de eerste in de losgekoppelde studie, wordt het Voer experiment vereenvoudigd.
Solanum tuberosum var. Kennebec wordt door Nodale Transfer in een eenvoudig weefselkweek medium vermeerderd en naar de bodem overgebracht voor verdere groei indien gewenst. De bladeren worden uit de moederplant weggesneden en naar Petri schalen verplaatst waar de voedings test wordt uitgevoerd met de larvale stadia van M. sexta. Beschadigd blad weefsel wordt getest voor de expressie van relatief vroege gebeurtenissen in signaaltransductie. Genexpressie analyse identificeerde infestatie-specifieke Cys2-His2 (C2H2) transcriptiefactoren, ter bevestiging van het succes van het gebruik van losgekoppelde bladeren in vroege respons studies. De methode is gemakkelijker uit te voeren dan hele planten besmettingen en gebruikt minder ruimte.
Introduction
Herbivory zet een reeks moleculaire gebeurtenissen in gang waarbij een plant zowel de aanval kan identificeren als een passende respons voor zijn overleving aankoppelt. Een plant krijgt twee basis aanwijzingen van vretende insecten; een van de fysieke schade aan het weefsel en de andere van insecten-specifieke stoffen. Schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) worden vrijgegeven in reactie op schade door larvale mondstukken en leiden tot een goed gedefinieerde wond respons die resulteert in een toename van het hormoon jasmonic zuur en de transcriptie van Defense genen1. Een van de bekendste Damps is systemIn, een polypeptide dat wordt gevormd door het decolleté van het grotere prosystemine eiwit nadat een blad is verwond2,3. De reactie van jasmonic acid wond wordt verder gemoduleerd door herbivore-geassocieerde moleculaire patronen (HAMPs), die kunnen worden afgeleid van Caterpillar speeksel, darminhoud (regurgitant) en ontlasting (frass)4. Insecten gebruiken deze stoffen om de afweerreactie5te stimuleren of te omzeilen. Transcriptiefactoren dan de boodschap doorgeven van hormoon signalen in de verdediging reactie via regulering van downstream verdediging genen6,7,8.
Sommige planten-insecten interactiestudies gebruikt in laboratorium instellingen zijn van het gesimuleerde type, met een doelstelling van de benadering van de natuurlijke methode van het voeden door het insect. Gesimuleerde ivoren wordt meestal bereikt door het creëren van kunstmatige schade aan plantenweefsels met verschillende gereedschappen die het specifieke mechanisme van insecten mondstukken voldoende nabootsen om de vrijlating van Damps te veroorzaken en de productie van verdedigings genen te triggeren. Andere insectenspecifieke componenten zoals orale afscheidingen of regurgitant worden vaak toegevoegd om de bijdrage van hamps9,10,11te repliceren. Het creëren van een specifieke grootte en type wond en de toepassing van precieze hoeveelheden HAMPs is een voordeel voor dit soort studies en kan meer reproduceerbare resultaten bieden. Natuurlijke ivoren studies, waarbij beschadiging van het plantenweefsel wordt bewerkstelligd door de toepassing van in het veld verworven of door laboratoria opgefokt insecten, zijn vaak uitdagender, omdat de bedragen van wond grootte en Hamp worden beheerst door insecten gedrag en variabiliteit toevoegen aan de Gegevens. De natuurlijke versus gesimuleerde methoden en hun voor-en nadelen zijn goed besproken in de literatuur12,13,14.
Om vroege signalering van gebeurtenissen zoals transcriptiefactoren te bestuderen, moet een bepaald percentage van het blad in relatief korte tijd worden verbruikt, dus larven moeten onmiddellijk beginnen te kauwen en het verbruik behouden totdat het blad is bevroren voor analyse. M. sexta is een vraatzuchtige feeder op meerdere nachtschadeachtigen planten tijdens veel van zijn larvale stadia, waardoor het ideaal is voor het impareren van maximale schade in relatief korte tijd15. Dit is handig bij het bestuderen van vroege signalering van gebeurtenissen, als de reactie van de plant komt bijna onmiddellijk na een insect contact op met het blad oppervlak16,17. De veelgebruikte clip Cage-methode van containment bewijst onhandig, omdat meerdere kooien tijdens het experiment voortdurend moeten worden aangepast om de verwijdering of toevoeging van larven mogelijk te maken. De bladeren moeten ook groot genoeg en sterk genoeg zijn om meerdere insecten voeden tegelijkertijd te ondersteunen. Deze soorten aardappelplanten vereisen een grote hoeveelheid ruimte om de voeding te observeren. Larven zullen vaak naar de onderzijde van het bladoppervlak verhuizen, wat het voeren van waarnemingen ook heel moeilijk maakt. Het gebruik van hele planten om deze experimenten uit te voeren is duidelijk omslachtig.
