Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktion i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59167
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

Summary

Denna studie visar användningen av flödescytometri att upptäcka reaktivt syre arter (ROS) produktion följd aktivering av FcγR. Denna metod kan användas för att bedöma förändringar i antimikrobiella och redox signalering funktion av fagocyter i svar till immunkomplex, opsonized mikroorganismer eller direkt FcγR cross-linking.

Abstract

Oxidativa eller respiratorisk burst används att beskriva snabb konsumtion av syre och generering av reaktiva syreradikaler (ROS) av fagocyter som svar på olika immun stimuli. ROS som genereras under immunsystemets aktivering utövar potent Antimikrobiell aktivitet främst genom ROS förmåga att skada DNA och proteiner, orsakar döden av mikroorganismer. Att kunna mäta ROS produktion reproducibly och med lätthet är nödvändigt för att bedöma olika vägar och molekyler till denna mekanism av värd försvar bidrag. I detta papper, vi demonstrera användningen av fluorescerande sonder och flödescytometri för att upptäcka ROS produktion. Även om utbrett, är fluorescerande mätning av ROS notoriskt problematiska, särskilt när det gäller mätning av ROS som induceras av specifika och inte mitogena stimuli. Vi presenterar en detaljerad metod för att upptäcka ROS som genereras till följd av specifika FcγR stimulering börjar med makrofag generation, grundning, färgning, FcγR cross-linking och slutar med flöde flödescytometrisk analys.

Introduction

Reaktiva syreradikaler (ROS) är reaktiva molekyler eller fria radikaler som är biprodukter av aerob respiration (ses i 1). Dessa inkluderar den superoxid anjon, peroxid, väteperoxid, hydroxyl radikala och hydroxyljoner, bland andra. Under normala fysiologiska förhållanden, ROS produceras främst av mitokondrier och nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat (NADPH) oxidases och är snabbt Dekon-olika enzymer och proteiner som superoxiddismutas och glutation. En överdriven produktion av ROS eller en defekt i förmågan att ta bort ROS kan leda till oxidativ stress, whereby reaktiva syreradikaler främja skadan av proteiner, lipider och DNA vilket leder till cellulär stress eller död och patologiska sjukdomstillstånd. Men uppskattas det för närvarande att ROS kan också fungera som signalmolekyler (redox signalering) och ROS-medierad modifiering av olika molekyler och pathway intermediärer kan påverka cellulär metabolism, spridning, överlevnad, inflammatoriska signalering och åldrande2. I Fagocytos celler spelar ROS en viktig roll i att tillhandahålla Antimikrobiell aktivitet under den så kallade ”respiratory burst”1,3,4,5,6. Under fagocyter svar på yttre stimuli translocate komponenter av NADPH-oxidas komplexa (p40phox, p47phox, p67phox) från cytosolen till phagosomal membranet som innehåller gp91phox och p22phox subenheter, och tillsammans med åtgärderna för Rac1/2, bildar en fullt fungerande NADPH-oxidas enzymkomplex. Den monterade NADPH-oxidasen använder sedan tredjeparts NADPH för att reducera syre till superoxid inom den phagosomal vakuol. Superoxid anjoner kan direkt skada eller vara dismutated i väteperoxid. Både superoxid och väteperoxid kan reagera med andra molekyler för att generera mycket reaktiva hydroxylradikaler. Skador medieras genom reaktion av dessa ROS med järn-svavel kluster på proteiner eller orsakar bas oxidering av DNA, vilket slutligen leder till begränsad mikrobiell metabolism eller döden av mikrob5. Betydelsen av NADPH-oxidas enzymet komplexa och ROS som producerats under respiratory burst illustreras kliniskt på patienter med kronisk granulomatös sjukdom (CGD)7,8,9, 10. individer med CGD besitter mutationer i gp91phox, vilket resulterar i en brist på ROS produktion och känslighet för återkommande infektioner med bakterier och svampar som inte vanligtvis är ett bekymmer med immunkompetenta individer. Därför, om studera oxidativ stress, redox signalering eller värd försvar, att kunna mäta ROS produktionen i realtid är en användbar strävan.

Flera analyser har utnyttjats till åtgärd ROS produktion eller resultaten av oxidativ stress11,12,13. Bland dessa är en av de mest använda fluorescerande sond 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH2-DA)14. Denna molekyl är färglös och lipofila. Diffusionen av DCFH2-DA över cellmembranet gör att den kan vara handlat av intracellulära esteraser, som deacetylates det i DCFH2, gör den cell ogenomtränglig. Åtgärder av flera typer av ROS (väteperoxid, peroxynitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid och peroxy radikaler) på DCFH2 oxidera det till DCF som är fluorescerande (rapporterade Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) och kan upptäckas med hjälp av ett flöde cytometer utrustad med ett standardfilter för fluorescein (FL1 kanal). Superoxid reagerar inte starkt med DCFH2 men kan reagera med en annan sond dihydroethidium (DHE) ge de fluorescerande produkt 2-hydroxyethidium (liksom andra fluorescerande superoxid-oberoende oxidationsprodukter)15. De fluorescerande produkterna DHE oxidation kan upptäckas med hjälp av en magnetisering våglängd 518 nm och emissionsvåglängden 605 nm (FL2 kanal). Även om det är relativt enkelt att använda, kräver utnyttjande av dessa sonder för detektion av ROS kunskap om sina begränsningar och försiktig införlivandet av färgning förfaranden och kontroller till specifika analysen utförs för att ha giltiga experimentella resultat och slutsatser. Följande protokoll visar användningen av ett kommersiellt tillgängliga kit anställa dessa 2 givare för att mäta ROS av flödescytometri. Vi fläcken primade benmärg-derived makrofager med dessa sonder och framkalla ROS produktion genom FcγR cross-linking. Vi presenterar representativa uppgifter som erhållits med hjälp av detta protokoll och betona lämpliga försiktighetsåtgärder som måste vidtas för framgångsrika experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet för djurhantering godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Central Florida.

1. generering av benmärgen härrör makrofager (BMDMs)

  1. Kultur media förberedelse
    1. Förbered D10F bas: till Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), lägga till 10% värme inaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 1 mM natrium Pyruvat, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) och 0,05 mM β-merkaptoetanol.
      Obs: Även om det är bäst att använda färska D10F media, D10F base media kan förberedas upp till två veckor i förväg att användas för flera experiment inom en vecka. För en mus är cirka 175 mL D10F base media nödvändiga (25 mL att spola benen) och 150 mL att göra makrofag differentiering media
    2. Förbered LADMAC tillväxt: att örnens minst viktigt Medium (EMEM), lägga till 10% värme inaktiverat FBS och 2 mM L-glutamin. Förbereda media färska, samma dag som du planerar att starta din kulturer.
      Obs: En liter LADMAC tillväxt medier kommer att resultera i cirka (19) 50 mL alikvoter av LADMAC-villkorade media.
    3. Förbereda komplett DMEM media: DMEM, lägga till 10% värme inaktiverat FBS och 1 x antibiotikum-Antimycotic. Förbereda media färska, den dagen BMDMs kommer att skördas.
      Obs: För en mus, cirka 100 mL DMEM komplett media kommer att krävas. Detta inkluderar media som används för grundning cellerna.
  2. Beredning av LADMAC luftkonditionerade medium
    1. Odla LADMAC cellerna till konfluens i en 10 cm skålen med 10 mL LADMAC tillväxt medier (definieras i 1.1.2). Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2.
    2. På konfluens, lossa cellerna genom kraftfullt dispensering media över celler. Passagen celler genom att tillsätta 1 mL fristående celler i T-175 kolvar innehållande 100 mL av LADMAC tillväxt medier. Inkubera cellerna tills helt konfluenta vid 37 ° C, 5% CO2 (ungefär en vecka). På så sätt en 10 cm skålen kan ge tio T-175 kolvar eller cirka 1 L luftkonditionerade medier.
    3. När cellerna är redo, samla luftkonditionerade medier och centrifugera vid 350 x g i 5 min till pellet oönskade celler. Filtrera insamlade supernatanterna genom ett 0,2 mm filter och lagra 50 mL alikvoter vid-80 ° C. Alikvoter av LADMAC-villkorade media kan förvaras vid-80 ° C för månader med minimal förlust av aktivitet.
      Obs: Om stora experiment förväntas, förbereda stora partier av LADMAC-villkorade media samtidigt att garantera konsekvens. Om detta inte är möjligt, använda alikvoter som härrör från samma batch eller mycket LADMAC-villkorade media för varje experiment.
  3. Beredning av benmärg härrör makrofager
    1. På dagen för experimentet, Förbered färska makrofag differentiering genom att lägga till 25% av LADMAC luftkonditionerade media in tidigare beredda D10F media (1 del LADMAC luftkonditionerade media i 3 delar D10F). Inte förbereda detta media i förväg! Bara Förbered så mycket som behövs för den BMDM kulturen.
    2. Dag 1: isolera mus benmärgsceller enligt de tidigare beskrivna protokollet16 med en modifiering att spola benmärgen från lårbenet och förbenade med D10F bas media. Använd 2,5 mL av D10F media för att spola varje ände (4) ben. Spola benmärgsceller direkt i en pre våt 40 mm cell sil placeras ovanpå en 50 mL tub. Återstående media (~ 5 mL) kan användas för att skölja ur cellen Silen.
    3. Centrifugera insamlade benmärgsceller vid 350 x g för 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i sammanlagt 30 mL av makrofag differentiering media (per mus).
    4. Förbereda och etikett (6) steril 10 cm petriskålar. Tallrik 5 mL av makrofag differentiering media i var och en i petriskål. Alikvotens 5 mL återsuspenderade benmärgsceller i makrofag differentiering media i varje petriskål för en total volym på 10 mL per maträtt. Inkubera i 5 dagar vid 37 ° C, 5% CO2.
    5. Dag 5: aspirera media från cellerna. Tvätta en gång med 1-2 mL PBS och tillsätt 10 mL av nylagade makrofag differentiering media. Inkubera i ytterligare 3 dagar.
    6. Dag 8: Gå vidare till skörd BMDMs som beskrivs nedan.

2. skörd, sådd och primerbehandling av BMDMs

  1. Efter 7 dagars växer BMDMs i makrofag differentiering media, avlägsna supernatanten. Tvätta vidhäftande makrofager en gång med 1-2 mL PBS. Aspirera PBS.
  2. Fördela 1 mL av 0,25% Trypsin-EDTA i varje makrofag tallrik och lämna dem i 37 ° C inkubatorn för 5-10 min med täta Knacka bort cellerna. Separera trypsinized makrofager av pipettering upp och ner med P1000 pipett och samla makrofager i 50 mL rör som innehåller 10-15 mL komplett DMEM media. Tvätta plattan med ytterligare 2 mL komplett DMEM media att skörda alla återstående makrofager.
    FÖRSIKTIGHET: Lämna inte makrofager i trypsin för mer än 10 min.
  3. Centrifugera 50 mL tuberna på 350 x g för 5 min. Kassera supernatanten. Försiktigt separera pelleten och resuspendera cellerna i 10 mL av komplett DMEM media. Räkna makrofager med hjälp av en hemocytometer i närvaro av en livskraft färga såsom trypan blå enligt följande:
    1. Till exempel blanda 90 µL av Trypan blå med 10 µL av celler för en 1:10 utspädning.
    2. Av denna blandning, ladda 10 µL i en hemocytometer och räkna det centrala torget (5 x 5 rutnät). Det totala celltalet = count x 104 x utspädning faktor (10) x volym (10 mL).
  4. Justera cellsuspensionen vara 1 miljon/mL i komplett DMEM media och plattan 4 mL av denna cellsuspension i varje 6 cm skålen.
    Obs: Ett minimum av 3 plattor krävs per experiment. En platta av celler blir vänster ostimulerade, en andra uppsättning celler kommer att stimuleras genom cross-linking av FcγRs och den tredje plattan av celler kommer att användas för alla de ytterligare experimentella och flöde flödescytometrisk kontroller.
  5. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
  6. Följande dag, aspirera supernatanten, tvätta cellerna en gång med 1-2 mL PBS. Tillsätt 4 mL av komplett media som innehåller 100 ng/mL mus IFN-γ till varje tallrik. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
  7. Om du vill ta en alikvot av cellerna för att bedöma lämplig generation av BMDMs av flödescytometri. Använd 1 x 106 celler per test och förbereda polystyren FACs rör för följande villkor: isotypen kontroll, målat med F4/80 (eller alternativt fläckade CD11b).
  8. Förbereda flödescytometri färgning buffert genom att lägga till 0,1% FBS in 1 x PBS. Använd endast denna mängd FBS så att inte förneka effekterna av serum-svält i senare steg.
  9. Alikvotens 1 x 106 celler per rör och centrifugera vid 750 x g under 5 minuter.
  10. Tvätta en gång genom dekantering eller aspirera supernatanten och omblandning celler i 2 mL flöde flödescytometri buffert. Centrifugera vid 750 x g under 5 minuter.
  11. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 µL av flödescytometri färgning buffert. Tillsätt 1 µL av antimus CD16/32 Fc blockerande antikroppen i varje rör. Inkubera på is för 5 min.
  12. Utan tvätt, lägga till 2 µL av FITC antimus F4/80 eller 1 µL av APC antimus CD11b antikroppen ”färgade” rören och ett liknande belopp motsvarande isotypen kontroll antikroppens ”isotyp” rör. Inkubera på isen, i mörkret, i 30 min.
  13. Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 mL PBS direkt i cellerna. Centrifugera vid 750 x g under 5 minuter.
  14. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 150 µL av PBS.
  15. Förvärva prover på en flödescytometer med ett stoppvillkor 100 µL eller 10 000 händelser på utfärda utegångsförbud för av intresse och säkerställa att FSC, SSC, FL1 (FITC antimus F4/80) eller FL4 (APC antimus CD11b) kanaler väljs för parametrarna som skall analyseras.
  16. Använda programvaran flow flödescytometri, öppna en prick tomt för FSC (på x-axeln) vs SSC (på y-axeln) och rita en grind runt celler av intresse, exklusive döda celler och skräp (döda celler och skräp är mycket mindre händelser än den huvudsakliga cell befolkningen och visas på lowe r vänster på tomten).
  17. Gating på cellerna i intresse, öppna en histogram tomt med FL1 (FITC antimus F4/80) eller FL4 (APC antimus CD11b) på x-axeln.
  18. Kör ”isotyp” provet. Generera en markör grind så att majoriteten av ”isotyp” prov händelser finns till vänster om porten (< 1% positiva). Tillämpa denna mall för färgade exempelfilen.
  19. Kör ”färgade” provet. Framgångsrik generation av BMDMs kommer att resultera i > 95% uttryck för FITC antimus F4/80 eller APC antimus CD11b (figur 1A), medan felaktiga odlingsbetingelser kan leda till suboptimala generation av makrofager (figur 1B).
    Obs: Om genererar BMDMs från flera genotyper, ta del av uttrycket av dessa markörer för varje parti av BMDM genereras, i fall att detta kan vara skäl för att utesluta ett prov från analys när ROS generation svar på stimulans bedöms.