De huidige studie maakt gebruik van losstaande bladeren geïsoleerd in Petri schalen in plaats van hele planten te stroomlijnen en vereenvoudigen van de hele plant aanpak voor het bestuderen van herbivory. De toepassing van het protocol in deze studie is beperkt tot de waarneming van een groep van C2H2 transcriptiefactoren die vroeg in aardappel bladeren zijn geïnduceerd na herbivante schade door M. sexta larven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: het volgende protocol is bedoeld voor het instellen van een persoon, het maken van observaties en het verzamelen van samples. Meerdere uitvoeringen van dezelfde Setup kunnen worden gecombineerd om de biologische replicatie te verhogen. Eventuele extra herhalingen van het experiment moeten op hetzelfde moment van de dag worden ingesteld om mogelijke diurnale invloeden op genexpressie te elimineren. Het protocol is ontworpen om 3 ' besmette ' Bladeren te maken voor 5 afzonderlijke oogsttijd punten. De overeenkomende controle bladeren voor elk tijdspunt maken in totaal 30 samples. Het experiment kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan blad groottes en larvale stadia, maar het wordt aanbevolen om de blad grootte, de larvale fase en de infestatie tijd consistent te laten zijn gedurende de hele procedure.
1. bereiding van de aardappelplanten
Opmerking: alle stappen die een steriele techniek vereisen, moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap18,19.
- Bereid Kennebec plantlets van explant source.
- Het propagatie medium voorbereiden.
- Voeg 4,43 g Murashige en Skoog (MS) toe met vitaminen poeder, 20 g sucrose en 2 g agar-substituut aan 1 L omgekeerde osmose (RO)-gezuiverd water in een kolf van 2 L met een spin bar. Breng de kolf over in een roer plaat en meng. Stel de pH in op 5,8 met NaOH terwijl je doorgaat met roeren.
Opmerking: agar zal niet oplossen tot autoclaved. - Voeg gedurende 20 minuten (121 °C, 101,3 kPa) 1 mL conserveringsmiddel/biocide en autoclaaf toe aan de vloeistof cyclus. Verwijder het medium van autoclaaf onmiddellijk nadat de cyclus is voltooid en koel het af tot 50 °C. Breng 100 mL steriel en gekoeld voortplantings medium over naar steriele kweekvaten (bijv. magenta of Plantcon) met behulp van steriele techniek in een weefselkweek afzuigkap.
- Voeg 4,43 g Murashige en Skoog (MS) toe met vitaminen poeder, 20 g sucrose en 2 g agar-substituut aan 1 L omgekeerde osmose (RO)-gezuiverd water in een kolf van 2 L met een spin bar. Breng de kolf over in een roer plaat en meng. Stel de pH in op 5,8 met NaOH terwijl je doorgaat met roeren.
- Bereid explant materiaal voor.
- Verkrijg een explant bron als Kennebec pootaardappelen en verwijder alle sporen van de bodem door te wassen met tap H2O. Verwijder spruiten en snijd in stukjes van 2 cm met een steriel scalpel.
- Steriliseren kiem stukken door te weken voor 15 s in 70% ethanol, gevolgd door 13 min in 1:1 bleekmiddel (1 deel RO-water: 1 deel geconcentreerde germicide/commerciële kwaliteit Bleach). Spoel 5 keer in steriele H2O.
- Breng explant materiaal over naar steriele weefselkweek vaten met propagatie medium in een weefsel cultuurkap met behulp van steriele techniek. Overdracht van schepen naar een plantenweefsel kweekkamer en groeien voor 2 \ u20123 weken of tot plantlets vorm bij 24 °C, 16 h licht (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Dark photoperiod.
- Het propagatie medium voorbereiden.
- Bereid nodal-Propagated weefselkweek aardappelplanten.
- Maak Nodale Transfer medium klaar.
Let op: dit maakt 10 weefselkweek vaten die op dezelfde dag kunnen worden gebruikt of die van tevoren kunnen worden gemaakt en bewaard bij 4 °C tot de nodale overdracht.- Voeg 36,43 g nutriënt agar-mix toe aan 1 L RO-gezuiverd water in een kolf van 2 L met een spin bar. Breng de kolf over in een roer plaat en meng. Stel de pH in op 5,8 met KOH terwijl je doorgaat met roeren.
Opmerking: agar zal niet oplossen tot autoclaved. - Autoclaaf op vloeibare cyclus gedurende 20 min (121 °C, 101,3 kPa). Verwijder het medium van autoclaaf onmiddellijk nadat de cyclus is voltooid en koel het af tot 50 °C. Breng 100 mL steriel gekoeld Nodale Transfer medium over naar steriele kweekvaten (Zie de tabel met materialen) met behulp van steriele techniek in een weefselkweek afzuigkap.
- Voeg 36,43 g nutriënt agar-mix toe aan 1 L RO-gezuiverd water in een kolf van 2 L met een spin bar. Breng de kolf over in een roer plaat en meng. Stel de pH in op 5,8 met KOH terwijl je doorgaat met roeren.
- Maak Nodale stekken.
- Verkrijg Kennebec plantlets gekweekt uit explant materiaal (geproduceerd in stap 1.1.2). Plantlets moeten ten minste 3 tot 4 knooppunten (vertakkingspunten) hebben. Verwijder bladeren met steriele schaar of scalpel. Snijd takken dicht bij de hoofdsteel en laat ongeveer 2 mm van het weefsel van de tak.
- Verwijder Nodale secties uit de Steel door ongeveer 2 mm boven en onder elk vertakkingspunt of knooppunt te snijden. Leg de nodale stekken in een steriel weefsel cultuurvat met Nodale Transfer medium (geproduceerd in stap 1.2.1.2) in dezelfde richting als in het vorige vaartuig (naar boven gericht).
- Transfer schepen met Nodale stekken naar een plantenweefsel kweekkamer en groeien voor 2 \ u20123 weken bij 24 °C, 16 uur licht (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Dark photoperiod.
Let op: elk Nodale snijden zal uitgroeien tot een nieuwe plantlet. Het aantal stekken in elk vat bepaalt de blad grootte. Minder stekken die per vat worden overgebracht, resulteren in grotere bladeren. Drie planten per vat zullen 15 mm x 20 mm bladeren in 2 \ u20123 weken.
- Maak Nodale Transfer medium klaar.
- Optionele Bereid grond geteelde Kennebec aardappelplanten.
Opmerking: om grotere bladeren te produceren, kunnen Nodale gekweekte aardappel plantjes worden overgebracht naar de bodem.- Breng aardappel plantlets in Nodale Transfer medium over naar de grond door de plant voorzichtig van het medium te trekken totdat al het wortel weefsel uit de agar wordt losgelaten.
- Overdracht naar de bodem net boven de 1ste knooppunt van de wortels en pak licht de grond rond de transplantatie. Water zachtjes om het bodemcontact met het wortelsysteem te verzekeren.
- Plaats in een groei kamer met 16 h licht (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Dark fotoperiode en 25/20 °c dag/nacht temperaturen.
Opmerking: planten zijn klaar wanneer de bovenste twee volledig geëxpandeerde bladeren de maat hebben bereikt die geschikt is voor de assay.
- Optionele Aardappelplanten voor knolgewassen bereiden.
Let op: aardappelplanten gekweekt uit knollen zijn groter en robuuster en kunnen nuttig zijn als het fokken van larven op planten of als een nachtelijke larvale voeding gewenst is.- Plaats een aardappel Knol 6 diep in een 10 in pot bevattende bodem mengsel aangevuld met 10 mL pellets met langzame afgifte.
- Plaats in een groei kamer met 16 h licht (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Dark fotoperiode en 25/20 °c dag/nacht temperatuur. Planten zijn klaar ongeveer 30 \ u201240 dagen van Knol aanplant.
Opmerking: gebruik geen planten die beginnen te bloeien.