3. reagens och material inför ROS mätning

  1. Bered det frystorkade oxidativa stress upptäckt reagenset i 60 µL vattenfri DMF ge en 5 mM stamlösning. Blanda försiktigt före användning.
    Obs: Det är anges i ROS-ID kit handbok att hållbarhetstiden för beredda reagens är ca 1 vecka vid-20 ° C. Alikvotering reagens omedelbart efter rekonstitution in små ljus-bevis flaskor minimerar dess oxidation och maximerar hållbarheten vid-20 ° C.
  2. Rekonstituera frystorkat superoxid upptäckt reagenset i 60 µL vattenfri DMF ge en 5 mM stamlösning. Blanda försiktigt före användning.
    FÖRSIKTIGHET: som anges i handboken för kit, behandla båda upptäckt reagenser som möjligt mutagena, hanterar varje med omsorg och kassera ordentligt.
  3. Rekonstruera den ROS-induceraren (Pyocyanin) i 20 µL av vattenfri DMF ge 50 mM stamlösning.
  4. Rekonstruera den ROS-hämmaren (N-acetyl-L-cystein) i 123 µL avjoniserat vatten för att ge en 0,5 M lager koncentration.
  5. Etikett 5 mL runda polystyren rör (flöde flödescytometri rör) med de experimentella kontroller och villkor. (Se 4. Assay villkor och kontroller)
  6. Förbereda låga serum DMEM (ingen fenolrött) genom att lägga till 0,1% FBS att fenolrött-fri DMEM.
  7. Alikvot anti-BSA antikroppen i små portioner (beroende på användning) och lagra dem vid-80 ° C.
  8. Förbereda stamlösning av 100 mg/mL BSA i HBSS (Hanks balanserad saltlösning) eller PBS. Delprov i 100 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
  9. Bered en 2 x av de ROS sonderna (2 x probe lösning): för varje 10 mL av låga serum DMEM, lägga till 4 µL av oxidativ stress upptäckt reagens (grön dye) och 4 µL superoxid upptäckt reagens (orange färg).
  10. Förbered 2 x probe lösningar innehållande endast oxidativ stress upptäckt reagens (2 x probe lösning, grön endast), eller som innehåller endast superoxid upptäckt reagens (2 x probe lösning, orange endast). Förbereda bara mängden reagens som behövs för experimentet och alltid förbereda 2 x lösningen omedelbart före användning.
    Obs: För att förbereda mindre volymer av 2 x upptäckt lösning, använda en mellanliggande 1:10 utspädning av både grönt och Orange upptäckt reagenser före slutlig spädning i DMEM. Exempelvis för att förbereda 1 mL av en 2 x upptäckt lösning, späd 1 µL av varje sond in 9 µL av DMEM (1:10 mellanliggande utspädning). Späd 4 µL av 1:10 intermediär spädning till 1 mL av DMEM.

4. assay villkor och kontroller

  1. Inkludera följande experimentella kontroller för flödescytometrisk flödesberäkning för varje experiment:
    (a) ofärgade och ostimulerade celler.
    (b) celler färgas endast med oxidativ stress upptäckt reagens (gröna reagent) och behandlas med ROS inducerare.
    (c) cellerna färgas endast med superoxid upptäckt reagens (orange reagent) och behandlades med ROS inducerare.
  2. För varje mus eller biologiska replikera, inkludera följande 6 villkor:
    (a) ofärgade och ostimulerade celler
    (b) betsad och ostimulerade celler
    (c) målat celler behandlas med positiva inducerare
    (d) färgade celler behandlas med positiva inducerare och ROS-hämmare
    (e) färgade celler aktiveras genom FcγR cross-linking
    (f) färgade celler aktiveras genom FcγR cross-linking och behandlades med ROS-hämmare
  3. Beräkna mängden 2 x sonden lösning som behövs baserat på antalet möss och förhållanden (200 µL 2 x probe lösning kommer att användas för varje villkor som kräver färgning).
    Obs: För ett test som använder 6 möss, 5 villkor som kräver färgning med sonderna kommer att behövas per mus. Detta ger det totala antalet villkor till 30. Den totala mängden 2 x probe lösning behövs alltså åtminstone 6 mL (30 * 200 µL).

5. cell förberedelse

  1. Efter grundning makrofager över natten, aspirera supernatanten. Tvätta cellerna en gång med PBS.
  2. Serum svälta cellerna genom att ersätta media med samma volym av låga serum DMEM. För varje mus, en platta kommer att behandlas med anti-BSA IgG1 medan serum svälter, medan andra lämnas obehandlade. Lägga till endast låga serum DMEM obehandlad plattor. Lägg till låga serum DMEM innehållande 2,5 µg/mL murina anti-BSA IgG1 till behandlade plattor.
    Obs: En ytterligare obehandlad platta behövs för varje experiment för flöde flödescytometrisk ersättning kontroller.
  3. Inkubera plattorna under 4 timmar vid 37 ° C, 5% CO2.
  4. Efter serum svälter, skörda cellerna med mild skrapning eller 0,2 mM EDTA i PBS. Samla dem i märkt 5 mL rund botten rör och centrifugera dem vid 750 x g i 5 min. Håll koll på vilka celler behandlades med murin anti-BSA IgG1.
  5. Tvätta cell pellets en gång med 2 mL PBS att bli kvitt eventuella kvarvarande anti-BSA från de behandlade cellerna.
  6. Återsuspendera cellpelleten i 600 µL av låga serum DMEM.
  7. Från 600 µL cellsuspension, alikvotens 200 µL till de pre märkta 5 mL runda botten rör enligt följande:
    1. Från de obehandlade cellerna, ta 200 µL för rör märkta ”ostimulerade”, 200 µL för rör märkta ”positiva inducerare” och 200 µL för rör märkta ”positiva inducerare + hämmare”
    2. Från den anti-BSA IgG1 behandlade cellerna, ta 200 µL för rör märkta ”FcγR crosslinking/FcγR XL” och 200 µL för rör märkta ”FcγR XL + hämmare”
    3. Från de obehandlade cellerna som ska användas för ersättning kontroller, ta 200 µL för röret märkas ”ofärgade ostimulerade”, 200 µL för ”grön + inducerare” kontroll och 200 µL för ”orange + inducerare” kontroll.
      Obs: Om cellerna från 5.7.1 och 5.7.3 härrör från samma mus, samma ”ofärgade ostimulerade” cellerna kan användas för att experimentell och ersättning. Om inte, en ytterligare 200 µL av celler kommer att behövas för en ”ofärgade ostimulerade” experimentell kontroll för en).
  8. Hålla rören på is tills färgning och stimulering. Under serum förbereder svält och bindning av IgG1, den sonder, specifika stimuli och inducerare som beskrivs nedan.
    Obs: Om utför analysen för första gången, om ingen mall finns, eller ingen efter-the-faktum ersättning finns på flödescytometer och motsvarande programvara, stimulera och fläcken ersättning kontroller och köra dessa på den flödescytometer att utföra manuell ersättning före tillsats av stimuli till experimentprover.