2. bereiding van insecten voor het voederen
- Verkrijg de gewenste larvale fase van M. sexta.
Let op: larven voor deze studie werden gekweekt op kunstmatige voeding via de 5e INSTAR20 en geënsceneerd door een ervaren individu van de in-House insectaire. Larven kunnen ook gedeeltelijk of volledig op plantenweefsel worden gekweekt. Larven eten niet onmiddellijk voor een molt en zijn het meest geneigd om direct na het molt te eten, dus de juiste enscenering is belangrijk21. - Breng larven over naar een geschikt containmentvat (bijv. 6-, 12-, 24-goed weefselkweek schotel), afhankelijk van de grootte van de larvale. Er moet één larve per put in het gerecht.
Opmerking: larven kunnen territoriaal of Kannibalistisch gedrag vertonen zonder voedselbron en kunnen gewond raken als ze bij elkaar worden ondergebracht. - Optionele STARVE larven voor maximaal 2 uur omdat dit de larvale voeding kan verbeteren.
NB: larven moeten in deze periode in een containmentvat zijn opgeslagen in de groei kamer.
3. installatie van onderdelen voor het infestatie-experiment
Opmerking: Zie de schematische samenvatting in afbeelding 1.
- Maak plaatsings sjablonen voor elk oogst tijdpunt.
Opmerking: het is handig om 5 verschillende trays in te stellen voor elk oogst tijdpunt. Dit houdt monsters georganiseerd en maakt het mogelijk om de gerechten efficiënter te verplaatsen als een set zonder hun arrangement te veranderen. Als berekeningen van het percentage van de schade worden uitgevoerd, is dit essentieel omdat er vóór-en nainfestatie beelden moeten worden vastgelegd met dezelfde brandpuntsafstand.- Verkrijg 5 robuuste trays die in staat zijn om een set van zes passend formaat Petri schalen en lijn met wit papier te houden.
Opmerking: de grootte van de Petri schaal is gebaseerd op de blad grootte die is gekozen voor de toevoer test. Het blad moet gemakkelijk in de schaal passen zonder de zijkanten aan te raken. Bijvoorbeeld, een 60 mm x 15 mm schaal is geschikt voor bladeren tot 50 mm in lengte of breedte. - Traceer een set van zes cirkels met behulp van de passend formaat Petri schaal op het papier in elke lade. Label één set cirkels ' controle ' A, B en C en de andere ' besmet ' A, B en C. Label elke plaatsings sjabloon ook met de juiste oogsttijd.
- Verkrijg 5 robuuste trays die in staat zijn om een set van zes passend formaat Petri schalen en lijn met wit papier te houden.
- Optionele Stel een camera in voor ' Before infestatie ' en ' After infestatie ' beeldopname.
- Beveilig een camera op een stand op de juiste brandpuntsafstand voor het vastleggen van alle Petri schalen in de plaatsings sjabloon.
- Label van de oogsttijd punt buizen.
- Label een set van 30, 1,7 mL micro centrifugebuizen overeenkomend met elke cirkel in de plaatsings sjabloon. Label de buisjes om de perturbatie (controle/besmetting), de replicatie letter van de installatie (A, B of C) en het oogsttijd punt (aantal minuten na besmetting periode) adequaat te identificeren.
- Bereid de in stap 3.1.1 gekozen Petri schaaltjes.
- Plaats een steriele filtreer schijf in elk van de 30 Petri schalen uit stap 3.1.1. Voeg steriel water toe om de schijven te bevochtigen; Laat geen overtollig water in het gerecht. Plaats elk gerecht in elk van de zes cirkels in elke plaatsings sjabloon.
- Plaats drie aardappelplanten naast elke plaatsings sjabloon. Zorg ervoor dat planten allemaal dezelfde leeftijd en relatieve grootte hebben.
4. het uitvoeren van besmetting
Opmerking: één oogst tijdpunt/plaatsings sjabloon is ingesteld op een tijdstip.
- Verwijder de bovenste twee maat blaadjes van elke plant met een steriele schaar en plaats één blad in de Control petrischaal en één in de besmette Petri schaal voor elke plant (A, B en C). Voer dit proces zo snel mogelijk uit.
- Optionele Breng de plaatsings sjabloon over naar de camera standaard om een ' Before infesting'-afbeelding vast te leggen.
- Breng de larven zo snel mogelijk aan op elk besmet gerecht met behulp van een zacht aanvoelend Tang. Stel de timer in voor de gewenste ' infestatie ' tijd.
Opmerking: de periode waarin larven het blad weefsel consumeren, is de ' infestatie tijd '. Dit is iets dat kan worden bepaald empirisch met behulp van een paar test bladeren/larven voor het begin van de eigenlijke besmetting. De gekozen "infestatie tijd" moet consistent zijn voor alle besmette bladeren.
Opmerking: larven moeten voorzichtig worden behandeld met een soft-touch Tang. 2e tot en met 4e INSTAR kan zachtjes worden opgepakt door hun hoorn of buik. - Observeer de voeding om ervoor te zorgen dat alle larven eten. Larven moeten worden toegevoegd/verwijderd op basis van voedingsgedrag. Houd de deksels zo veel mogelijk op de Petri schalen.
Opmerking: er kunnen meerdere larven per blad worden gebruikt. - Verwijder larven uit de bladeren aan het einde van de infestatie tijd. Start de timer voor de oogsttijd.
- Optionele Breng de plaatsings sjabloon over naar de camera standaard om de ' After infesting'-afbeelding vast te leggen.
Opmerking: alle zes bladeren in de plaatsings sjabloon worden geoogst op de specifieke oogsttijd.
5. oogst bladeren
- Breng elk blad naar de corresponderende gelabelde buis aan het einde van elk oogst tijdpunt en Vries onmiddellijk door de buis in vloeistof N2te laten vallen. Bewaar het geoogste plantenweefsel bij-80 °C tot de isolatie van RNA.
- Herhaal stap 4 \ u 20125.1 voor elk oogsttijd punt.
6. verwerking van blad weefsel voor genexpressie analyse
- Slijp het bevroren blad weefsel tot een poeder met een micro stamper.
- Isoleer totaal RNA en proces voor genexpressie zoals eerder beschreven22.
7. (optioneel) blad beschadiging inschatten
- Het percentage van de blad beschadiging visueel inschatten of het blad gebied berekenen in de voor-en nainfestatie beelden.
- Meet blad gebied met software tools (bijv. Phenophyte)23.
- Van de afmetingen van het blad gebied, bereken het percentage schade
% schade = [(blad gebied vóór – blad gebied na)/Leaf gebied vóór] x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leaf-verbruik definieert het succes van het protocol. Gezonde, nauwkeurig geënsceneerde larven moeten onmiddellijk na de plaatsing op het bladoppervlak gaan voeden en de voeding moet op een vrij consistente manier gedurende de infestatie tijd worden voortgezet. In Video 1begint de larve aan de bovenkant onmiddellijk na de plaatsing te kauwen en behoudt een consistente snelheid tijdens het voeden. Dit is vooral belangrijk als u vroege genexpressie gebeurtenissen na besmetting aszegt. De larve aan de onderzijde consumeert geen blad materiaal en is een voorbeeld van een mislukte besmetting.