6. utför analysen

  1. Förbered 2 x positiva inducerare lösning genom att späda ut den Pyocyanin 1: 100 i 2 x probe lösning (beredd enligt steg 3,9) för att få en 2 x koncentration av 500 µM av pyocyanin (slutlig koncentration blir 250 µM). Också, späd pyocyanin 1: 100 i varje ”2 x probe lösning, gröna endast” och ”2 x probe lösning, orange endast” rör som förberett i 3.10.
    Obs: Båda villkoren som märkts med ”positiv inducerare” och ”positiva inducerare + hämmare” kommer att behandlas med den positiva induceraren. Planera därefter när beräkningen av 2 x positiva inducerare lösning att förbereda. Till exempel: om utför analysen med 3 möss, 6 villkor (3 * 2) kommer att behandlas med positiva inducerare, så Förbered 6 * 200 µL = 1,2 mL av 2 x positiva inducerare lösning.
  2. Förbereda en 2 x BSA lösning genom att späda ut BSA stamlösning 2 x probe lösningen att få en koncentration av 2 µg/mL (slutlig koncentration blir 1 µg/mL).
    Obs: Båda villkoren som märkts med ”FcγR XL” och ”FcγR XL + hämmare” kommer att behandlas med 2 x BSA lösning. Planera därefter vid beräkning av mängden lösning att förbereda. Till exempel: om utför analysen använder 3 möss, 6 (3 * 2) villkor kommer att behandlas med BSA lösning och så 6 * 200 µL eller 1,2 mL av 2 x BSA lösning kommer att behövas.
  3. Innan du börjar den specifika stimuleringen (FcγR crosslinking), se till att alla reagenser och celler är redo. Placera rören på isen i den ordning som de kommer att stimuleras.
  4. För flöde cytometers med en autosampler, notera den tid cytometer tar att analysera ett prov och gå vidare till nästa, inklusive blandning och sonden tvätt steg (till exempel 3,5 min).
    Obs: Timing är mycket kritisk för denna analys. För varje skick för att vara väl kontrollerad, behöver stimulering utföras för exakt tid (30 min) för varje villkor. Stimulera celler i ordning och införliva fördröjning mellan prov förvärv av en flödescytometer. Till exempel om den tid som behövs för cytometer att analysera ett prov och gå vidare till nästa är 3,5 min, stimulera celler i den ordning som de kommer att analyseras varje 3,5 min.
  5. Om utför manuell kompensation vid denna punkt, stimulera kontroll rör som ska användas för ersättning (steg 5.7.3). Tillsätt 200 µL ”2 x probe lösning, gröna endast” som innehåller inducerare (från 6,1) in i rören märkt ”grön + inducerare” (steg 5.7.3). Tillsätt 200 µL av ”2 x probe lösning, orange endast” som innehåller inducerare (steg 6.1) in i rören märkt ”orange + inducerare” (steg 5.7.3).
  6. Inkubera cellerna för 30 min vid 37 ° C, 5% CO2 i mörkret.
  7. Via programvaran flow flödescytometri generera och etikett 3 exempelfiler för den kontroll ”ofärgade, obehandlad”, ”gröna + induceraren”, och ”orange + inducerare” prover, se till att ange de kanaler/parametrarna ska analyseras (FSC, SSC, FL1, FL2) och önskad stopp villkor (100 µL, 3 min, etc.). Generera och etikett en liknande uppsättning filer för experimentell prover.
  8. Kör ”ofärgade, obehandlad” provet. Öppna en prick tomt för FSC (på x-axeln) vs SSC (på y-axeln) och rita en grind runt cellerna av intresse, exklusive döda celler och skräp (döda celler och skräp är mycket mindre händelser än den huvudsakliga cell befolkningen och visas på det nedre vänsterkant delen av tomten).
  9. Öppna med detta utfärda utegångsförbud för ”celler”, en annan dot tomt på FL1 (x-axeln) vs FL2 (y-axeln). Rita en första kvadranten-porten. Justera kvadrant grindarna så att händelserna visas på den nedre vänstra kvadranten av FL1 vs FL2 tomten.
  10. Kör ”grön + inducerare” provet. Justera spänningen så att händelserna visas i nedre vänstra och högra kvadranterna av FL1 vs FL2 tomten. Gäller detta kompensationsmatris för alla 3 exempelfilerna.
  11. Kör ”orange + inducerare” provet. Justera spänningen så att händelserna visas på de övre och nedre vänster kvadranter av FL1 vs FL2 tomten. Gäller detta kompensationsmatris för alla 3 exempelfilerna.
  12. Kontrollera varje ersättning fil och se till att ”ofärgade, obehandlat” händelser visas på den nedre vänstra kvadranten, ”gröna + inducerare” händelser visas på de nedre vänstra och högra kvadranterna och ”orange + inducerare” händelser visas på de övre och nedre vänster kvadranter FL1 vs FL2 tomt. Gälla kompensationsmatrisen alla experimentella exempelfilerna.
    1. Säkerställa att lämplig ersättning tillämpas på alla kontroll exempelfilerna innan du applicerar matrisen ersättning till alla experimentella exempelfilerna. Se figur 2 för representativa uppgifter visar Okompenserad och korrekt kompenserad prover.
      Obs: Många cytometers utse FL1 som standard FITC/GFP kanal (upphetsad av blå 488 nm laser och identifieras med en 530/30 filter) och FL2 som en standard PE-kanal (upphetsad av blå 488 nm laser och identifieras med en 585/40 filter). Vi använder denna samma konvention men försiktighet nya flöde flödescytometri användare för att rådgöra med sin flöde flödescytometri core manager för att säkerställa att deras cytometer konfigureras på samma sätt och att lämpliga kanaler används för att upptäcka dessa sonder. Beroende på modell av flödescytometer och medföljande programvara, kan det vara möjligt att utföra ersättning före eller efter prover har förvärvats. Om efter-the-faktum ersättning är möjlig, kan det ersättning steget utföras efter alla experimentprover har förvärvats av cytometer. För cytometers med ett dynamiskt omfång, där PMT spänning justeringar behövs inte, ett ersättning experiment kan också utföras på en separat dag och experimentella mallen (inklusive kompensationsmatrisen) kan sparas för att minska den tid som behövs för att utföra manuell kompensation.
  13. När manuell kompensation har utförts och en experimentell mall erhålls, börja behandling av experimentprover. Innan behandling med positiva inducerare eller FcγR cell stimulering, Markera vilka rör få ROS-hämmare. Behandla dessa celler med ROS hämmare minst 30 min före positiva inducerare eller FcγR stimulering.
  14. För att lägga till den ROS-hämmaren, förbereda en slutkoncentration på 5 mM genom att lägga till 1 µL med hämmare 200 µL återsuspenderad celler (utan anti-BSA IgG1).
  15. Behandla cellerna med stimulans (eller positiva inducerare) och laddar cellerna med ROS sonderna enligt följande:
    1. För ostimulerade celler: tillsätt 200 µL av 2 x probe lösning utan någon stimulans till den 200 µL cellsuspension märkt ”färgade, ostimulerade”.
    2. För positiva kontroller: tillsätt 200 µL av 2 x positiva inducerare lösning (beredd enligt steg 6.1) till 200 µL cellsuspension märkt ”positiva inducerare” eller ”positiv inducerare + -hämmare”.
    3. För celler stimuleras av FcγR tvärbindande (specifikt stimulus): tillsätt 200 µL 2 x BSA lösning (beredd enligt 6.2) i 200 µL cellsuspension märkt ”Fcγr XL” eller ”FcγR XL + -hämmare”.
      Obs: Kom ihåg att införliva fördröjning mellan provanalys genom att lägga till stimulans var x minut där x är fördröjning mellan förvärvet av ett prov och nästa.
  16. Inkubera cellerna för 30 min vid 37 ° C, 5% CO2 i mörkret. Analysera proverna i den ordning som de var stimuleras med hjälp av en flödescytometer utrustad med en autosampler. Använd analys mallarna genereras under de inledande ersättning steg. Tvätta inte celler före analys.

7. flow flödescytometri dataanalys och förväntade resultat

  1. Inom flöde flödescytometri programvaran, öppna tidigare genererade analys filerna för experimentella proverna (mallar genererades i steg 6,7-6.12 och prov kördes i steg 6.16). Säkerställa att matrisen ersättning utföra manuell kompensation tillämpades korrekt till experimentella proverna.
    Obs: För flöde cytometers och flöde flödescytometri programvara kan efter-the-faktum kompensation, om kompensationsmatrisen inte tillämpades tidigare till experimentella exempelfilerna, tillämpa den på denna punkt.
  2. Liknande till att kontrollera rätt manuell kompensation, se till att kontrollerna i de experimentella proverna beter sig som förväntat.
    1. Se till att händelserna ”ofärgade, obehandlad” visas på den nedre vänstra kvadranten av FL1 vs FL2 tomten, att händelserna ”positiva inducerare” Visa ökad fluorescens i det övre vänstra, övre höger, och lägre rätt kvadranter FL1 vs FL2 tomten, och att ” positiv inducerare + ROS-hämmare ”händelser visar en minskning fluorescens i övre vänstra, övre höger och lägre rätt kvadranter FL1 vs FL2 tomt jämfört med fluorescensen observerats med” positiv inducerare ”provet.
    2. Om kontroller inom experimentella proverna inte visar något ökad fluorescens, kontrollera att alla analysstegen utfördes, kontrollera lämplig generation och priming av benmärgen-derived makrofager (2.7-2.19), och upprepa experimentet. Om kontroller inom experimentella proverna visar de beräknade trenderna, Fortsätt att analysera experimentprover stimuleras genom FcγR (figur 3A).
  3. Kontrollera att FcγR-specifika stimulans fungerar korrekt. Kör följande exemplen från en C57BL/6J WT mus: ”ofärgade ostimulerade”, ”målat, ostimulerade”, ”färgade, stimuleras genom FcγR”, och ”målat, stimuleras via FcγR + ROS hämmare”. Dessa motsvarar prover 4.2a, 4.2b, 4.2e och 4.2f i avsnitt 4, respektive.
    1. Se till att händelserna ”ofärgade, ostimulerade” visas på den nedre vänstra kvadranten av FL1 vs FL2 tomten, att ”målat, ostimulerade” händelser visas också på den nedre vänstra kvadranten av FL1 vs FL2 tomten, som ”målat, stimuleras genom FcγR” händelser Visa ökad fluorescens i det övre vänstra, övre höger och lägre rätt kvadranter FL1 vs FL2 tomten, och att ”målat, stimuleras via FcγR + ROS hämmare” händelser visar minskade fluorescens i övre vänstra, övre högra och nedre högra kvadranter av FL1 vs FL2 tomten jämfört med ”färgade, stimuleras genom FcγR” provet (figur 3A).
    2. Om dessa förväntningar inte uppfylls, exempelvis ”färgade, stimuleras genom FcγR” provet visar minimal eller ingen ökad fluorescens jämfört ”färgade, ostimulerade” provet, eller ”färgade, ostimulerade” provet redan visar markant ökade nivåer av fluorescens jämfört med ”ofärgade, ostimulerade” provet, kontrollera att alla analysstegen utfördes korrekt, kontrollera lämplig generation, grundning, och hantering av BMDMs (2,7-2.19), och upprepa experimentet. Om dessa förväntningar uppfylls, vidare till analysen av resten av experimentella proverna.
      Obs: Celler som producerar ROS som reagerar med gröna sonden (väteperoxid, peroxynitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid, peroxy radikaler, etc.) visas i övre högra och nedre högra kvadranterna av en logg FL1 (x-axeln) kontra en logg FL2 (y-axeln) dot tomt. Celler som producerar ROS som reagerar med orange sonden (främst men inte uteslutande superoxid) kommer att visas i de två övre kvadranterna av en logg FL1 (x-axeln) kontra en logg FL2 (y-axeln) dot tomt.
  4. Generera enskilda histogrammen, gated på cellerna av intresse, för analys av FL1 och FL2 fluorescens. Använder ”ofärgade, ostimulerade” proverna, generera en histogram markör så att alla ”ofärgade, ostimulerade” händelser visas till vänster om markören. Applicera denna tomt med markören till resten av de experimentella proverna (figur 3B).
  5. Presentera resultaten av experimentet som en procentsats av cellerna som är positiva för varje av de ROS sonderna eller visar genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) stimuleras prover kontra kontroll (figur 3 c).

8. cellytan färgning i kombination med flöde flödescytometrisk analys av ROS produktion (valfritt)

Obs: Detta steg ger ett protokoll för färgning makrofager cellytan markör innan stimulering av mätningen av FcγR och ROS. Detta kan vara användbart i bedömning av ROS produktion i blandad cellpopulationer. Det är viktigt att välja en antikropp för makrofag ytan markör konjugerat till en lämplig fluor som inte stör fluorescensen från oxidativ stress eller superoxid upptäckt reagensen. I detta protokoll används en antikropp för mus F4/80 konjugerat till Alexa fluor 647.