Visuele benaderingen tijdens het gebruik van het blad worden bewaakt om te zorgen dat er voldoende schade wordt geproduceerd. De hoeveelheid gebruikte blad materiaal kan worden berekend als het percentage van de schade door het gebruik van afbeeldingen van bladeren voor en na de infestatie. Figuur 2 illustreert de variabele verbruikspercentages door verschillende ontwikkelingsstadia van M. sexta larven op verschillende soorten aardappelplanten. De bladeren in Fig. 2a werden losgemaakt van 2 weken oude, door de nodal gekweekte weefselkweek planten. Alle bladeren in deze afbeelding zijn van dezelfde grootte, maar werden onderworpen aan infestatie door verschillende stadia van larven gedurende 5 min . afbeelding 2a: I-IV, video 2, Video 3, video 4en video 5 illustreren de verschillende tarieven van consumptie-en voeder stijlen voor elke larvale fase van een deel van de infestatie. Dit is handig bij het bepalen hoeveel schade mogelijk is met elk blad en larvale stage combinatie en illustreert de vraatzuchtige aard van de oudere larven. Het gebruik van 1st instar larven wordt niet aanbevolen omdat hun onderkaken niet genoeg zijn ontwikkeld om schade te veroorzaken in het 5 min besmettingen venster. Het is belangrijk op te merken dat jongere meer Tender bladeren afgeleid van weefsel-cultuur-gekweekte planten zijn vaak meer verteerbaar voor larven. Op basis van deze resultaten werden 4e instar larven gekozen om de schade aan bladeren van volwassen aardappelplanten verder te beoordelen. De gewassen die in de bodem geteeld zijn, benaderen de mensen die in het veld zijn verworven nauwkeuriger. Figuur 2b illustreert het bereik van de schade wanneer 3e en 4e instar larven werden aangebracht op bladeren die loskwamen van aardappelplanten in de bodem. Twee weken oude Nodale-gekweekte planten werden getransplanteerd naar de bodem en werden voor een extra 3-weeks geteeld. Beschadigde bladeren van gewassen die in de bodem zijn geteeld vielen in drie groepen; 15-20%, 20-30% en 30-40%. De drie bladeren in elke groep worden getoond om de verschillende niveaus van schade voor elk bereik te vertegenwoordigen. De bladeren van meer volwassen bodem planten hadden meer larven nodig en een langere besmettingen tijd om hetzelfde niveau van schade te bereiken dat werd waargenomen in de bladeren van jongere, met nodal gekweekte planten. Deze resultaten illustreren het bereik van mogelijke uitkomsten van succesvolle herbivoren uit verschillende soorten planten.
Na succesvolle ivoren is voltooid en percentage schade wordt beoordeeld, blad weefsel wordt getest voor genexpressie. De resultaten van genexpressie moeten duiden op een robuuste inductie of onderdrukking van transcripten die betrokken zijn bij de respons op infestatie. Figuur 3 illustreert de genexpressie profielen van zes C2H2 transcriptiefactoren van een succesvol ivoren experiment in losgeraakte bladeren. C2H2 zink vinger StZFP2 werd geïnduceerd door M. sexta ivoren in aardappel in eerdere hele planten studies24. Hoewel StZFP2 werd geïnduceerd door ivoren in de losgekoppelde blad test, was infestatie niet significant in vergelijking met het effect van de loslating zelf. Echter, twee andere StZFP2 homologs, StZFP5 en StZFP7, werden significant geïnduceerd op 40 en 80 min post ivoren in vergelijking met losgekoppelde besturingselementen. StLOX3 en StMYC2 zijn marker genen geïnduceerd door zowel verwonden als herbivoren en duiden op de betrokkenheid van jasmonic acid gereguleerde verdedigings trajecten. Het doel van deze specifieke studie was het identificeren van infestatie-responsieve transcriptiefactoren bij een panel van kandidaatgenen. De identificatie van twee C2H2 zink vinger transcriptiefactoren die krachtig reageren op M. sexta ivoren ondersteunt het gebruik van losgekoppelde bladeren voor infestatie-assays.
Figuur 1: stroomdiagram voor het infestatie protocol. Schematische weergave van de stappen die zijn opgenomen in de experimentele workflow van de infestatie sectie van het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: blad schade veroorzaakt door M. sexta larven. A) procentuele beschadiging van de weefselkweek op elke larvale fase van meer dan 5 min. Romeinse cijfers I-IV verwijzen naar Video's 2-5 respectievelijk die tonen elke INSTAR voeden op het blad afgebeeld. B) het aantal schade aan bodem bladeren door 4e INSTAR meer dan 20 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: genexpressie analyse van bladeren. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) genexpressie analyse van C2H2 zink vinger transcriptiefactoren wordt weergegeven. Het gemiddelde transcript niveau is, 2− δct met (δct = CT van test gen-CT van exogene controle-gen). Er worden op elk moment een bekrast controleblad (blauw) en uitgesneden bladeren (rood) weergegeven. Elke waarde is het gemiddelde van drie biologische replicaten. Drie richtingen ANOVA werd uitgevoerd op de ΔCt-waarden. Belangrijke verschillen in controle bladeren na verloop van tijd worden aangegeven met hoofdletters. Significante verschillen in besmette bladeren na verloop van tijd worden in kleine letters aangegeven. Significante verschillen tussen controle en besmette bladeren op hetzelfde tijdstip worden weergegeven met een sterretje (*). PR > F-waarden waren allemaal kleiner dan 0,001, behalve voor StZFP6 controle behandeling met 0,0086. Foutbalken staan voor standaarddeviatie. De NCBI-toetredings nummers zijn: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. Spud DB-toetredings nummers van < http://Solanaceae.plantbiology.msu.edu > zijn StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. Dit cijfer is gewijzigd van22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: videoclip van larvale voeding. Tweede instar M. sexta larven voeden (boven) en niet voeden (onder) op een blad van twee weken oude weefselcultuur geteeld aardappel plant. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: afbeelding 2a videoclip (I) van larvale voeding. Tweede instar M. sexta larve voeden op een blad van twee weken oude weefselcultuur geteeld aardappel plant. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3: afbeelding 2a videoclip (II) van larvale voeding. Derde INSTAR M. sexta larve voeden op een blad van twee weken oude weefselcultuur geteeld aardappel plant. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4: afbeelding 2a videoclip (III) van larvale voeding. Vierde INSTAR M. sexta larve voeden op een blad van twee weken oude weefselcultuur geteeld aardappel plant. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 5: afbeelding 2a videoclip (IV) van larvale voeding. Vijfde INSTAR M. sexta larve voeden op een blad van twee weken oude weefselcultuur geteeld aardappel plant. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van bestaande volledige plantenherbivory methodieken is niet nodig om het doel van deze specifieke studie te bereiken (d.w.z. een reeks kandidaatgenen te schermen voor hun reactie op besmetting). Het voor de hand liggende voordeel van de vrijstaande blad verfijning is het verkorten van de tijd die het kost om ivoren assays uit te voeren. De onhandige aard van hele planten met clip kooien wordt geëlimineerd en assays worden eerder uitgevoerd, omdat planten zo jong als 2 weken kunnen worden gebruikt om bladeren te oogsten. Het vereist ook een veel kleinere footprint tijdens het voeden en minder groei kamer ruimte; beide belangrijk wanneer deze middelen beperkt zijn.
De beperking van deze test, namelijk onthechting, wordt aangetroffen wanneer de verdediging-genexpressie wordt onderzocht. Loslating zelf veroorzaakt een wond reactie en het is daarom belangrijk om te beoordelen welk effect loslating heeft op de basale niveaus van Defense-genexpressie. In een studie met gesimuleerde herbivory waren de transcriptie niveaus van een bekend afweer-gen proteaseremmer II(PIN2-code) onverwacht hoog in de controle bladeren van losgeraakte aardappel bladeren die waarschijnlijk te wijten waren aan "verwonding veroorzaakt tijdens het verzamelen van het blad" 25. echter, toepassing van insecten regurgitant van M. sexta sterk verbeterd niveaus van PIN2-code genexpressie. Dit illustreert de noodzaak om controles te gebruiken om het effect van onthechting van de infestatie reactie te plagen.
Vrijstaande blad-assays worden vaak uitgevoerd om tijd, ruimte en middelen te besparen. Ze zijn gebruikt in de screening op resistentie tegen schimmelziekten in tarwe26,27, en insecten resistentie in soja28 en kikkererwten29. De test wordt algemeen aanvaard in de studie van het pathogeen dat laat licht in aardappel30,31veroorzaakt. Een recente studie vond dat losstaande blad testen equivalent waren aan hele plantaardige assays bij het bepalen van de late blichte weerstand in het veld32.
Er bestaat echter weinig bewijs in de literatuur voor het gebruik van losgeraakte bladeren voor de bepaling van de verdediging-genexpressie. Een studie profileerde zes verdedigings genen in reactie op spinmite infestatie van vrijstaande Lima Bean33. De bladeren produceerden ook vluchtige stoffen die verdedigings reacties veroorzaakte in nabijgelegen niet-besmette bladeren, een bekende strategie van Defense-Gene expressie in planten34. Naar onze kennis, geen kauwen insecten ivoren studies tot nu toe maken gebruik van losgekoppelde bladeren te testen voor genexpressie.