  1. Generera BMDMs, skörd och prime dem som beskrivs tidigare (avsnitt 1 och 2).
    Obs: Minst tre 6 cm plattor behövs för att utföra alla de experimentella kontroller och villkor som beskrivs nedan. En platta kommer att behandlas med anti-BSA IgG1 medan serum svälter medan de andra två plattorna kommer att lämnas obehandlade.
    1. Inkludera 4 experimentella kontroller som kommer att användas för flödescytometrisk flödesberäkning (per experiment):
      (a) ofärgade och ostimulerade celler.
      (b) celler behandlas med oxidativ stress upptäckt reagens (gröna reagent) och ROS inducerare.
      (c) celler behandlas med superoxid upptäckt reagens (orange reagent) och ROS inducerare.
      (d) cellerna färgas endast med antimus F4/80 konjugerat till Alexa 647.
    2. För varje mus eller biologiska replikera, inkludera 3 följande:
      (a) färgas med F4/80 och vänster ostimulerade
      b) färgas med F4/80 och aktiveras genom FcγR
      c) färgas med F4/80 och aktiveras genom FcγR och behandlades med ROS-hämmare
  2. Efter grundning makrofager över natten, aspirera supernatanten. Tvätta cellerna en gång med 1-2 mL PBS. Serum svälta cellerna genom att ersätta media med samma volym av låga serum DMEM. För varje mus, en platta kommer att behandlas med anti-BSA IgG1 medan serum svälter, medan de andra två plattor kommer att lämnas obehandlade. Inkubera plattorna under 4 timmar vid 37 ° C, 5% CO2.
  3. Efter serum svälter, skörda cellerna med mild skrapning eller 0,2 mM EDTA i PBS. Samla varje platta i märkt 5 mL rund botten rör och centrifugera dem vid 750 x g i 5 min. Håll koll på vilka celler behandlades med murin anti-BSA IgG1.
  4. Tvätta cell pellets en gång med 1-2 mL PBS att bli kvitt eventuella kvarvarande anti-BSA från de behandlade cellerna.
  5. Återsuspendera en av cell pellets från plattan som inte fick anti-BSA IgG1 600 µL av låga serum DMEM. Dessa celler kommer inte att utsättas för cell surface färgning. Använd dessa för ersättning kontroller. Alikvotens 200 µL av denna cellsuspension i (3) 5 mL runda botten rör märkta a) ofärgade, ostimulerade b) grön oxidativ stress reagens, ROS inducerare, c) orange superoxid upptäckt reagens + ROS inducerare.
  6. Återsuspendera en av cellen pellets från plattan som inte fick anti-BSA IgG1, i 300 µL av flödescytometri färgning buffert (PBS + 0,1% FBS). Alikvotens 100 µL av denna cellsuspension till (2) 5 mL runda botten rör för färgning med Alexa 647 antimus F4/80.
  7. Återsuspendera cell pellets från plattan som fick anti-BSA IgG1 i 300 µL av flöde flödescytometri färgning buffert. Alikvotens 100 µL av denna cellsuspension till (2) 5 mL runda botten rör för färgning med Alexa 647 antimus F4/80.
  8. Färga celler, som var aliquoted i 8.6 och 8.7, med 5 µL av Alexa 647 antimus F4/80 i 30 min på isen, i mörkret.
  9. Efter färgning, tvätt celler genom att tillsätta 2 mL PBS och centrifugera vid 750 x g, aspirera supernatanten och återsuspendera varje rör i 200 µL av låga serum DMEM utan fenolrött. Avsätta en obehandlad tub som ensamma färgade FL4 kontroll. Förbereda sonder, inducer, FcγR stimulans och ROS-hämmare som indicerat i avsnitt 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 och 6.14.
    1. För celler inte får anti-BSA IgG-1, märk rören med följande: en) ingen stimulans eller b) ROS inducerare.
    2. För celler som fått anti-BSA IgG1, etikett med följande: en) Fc XL eller b) Fc XL + hämmare.
  10. Stimulera proverna som ska användas för ersättning enligt deras respektive behandlingar som anges i 6.5-6,6, i den ordning som de kommer att läsas på en flödescytometer, införliva fördröjning mellan förvärvet av ett prov och nästa.
  11. Inkubera cellerna för 30 min vid 37 ° C, 5% CO2 i mörkret. Analysera proverna i den ordning som de var stimuleras med hjälp av en flödescytometer utrustad med en autosampler.
  12. Utföra manuella ersättning som beskrivs i 6,7-6.12 och dataanalys som beskrivs i avsnitt 7.
  13. Använda programvaran flow flödescytometri, generera och etikett 4 exempelfiler för kontroll ”ofärgade, obehandlat”, ”grön + inducerare”, ”orange + inducerare” och ”F4/80 målat” prover, se till att ange de kanaler/parametrarna för att analyseras (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) och önskad stop villkor (100 µL, 3 min, etc.).
  14. Kör exemplen och generera dot tomter att utföra manuell kompensation.
    1. För cell surface färgning, generera två ytterligare tomter: FL1 (x-axeln) vs FL4 (y-axeln) och FL2 (x-axeln) vs FL4 (y-axeln). Justera spänningarna för att säkerställa att lämplig ersättning tillämpas som visas i figur 7A. När all ersättning har fullgjorts, tillämpa matrisen ersättning till alla experimentella exempelfilerna.
  15. När manuell kompensation har utförts och en experimentell mall erhålls, starta behandling av experimentprover som anges i 6.13-6.15.3 och förvärva prover på en flödescytometer som beskrivs i 6.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använder protokollet beskrivs inom, presenterar vi representativa uppgifter som visar flöde flödescytometrisk detektion av ROS produktion som härrör från stimulering av WT C57BL/6J BMDMs genom FcγR. Som förväntat, vi observerar minimala förändringar i FL1 eller FL2 fluorescens ovan bakgrundsnivåerna i ostimulerade celler (figur 3A, jämför ”färgade, ostimulerade” vs ”ofärgade, ostimulerade” dot tomter). Vi ser en markant ökning i FL1 och FL2 fluorescens när celler stimuleras med FcγR bryggbindningen agent (figur 3A, jämför ”målat och stimuleras via Fc cross-linking” prover vs ”färgade, ostimulerade” dot tomter). Slutligen, när celler behandlades med ROS-hämmare före FcγR cross-linking, denna ökade fluorescens förs tillbaka till basala nivåer (figur 3A, jämför ”målat och behandlades med ROS-hämmare och stimuleras via Fc cross-linking” vs ”målat och stimuleras via Fc cross-linking ”dot tomter). Detta framgår också när data presenteras som ett histogram för varje kanal (figur 3B) eller när data presenteras som en procentandel av celler positivt för antingen grön eller orange ROS sonderna (figur 3 c). En liknande trend är också uppenbart när data presenteras som MFI, även om minskningen i orange fluorescens med förbehandling med ROS-hämmare inte fångas också när presenteras som MFI kontra i procent (figur 3 c). Vi presenterar också resultaten av 3 oberoende experiment utförs på olika dagar (figur 3, Experiment 1, 2 och 3). Den genomsnittliga värden och motsvarande standardavvikelsen för medelvärdet indikeras i diagrammen (figur 3 c).

Vi presenterar också misslyckade experiment, där suboptimala ROS produktion till följd av FcγR stimulering observerades (figur 4). En minimal ökning FL1 och FL2 fluorescens upptäcktes när man jämför ”målat och stimuleras via Fc cross-linking” prov vs ”färgade, ostimulerade” prov (figur 4A, B, C). Detta presenteras tillsammans med ett lyckat experiment att belysa de stora skillnaderna mellan de förvänta procentsatserna eller MFI ökar och de observerade värdena i ett misslyckat experiment.

Det nuvarande protokollet använder tredjeparts ett 24 h priming steg. När man jämför en 24 h kontra en 48 h priming tid, observerade vi ingen markant skillnad i andelen celler positiva för de gröna, oxidativ stress reagensen (figur 5A, övre histogram och räkna 5B grön probe, % positiva). Dock öka ökar priming tiden till 48 h gjorde andelen celler positivt för den orange fluorescensen (figur 5A, lägre histogram och figur 5B orange probe, % positiva). Detta återspeglades på samma sätt när data presenterades som MFI. Detta tyder på att en 48 h priming tid för optimal detektering av alla ROS arter, kan vara mer perfekt.

Med tanke på att, på grund av kostnaden eller den tid som behövs för experimenterande kanske användningen av ett kit för att utföra denna analys inte ett alternativ. Av denna anledning, vi också testat liknande komponenter till dem i kit och köpte dessa från standard leverantörer (Thermofisher, EMD Millipore, Cayman). Finner vi att använda individuellt upphandlade komponenter och samma experimentella protokoll för cell lastning och FcγR stimulering, vi kan sammanfatta många av samma resultaten vi observerade med hjälp av kit (figur 6A, B). Men ökningar av fluorescens var påtaglig med stimulering, observerades en högre nivå av ROS produktion dock med hjälp av kit. Detta kan indikera att användning av individuellt upphandlade komponenter kan vara genomförbart men skulle behöva optimeras ytterligare för denna särskilda analys.

Slutligen visar vi att det också är möjligt att kombinera cellytan färgning med dessa ROS sonder. Vi använder en känd makrofag markör, F4/80, konjugerat till Alexa 647 och utföra cellytan färgning före behandling med ROS-hämmare, ROS inducerare eller specifika stimuli att framkalla ROS produktion. Visar vi i figur 7B som makrofager svarar som förväntat när de behandlades med FcγR crosslinking agent och FcγR crosslinking agent + ROS hämmare (figur 7B, orange vs grön prick tomter). Dessutom kan vi observera ökad orange eller grön fluorescens specifikt genereras av F4/80 märkt celler vid behandling med FcγR crosslinking agent och minskas med förbehandling med ROS-hämmare (figur 7B, F4/80 vs grön och F4/80 vs orange prick tomter).

Figure 1
Figur 1: Flow flödescytometrisk bedömning av lämpliga generation av BMDMs. Vildtyp BMDMs genererades och lämnades antingen ofärgade eller betsad med FITC antimus F4/80 eller Alexa 647 antimus CD11b. FSC (x-axeln) vs SSC (y-axeln) tomter genererades och makrofager (BMDMs) var gated Uteslut döda celler och skräp. Med en tomt på FSC-H(x-axis) vs FSC-A (y-axeln), genererades en singlet grind. Gating på undertröjor, histogram genererades för att Visa cellerna färgas med antingen FITC F4/80 eller APC CD11b i jämförelse med isotypen betsad kontroll. A) rätta BMDM differentiering med mer än 95% av celler färgning positiva för CD11b eller F4/80. B) felaktiga BMDM differentiering där mindre än 95% av cellerna färgning positiva för F4/80 och 2 toppar är närvarande för CD11b. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Utför ersättning när med gröna och orange ROS sonder. Ersättning kommer att kräva ofärgade obehandlad celler, celler målat med grön ROS sond och behandlade med ROS inducerare och cellerna färgas med orange ROS sond och behandlade med ROS inducerare. Dot tomter för ofärgade obehandlad celler används för att bestämma kvadrant grindar. Data för celler ensamma färgas med antingen grön ROS sond eller orange ROS sond och behandlade med ROS inducerare visas före och efter, ersättning tillämpades. Matrisen ersättning tillämpas sedan på alla efterföljande experimentprover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Mätning av ROS som svar på specifika FcγR stimulering med hjälp av gröna och orange ROS sonder och bedömning av analysreproducerbarhet. Wild-type benmärg-derived makrofager (BMDMs) genererades, Primas, och lämnades antingen ofärgade eller färgade med en cocktail av grönt och orange ROS sonder. Färgade BMDMs lämnades antingen obehandlade, stimuleras genom deras FcγRs med murin anti-BSA IgG1 + BSA för 30 min eller behandlade med ROS-hämmare före stimulering via FcγR cross-linking. A) Dot tomter, visar en ökning i procentsatserna av celler i övre vänstra, övre högra och nedre högra kvadranterna vid specifika FcγR stimulering, som förminskas i närvaro av ROS-hämmare. B) histogram för varje kanal för fluorescens, som visar markör grinden att avgöra celler positivt för varje sond. C) Presentation av data som en procentandel av celler positivt för varje sond eller en ökning av MFI. Tre oberoende, representativ experiment presenteras. Medelvärdet för 3 experiment och standardfel för betyder visas som linjer inom grafer. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Exempel på framgångsrika och suboptimala FcγR stimulering. Vildtyp benmärg-derived makrofager (BMDMs) genererades, Primas, och lämnades antingen ofärgade eller färgade med en cocktail av grönt och orange ROS sonder. Färgade BMDMs lämnades antingen obehandlade, stimuleras genom deras FcγRs med murin anti-BSA IgG1 + BSA för 30 min eller behandlade med ROS-hämmare före stimulering via FcγR cross-linking. Representativa resultat för framgångsrika och suboptimala stimulering visas som A) dot tomter, B) histogram, eller C) procentandelen celler positivt för varje sond eller som en ökning av MFI. Framgångsrika stimulering visar ökade fluorescens i det övre vänstra, övre höger och lägre rätt kvadranter av FL1 vs FL2 tomten och ökad MFI och andelen positiva celler färgas med varje sond vid FcγR stimulering. Suboptimal stimulering visar minimal ökning MFI eller andelen positiva celler. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Effekten av priming tid på ROS generation vid FcγR stimulering. BMDMs genererades, primas för antingen 24 eller 48 h, och lämnades antingen ofärgade eller färgade med en cocktail av grönt och orange ROS sonder. Färgade BMDMs lämnades antingen obehandlade, stimuleras genom deras FcγRs med murin anti-BSA IgG1 + BSA för 30 min eller behandlade med ROS-hämmare före stimulering via FcγR cross-linking. A) histogram för fluorescensen induceras av varje sond vid stimulering av makrofager som primad för antingen 24 eller 48 h. B) andelen celler positivt för varje sond vid stimulering av makrofager som primad för antingen 24 eller 48 h. Priming makrofager för 48 h resulterade i en ökning av andelen celler positivt för ljusorange fluorescens (eller en ökning av MFI för kanalen FL2) jämfört med grundning makrofager för 24 h. Medelvärdet för 3 experiment och standardfel för betyder visas som linjer inom grafer. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Flödesmätning av flödescytometrisk ROS vid FcγR cross-linking använder reagenser från olika leverantörer. BMDMs genererades, primas för 24 h, och lämnades antingen ofärgade eller färgade med en cocktail av oxidativ stress och superoxid upptäckt sonder. Målat BMDMs var antingen vänster obehandlade, stimuleras med ROS-inducerare, stimuleras genom deras FcγRs med murin anti-BSA IgG1 + BSA för 30 min, eller behandlas med ROS-hämmare före stimulering via FcγR cross-linking. Sonder, ROS inducerare och hämmare ROS var används antingen från kit eller var köps separat från olika leverantörer och används på en liknande koncentration. A) Dot-diagram som visar en sida-vid-sida jämförelse av resultat som erhållits med hjälp av kit och icke-kit komponenter. B) histogram som visar en sida-vid-sida jämförelse av resultat som erhållits med hjälp av kit och icke-kit komponenter. FC XL, Fc cross-linking; NAC, N-acetyl-L-cystein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Att kombinera cellytan färgning med flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktionen vid FcγR cross-linking. A) Dot tomter för olika fluorescerande kanaler med ofärgade eller ensamma färgade ersättning kontroller. Vildtyp BMDMs genererades, primas för 24 h, och lämnades antingen ofärgade, färgade med Alexa 647 antimus F4/80 endast, målat med grön ROS sonden bara och behandlade med ROS inducerare eller betsad med orange ROS sond endast och behandlade med ROS inducerare. Dot tomter för ofärgade obehandlad celler används för att bestämma kvadrant grindar. Tomter visar förväntade resultat om kanaler kompenseras korrekt. På alla efterföljande experimentprover tillämpades sedan matrisen ersättning. B) Wild-type BMDMs var genereras, primas för 24 h och färgas med Alexa 647 antimus F4/80. Efteråt, var BMDMs antingen vänster ostimulerade, stimuleras genom deras FcγRs med murin anti-BSA IgG1 + BSA för 30 min, eller behandlas med ROS-hämmare före stimulering via FcγR cross-linking. Dot tomter visar att grön eller orange fluorescens specifikt produceras av F4/80 celler kan upptäckas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DCFH2-DA och DHE-baserad detektion av ROS är en allmänt använd teknik14,15. Användarvänlighet och anpassningsförmåga av dessa ROS sonder för kinetiska mikroplattan format, fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometrisk analys har bidragit till deras popularitet. Dock i våra studier av FcγR-medierad makrofag funktioner verkade det inte vara ett standardprotokoll för att utföra denna analys för flöde flödescytometrisk analys av FcγR tvärbundna celler. Reaktiva med tanke på de analyter på att utvärderas, har vi funnit att timing är avgörande för att se till att reproducerbarhet uppnås. Även om vi har även utfört kinetiska mikroplattan analyser, det kan finnas en bred variation i intensitet av fluorescens från experiment till experiment, vilket gör det svårt att aggregera biologiska replikerar för statistisk analys. Flöde flödescytometrisk användning av dessa sonder möjliggör kvantifiering av ”ROS positiva” celler som löser några av dessa frågor men är inte utan komplikationer. Detta gäller särskilt när du använder en flödescytometer utrustad med en autosampler. I det här fallet kommer att analys av ett stort antal prover påverka mängden tid cellerna exponeras för olika stimuli. För att minska detta, har vi införlivat fördröjning mellan provanalys i protokollet att se till att analysen utförs på celler stimuleras för en liknande tid.