De eerder gedefinieerde responsieve C2H2 zink vinger, StZFP2 werd niet significant geïnduceerd door infestatie in de huidige vrijstaande blad test. Afgezien van het voor de hand liggende verschil in hele plant versus losgemaakt blad, gebruikte de vorige studie een continue vorm van infestatie waarbij plantenweefsel werd onderzocht op genexpressie onmiddellijk na de verwijdering van de larven24. Dit verschilt van het discontinu soort infestatie gebruikt in de huidige studie, waar larvale verwijdering werd gevolgd door een rustperiode vóór de oogst van het blad. Tijdens deze herstelperiode dalen de StZFP2 niveaus snel en kunnen ze resulteren in een lager niveau van StZFP2 inductie. Er kunnen ook andere tot dusver ongedefinieerde systemische signalerings componenten zijn die kunnen bijdragen aan de verhoogde inductie die in het hele planten onderzoek wordt waargenomen. Een andere mogelijkheid is dat StZFP2 transcripten voor de oogsttijd van 20 minuten had kunnen piepen. Het is echter duidelijk dat de indrukwekkende inductie van StZFP5 en StZFP7 transcripten dit type infestatie protocol relevant maakt. Een andere beperking van de huidige methode zou het onvermogen om wortel voeden larven zoals Corn root worm gebruiken. Het zou ook niet geschikt zijn wanneer hele installatie communicatie zoals wortel naar blad signalering35 of signalering uit systemische bladeren36,37 wordt bestudeerd.
Succes van dit protocol is sterk afhankelijk van de kwaliteit en nauwkeurige staging van larve gebruikt in het experiment. Opfok vaardigheden en basiskennis van het gedrag van M. sexta zijn nuttig, maar niet kritisch. Echter, het verkrijgen van gezonde, geschikt geënsceneerde larven kan direct invloed hebben op het voeren van succes. Larven voeren een rustperiode in die voorafgaat aan elke larvale molt waarin ze niet21voeden. Het is duidelijk dat deze larven geen blad weefsel beschadigen. De ideale tijd om larven te gebruiken is net na een molt. Een in ontwikkeling geënsceneerde cohort van insecten van een bepaald larvale stadium zal ook de reproduceerbaarheid van genexpressie verbeteren, omdat planten anders kunnen reageren op elke ontwikkelingsfase.
Toegang tot een Insectarium zou ideaal zijn voor het leveren van larven. M. sexta eieren of larven kunnen ook worden besteld uit commerciële bronnen38,39 en gekweekt op dieet of plant materiaal in de juiste fase. Er zijn ook verschillende online tools die kunnen helpen bij het identificeren van elke INSTAR40,41,42. Larven die op dieet zijn gehouden, bevatten geen plantaardige specifieke componenten zoals microbiële symbionten die zijn verworven door larven die zijn gekweekt op planten43. Genexpressie profielen kunnen worden gewijzigd als deze onderdelen ontbreken. Larven kunnen gedeeltelijk of volledig worden gekweekt op hun gastheerplant als deze effecten belangrijk zijn voor de studie. Het voorkomen van voedsel van insecten een paar uur voorafgaand aan het voeren van experimenten kan ook het voedingsgedrag verbeteren. Veld-verzamelde larven kunnen ook robuust en voordelig zijn omdat ze zijn blootgesteld aan goede trofische niveaus, maar dat voegt een andere variabele toe die al dan niet geschikt is voor alle studies.
Ook de productie van gezonde, insecten-en pesticidevrije planten is van cruciaal belang. Planten met virussen, insecten plagen en schimmel organismen zullen verstorende factoren introduceren en een uitdaging vormen bij het verkrijgen van reproduceerbare gegevens.
Veel larvale instars, aardappelplanten leeftijden en blad groottes kunnen worden gecombineerd om het protocol aan te passen voor een specifiek type studie. De lengte van de infestatie en de oogst tijden kunnen ook worden aangepast. Mogelijk kunnen vele andere planten-insecten interacties worden bestudeerd met behulp van losgekoppelde bladeren als hele planten waarnemingen worden gebruikt als basislijn. De vrijstaande blad test is een relevant en waardevol alternatief voor hele planten ivoren studies om genexpressie te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Bob Farrar en Alexis Park bedanken voor het leveren van insecten die in deze studie worden gebruikt en voor hun expertise in larvale staging. Extra dank aan Michael Blackburn en Saikat Ghosh voor kritische recensie van het manuscript.
Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van landbouw.
USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