En annan viktig faktor i flödesanalys flödescytometrisk ROS är införandet av lämpliga kontroller. Det kan inte nog betonas att varje experiment måste ha (minst) alla de experimentella och ersättning kontroller vi listar i detta protokoll. Detta är viktigt att säkerställa giltigheten av varje experiment samt att kunna rätta utesluta prover om det behövs. Några exempel på detta är om makrofager inte skilja/mogen på lämpligt sätt och uppvisade mycket lägre ROS-produktionen även med inducerare behandling. Ett annat fall kan vara olämpligt aktivering av makrofager även före FcγR bryggbindningen, vilket resulterar i en hög basal ROS signal. Användning av ROS-hämmare i samband med specifika FcγR tvärbindande visar försvinnandet av fluorescerande signaler är en annan viktig kontroll vi har ofta hittat saknas i andra studier som utför liknande analyser. De ROS-hämmare som används i denna studie, N-acetyl-L-cystein, betraktas som en universell ROS-hämmare. Dock om man är intresserad av ROS produceras av specifika enzymer, kan andra ROS hämmare inkluderas i analysen också. Några exempel är mefanamic syra (cyklooxygenas-beroende ROS-hämmare), apocynin (NADPH-oxidas-beroende ROS-hämmare) eller allopurinol (en xantin oxidas-beroende ROS hämmare).

Det är dessutom viktigt att förstå vad mäts faktiskt i denna avläsning. Som tidigare nämnts, DCFH2-DA mäter flera ROS arter, och så, fluorescens följd grön sonden kan inte användas för att diskriminera en ROS art från en annan14. Jämväl, orange sonden (sannolikt DHE), även om ofta nämns som superoxid specifika, kan producera både superoxid-specifika och superoxid-oberoende oxidationsprodukter, vilka inte kan särskiljas utan användning av ytterligare tekniker såsom HPLC 15. för tillämpning av mätning ”totala ROS” eller ”inducerad ROS” under respiratory burst, använda av dessa sonder tillsammans med lämpliga kontroller, kan dock vara godtagbar. Många nya fluorescerande baserat ROS sensorer har uppstått eller är utvecklade11,13. Vissa, såsom de redox-känsliga fluorescerande proteinerna, har fördelen av en dynamisk mätning av ROS produktionen på grund av deras reversibla oxidation. Dock skulle dessa kräver genetisk manipulering av celler, som inte kanske alltid är genomförbara eller önskat. I många fall fluorescerande sond-baserade ROS upptäckt är fortfarande ett giltigt och användbart verktyg, så länge experimentet är standardiserade, välkontrollerade, och slutsatserna som härrör från sådana experiment är inte överskattas.

Fördelarna med att använda detta kommersiellt tillgängliga ROS-kit är att alla nödvändiga reagens inklusive ROS-inducerare, asätare och titrerad sonder ingår och ”ready-to-use”. Om perioden av experimenterande förväntas vara kortfattad (färdig inom en vecka), kan detta kit ge en mer kostnadseffektiv metod för att utföra flöde flödescytometri-baserade ROS upptäckt utan att behöva köpa eller optimera varje specifik komponent individuellt. Vi dessutom påvisa med hjälp av detta kit med en specifik agonist (FcγR stimulering) och påvisa reproducerbarhet över experiment; Vi bedömer effekterna av priming gånger på ROS släkte; vi jämför med liknande sonder hämmare och inducerare från olika företag; Vi ger exempel på misslyckade experiment; och slutligen, vi kombinerar cellytan färgning med användning av dessa ROS sonder. Detta skulle potentiellt möjliggör samtidig identifiering av ROS från olika celltyper inom en blandad befolkning, som kräver mindre prov och reagenser. Till exempel kan detta vara särskilt användbart när skilja makrofager och neutrofiler-derived ROS, de viktigaste celltyper som kan svara på FcγR ligatur. För flera experiment som måste utföras med lång mellanliggande perioder däremellan, kan ett kit inte användas som ideal. Flera portioner av sonderna tillhandahålls inte och efter beredning, tillverkaren endast rekommenderar att reagens användas inom en vecka (som ROS sonder är mycket reaktiva). Om det förväntas att denna period är oförenlig med experiment, rekommenderar vi att enskilda reagenser snarare än ett kit köpas separat och färdigställts bara under dagen av experimenterande. Som vi visar här, kan ytterligare optimering av individuellt inköpta komponenter dessutom behövas före analysen. Sammantaget hoppas vi att detta arbete ger en användbar resurs för forskare som använder flödescytometri reproducibly mäta ROS generation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka övriga ledamöter i Tigno-Aranjuez labbet inklusive Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy och Roopin Singh för deras hjälp i laboratoriet underhåll och mus kolonin underhåll. Stöd för denna forskning tillhandahölls av grant R00 HL122365 och nystartade fonder till J.T.T-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Tags

Immunologi och infektion fråga 145 reaktiva syreradikaler (ROS) flow Fc gamma receptor (FcγR) makrofager Fc-receptorer flödescytometri respiratory burst
Flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktion i makrofager som svar på FcγR Cross-linking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J.… More

Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter