Summary
I vivo pattedyr modeller av kritisk-størrelse bein mangler er viktig for forskerne studere helbredende mekanismer og Ortopedisk behandling. Her introduserer vi en protokoll for etableringen av reproduserbar, Segmentinformasjon, femur defekter i rotter stabilisert bruker eksterne fiksering.
Abstract
Ortopedisk forskning stoler tungt på dyremodeller å studere mekanismer av bein i vivo , samt undersøke nye behandlingsteknikker. Kritisk størrelse Segmentinformasjon defekter er utfordrende for å behandle klinisk og forskningsinnsats kan ha nytte av en pålitelig, ambulerende liten dyr modell av en Segmentinformasjon femur defekt. I denne studien presenterer vi en optimalisert kirurgisk protokoll for konsekvent og reproduserbar etableringen av 5 mm kritiske diaphyseal feil i en rotte femur stabilisert med en ekstern fixator. Diaphyseal ostectomy ble utført ved hjelp av en egendefinert gigg plassere 4 Kirschner ledninger bicortically, som var stabilisert med en tilpasset eksterne fixator enhet. En oscillerende bein sagen ble brukt til å opprette feilen. En kollagen svamp alene eller en kollagen svamp dynket i rhBMP-2 ble implantert i feilen, og bein helbredelsen var overvåket over 12 uker med radiographs. Etter 12 uker, rotter ble ofret, og histologiske analyse var utført på kontrollen forbrukeravgift og behandlet femurs. Bein defekter som inneholder bare kollagen svamp resulterte i ikke-union, mens rhBMP-2 behandling gitt dannelsen av en periostal ufølsom og nye Ben-nydannelse. Dyr gjenopprettede godt etter implantasjon, og eksterne fiksering vist seg vellykket i å stabilisere femur defekter over 12 uker. Denne strømlinjeformet kirurgisk modellen kan lett brukes for å studere bein healing og teste nye Ortopedisk biologisk materiale og regenerativ Therapy i vivo.
Introduction
Ortopedisk traumer kirurgi fokuserer på behandling av en rekke komplekse frakturer. Kritisk diaphyseal Segmentinformasjon bein mangler har vist seg vanskelig å behandle klinisk på grunn av redusert regenerativ evne til omkringliggende muskler og periosteum samt mislykkede lokalisert angiogenese1. Moderne behandlingsteknikker inkluderer operative fiksering med Bentransplantering, forsinket Bentransplantering (Masquelet), bein transport, fusjon eller amputasjon2,3,4. I de fleste pasienter som har ambulerende funksjonen bevart etter sine traumer, med velfungerende distale lemmer, er lem restverdi klart en bedre behandling alternativet5. Disse berge behandlinger krever ofte trinnvis kirurgiske inngrep over en lang behandlingsperiode. Noen forfattere har antydet at eksterne fiksering er overlegen i forhold til den interne fiksering for disse programmene på grunn av redusert tissue skaden under implantasjon, redusert implantert areal, og økt postoperativ justering av fixator6. Imidlertid er en potensiell randomisert kontrollert studie for tiden i gang å avklare denne kontroversen interne versus eksterne fiksering i alvorlig åpent brudd i tibia7. Dessverre, med enten behandling valgt, betydelig komplikasjon og feil priser vedvarer8,9. Med enten behandlingsmetode, med hensyn til Segmentinformasjon bein tapet, må kirurgen kjempe med Segmentinformasjon diaphyseal defekter som betydelige utfordringer. Rettelser Segmentinformasjon feil må maksimere bein stabilisering og samtidig forbedre den osteogenic prosess10,11.
På grunn av klinisk betydning, men det lavere volumet, kritisk størrelse diaphyseal Segmentinformasjon defekter, er et effektivt, reproduserbare dyremodell nødvendig å aktivere forskergrupper å fremme behandlingsteknikker og til slutt bedre kliniske utfall. Forskerne trenger å studere i vivo fysiologiske helbredende mekanismer i et pattedyr dyremodell. Mens slike modeller av eksterne fiksering allerede finnes12,13,14,15, håper vi å gi en sikrere metode for ikke-fagforeninger i ubehandlet dyrene, redusere kostnader gjennom valg av rimelig fixator materialer og disposisjon en direkte kirurgisk protokoll for lett programmet til fremtidige studier. Hovedmålet med denne protokollen er å etablere en pålitelig og reproduserbar modell av en kritisk diaphyseal feil i rotter. Prosedyren ble evaluert av taksere stabilisering og bein healing i rotte femurs over 12 uker. Sekundær målene inkludert: gjør en rimelig modell som en kostnadseffektiv som mulig, forenkle kirurgisk tilnærming og stabilisering, og sikre etiske av dyrene. Forfattere og forskningsteam gjennomført foreløpige eksperimenter med en rekke forskjellige biologisk materiale og potensielle regenerativ Therapy å forbedre healing i denne Segmentinformasjon defekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rotter brukt i denne studien mottatt daglig omsorg AVMA retningslinjer for Euthanasia for Animals: 2013 Edition16. Institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of Wisconsin-Madison evaluert og godkjent denne eksperimentelle protokollen før prosjektet begynte.
1. dyr
- Bruk outbred Sprague-Dawley mannlig rotter veier ca 350 g.
2. forberedelse av bein Morfogenetiske proteinet-2 (rhBMP-2) gjennomvåt svamp stillaser
Merk: Scaffold forberedelse bør skje like før implantasjon i femur (se trinn 6.14).
- Følg instruksjonene fra produsenten for bruk av en etablert rhBMP-2 bein pode kit inneholder en kollagen svamp, lyofilisert rhBMP-2 og sterilt vann for rekonstituering17. Opprettholde sterilitet, Rekonstituer rhBMP-2 med sterilt vann til en konsentrasjon på 1,5 mg/mL.
- Bruke sterilt saks og en steril hersker, trim rhBMP-2 gjennomvåt kollagen svamp å omforme tilpasses en 5 x 3 mm x 3 mm-feil.
- Bruker en sprøyte, distribuere rhBMP-2 løsningen jevnt over kollagen svamp slik at det er absorbert.
3. forberedelse av egendefinerte eksterne fiksering enhet
Merk: Se figur 1A for en mer fullstendig liste av dimensjoner.
- Kutte ark lager (type 6061, 0.088" tykkelse) til to stykker (1,4" x 6") bruker en stikksag eller andre aktuelle verktøyet.
- Montere ett stykke i fresemaskin, og bruker en 1/8†90°-punkts karbid drill mill, kuttet fire "V" riller (0,035-"dyp) på langs. La den andre brikken gratis kutt.
- Kutte trykkplatene 0,3" bredde fra to stykker (figur 1B). Mål og bore hullene for 4-40 tråd. Trykk plate med 'V' grooves med 4-40 tråden. Bore plate uten riller for en #4 skruen kroppen drill.
- Sand begge brikkene runde hjørner og redusere vekten (figur 1 c).
- Skru delene sammen med 4-40, 18-8 rustfritt stål knappen cap skruene (0,25") slik at sporene er flush mot vanlig platen (figur 1 d)
4. anesthetic prosedyren og analgesi
- Indusere anestesi ved å plassere rotta i induksjon kammer levere 4 L O2/minutt med 4% isoflurane.
FORSIKTIG: Forskning personell må unngå innånding bedøvende gass og vedlikeholde riktig hette og ventilasjon i laboratoriet. - Fjern rotta fra kammeret når rotta mister rettende refleks, feste en nesen kjegle og plasser på vedlikehold dose av anestesi gjennom nesen (O2 leveransetakt til 2-3 L/min og 0,8% isoflurane).
- Sett rotta på oppvarming pad eller under oppvarming lyset å hindre nedkjøling.
- Bekreft tilstrekkelig dybden av anestesi ved å knipe tå eller tester det palpebral refleks.
- Gjelde smøring øyne å hindre uttørking av hornhinnen.
- Levere en injeksjon av utvidet utgivelse buprenorfin (1 mg/kg) på stammen/dorsum av rotte, langt fra det kirurgiske området analgesi for opptil 3 dager etter operasjonen.
5. aseptiske forberedelse og antibiotika preventatives
- Barbere området rundt hindleg med 13th vrborden, foten, dorsal midtlinjen og ventrale midtlinjen som margene.
- Skrubbe barberte området ved hjelp av sterilt 2 x 2 gasbind fuktet med 10% povidon-jod etterfulgt av 70% EtOH (4 ganger hver, alternerende).
- Administrere en intramuskulær injeksjon av cefazolin (20 mg/kg) i operativ quadriceps.
- Administrere enrofloxacin (0,25 mg/ml) i drikkevann i 7 dager postoperatively for fortsatt antibiotika beskyttelse.
- Plasser rotter på medicated feed (f.eks Uniprim) for varigheten av studien å hindre pin skrift infeksjoner.
- Gjelde dobbel antibiotikaresistens sårsalve hud-pinners grensesnittet en gang daglig i 3 dager postoperatively.
Merk: Unngå alle eksterne fiksering pin eller klemme løsne som kan bidra til utviklingen av en infeksjon.
6. kirurgisk prosedyre
Merk: Gjøre en felles innsats for å opprettholde et sterilt felt og arbeidsområdet og følg steril teknikk gjennom hele saken.
- Utvide barbert ben gjennom fenestrated, klart klissete drapere og dekke kirurgisk benk i sterilt håndklær til å opprette et sterilt felt.
- Palpate femur og bruker et #15 blad til å opprette et anterolaterale snitt gjennom huden strekker seg fra patella til den større trochanter ved den proksimale femur.
- Nøye incise lateral etappe fascia langs den intermuscular septum skille vastus lateralis muskler av quadriceps peke fra hamstrings posteriorly til laterale femur er utsatt. Bevare bortfører gluteal sene innsettingspunktet på det større trochanter.
- Utfør en forsiktig, atraumatiske omkrets bløtvev disseksjon og utsette femur ved sin midt diaphysis på lateral overflaten. Dette bruk en #15 bladet forsiktig kutte muskelen fra det underliggende Ben ved å holde bladet parallelt mot konturene av bein overflaten. Bruk en periostal heis til å løfte muskelen fra utsatt bein som det er dissekert og fortsett rundt femur akselen til 7-10 mm sentrale diaphysis er ryddet av bløtvevet på alle sider å forberede ostectomy.
Merk: Unngå skade mediale femur nevrovaskulære bunten. - Sett inn fire 1.0 mm Kirschner (k) ledninger: 2 proksimale og 2 distale i femur vinkelrett lateral femur, regissert rett lateral til mediale. Kontroller alle pinnene engasjere begge halvdelene (bicortical) for tilstrekkelig stabilitet (figur 2A).
- Start med den distale mest pin først bare på nivået av lateral epicondyle. Sted jig flush til laterale distale femur og sett en 1,0 gjengede tips k-ledning.
- Opprettholde plasseringen av jig på benet, identifisere hvor mest proksimale pin inn benet basert på jig hullene. Når posisjonen bestemmes, nøye incise parallelt med fiber av gluteal senen som trengs for å lage et lite gap i vevet etter proksimale pin å passere, således minimere iatrogenic skade senen. Bore en 1.0 mm ikke-gjenger k-wire dette gapet, igjen sikrer pin engasjerer begge halvdelene (figur 2B).
- Opprettholde det jig posisjon i kontakt med bein og bore to 1.0 mm gjenger k-ledninger, en på hver side av webområdet fremtidige defekt. Sikre pinnene engasjere begge halvdelene (figur 2C).
- Sett den eksterne fixator bar nivå 1 cm over huden og skru tett, låse bar i stedet. Klipp overflødig pin lengder (figur 2D).
- Klargjør for ostectomy (defekt etableringen) ved å plassere en liten, buet festepunkt rundt fremre og bakre femur å beskytte den omkringliggende bløtvev, muskel og nevrovaskulære bunt. Utnytte en ~ 5 mm sagittal oscillerende så blad, veldig forsiktig opprette en 5 mm Segmentinformasjon defekt gjennom midten av diaphysis. Bruk en lys, jevnt trykk med så å unngå unødvendige brudd (figur 2E).
- Bruke små mengder vanning (romtemperatur 0,9% sterilt normal saline (NS)) etter behov under oppretting feil å unngå termisk nekrose av benet.
- Tømme såret med 10 mL av NS etter skaper feilen.
- Administrere 0,1 mL av en 0.25% bupivacaine med adrenalin (1:200, 000) til såret som smertestillende og vasoconstrictor.
- Sett inn skafottet (5 mm x 3 x 3 mm) av kollagen svamp eller rhBMP-2 gjennomvåt svamp (fra trinn 2) inn feilen. Hver stillaset skal ha riktig størrelse for å span lengde og volumet av feilen, hjelpe svamp bo i posisjon.
Merk: på dette punktet, mRNA kan være forberedt og injisert som beskrevet i fremgangsmåten 7.1-7.3 nedenfor hvis utfører bioluminescens bildebehandling. - Lukk muskel flyet med enkel avbrutt mønsteret med 4-0 absorberbare Sutur. Lukk huden laget med en løpende subcuticular mønster med 4-0 absorberbare Sutur og huden lim lukke hull rundt de utstikkende pinnene.
- Fjerne rotta fra nesen kjegle, på oppvarming pad, og overvåker kontinuerlig til rotta er kjøpedyktig Oppretthold en oppreist kroppsholdning. På dette punktet, plasser i en ren bur gjenopprette.
7. forberedelse av kompleksbundet mRNA og bioluminesens bildebehandling
Merk: Hva med mRNA komplekser bør utføres under operasjonen 1 dag før luminescence bildebehandling. Bruke sterilt teknikker ved håndtering mRNA.
- Bland 10 µL av mRNA koding for Gaussia luciferase (lager konsentrasjon av 1 µg/µL) med 30 µL av lipidic transfecting agent.
- Kan mRNA-lipid komplekser skjemaet ved rugende i minst 5 minutter ved romtemperatur. Lipidic transfecting agent vil kondensere mRNA molekyler, stabilisere dem og styrke transfection effektivitet.
Merk: Hvis komplekser ikke brukes umiddelbart, lagre dem i isen for maksimalt 1 h. - Bruker en 20 µL pipette utstyrt med filtrerte tips, injisere halvparten av volumet av mRNA komplekser til distale og proksimale endene av feilen, henholdsvis.
- Dagen 3 min før bildebehandling, bedøve rotta bruker inhalerte isoflurane som beskrevet tidligere i trinn 4.1.
- Plasser rotta i en i vivo imaging kammer utstyrt med en nesen membran leverer vedlikehold isoflurane (0,8% isoflurane, O2 leveransetakt på 2-3 L/min).
- Sette inn coelenterazine resuspended i saltvann på en dose av 4 mg/kg kroppsvekt i nærheten av feilen.
- Hente bioluminescens bilder med i vivo tenkelig system (IVIS) i henhold til produsentens instruksjoner18.
8. imaging-protokollen
- Etter kalibrering vanlig røntgen maskinen, en x-rokke system19, bedøve rotte bruker inhalerte isoflurane som beskrevet tidligere (se trinn 4.1) og plassere rotta på en nesen kjegle med inhalert isoflurane (0,8% isoflurane, O2 levering rate på 2-3 L/min) for en anteroposterior (AP) femur røntgenbilde.
- Mens rotta er sternal recumbency, fremme den kirurgiske hindlimb fremover, bøye ved hoftene og kvele felles. Flex kveler felles ca 90 ° grader. Tape pote plantar siden ned, nær kroppen veggen. Plasser tibia frem fra femur å eliminere muligheten for overlappende bein. For å gi liten bortføring av hoften, plasserer du en gjennomsiktig svamp (ca 15 mm tykk) i regionen lyske. Deretter få et anterior-posterior (skallen-caudal) bilde av femur.
- Gjenta denne AP femur røntgen visningen umiddelbart etter kirurgi, 4 uker, og 12 uker. Bruke tape og gasbind til riktig posisjon dyrets extremity for kvalitet og konsekvent bildebehandling.
- Fjerne rotta fra nesen kjegle og overvåker kontinuerlig til rotta er kjøpedyktig Oppretthold en oppreist kroppsholdning. Deretter plassere tilbake i buret.
9. histologiske prosedyre
- Euthanize rotter i et kammer med inhalert CO2 etter AVMA etiske standarder16.
- Følgende dødshjelp, barbere hindlimb, Fjern skinnet fra operative enden og disarticulate femur ved hoften. Nøye fjerne alle myke vev fra operativ femur (inkludert alle muskler, sener og leddbånd). La bare et tynt lag av muskler rundt defekt området for å beskytte helbredende regionen mot utilsiktet skade under disseksjon.
- Plasser femur i 10% nøytrale fullbufrede Formalin ved romtemperatur for 3-4 dager å tillate fiksering. Holde en 15:1 formalin til vev volumkontrollen. Endre løsningen når halvveis gjennom fiksering prosessen.
- Avkalke femur i en 15% Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 6,5 løsning for 3-4 uker. Samle føljetong røntgenbilder for å fastslå Avkalking endepunkt.
- Halvere femur langs med et kutt fra fremre bakre i midt-sagittal flyet. Sende vev for standard parafininnstøper og hematoxylin og eosin (H & E) flekker.
- Sende H & E lysbilder å en patologen for histologiske vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Operasjoner ble utført på omtrent én time etter én kirurg ved hjelp av en assistent. Etter kirurgisk optimalisering, intra- og postoperativ komplikasjoner var sterkt minimert og bruk av jig apparatet sikret enhetlig størrelse (5 x 3 x 3 mm) og lokalisering av femur defekter. Rotter var ambulerende umiddelbart utvinning fra anestesi og synes ikke å ha noen forandret atferdsmønster; deres gangart var ikke antalgic, og de synes ikke å bli forstyrret av den eksterne fixator.
Non-threaded k-ledninger ble valgt for mest proksimale pin (figur 2B), som den proksimale pin hadde den høyeste risikoen for bryte når koblede ledninger ble brukt. I noen tilfeller, særlig i kontrollen kontrollere dyr uten rhBMP-2 eller stillaser som mangler viste bevis for helbredelse/bein formasjon, én eller flere k-wire tips brøt etter ca 8 uker som sett i svamp bare røntgenbilde av forbrukeravgift femur ( Figur 3).
Røntgenbilder og histology (H & E flekken) ble analysert for å måle graden av bein helbredelse. Negativ kontroll mangler som inneholder bare en kollagen svamp viste ingen tegn til brobygging osteogenesis mellom proksimale og distale Ben kantene (Figur 3, Figur 4). En liten mengde nye ubalanse kan sees direkte tilknytning til kutt femur kanten; feilen selv viser en mangel på benete materiale, tilstedeværelse av brusk og noen gjenværende hematom (Figur 4). Defekter som inneholder rhBMP-2 gjennomvåt svamp vist betydelig bein healing så tidlig som 4 uker etter operasjonen, som vist av den kan lett identifiseres ufølsom bygge bro over feil i Figur 3. Ved 12 uker, betydelige nye mineral avsetning (Figur 4, NB: nye bein, PC: periostal ufølsom) har dannet gjennom feilen. Betydelige nye periostal bein kan sees i den ufølsom strekker seg fra kutt femur kanten, og spiklene av vevet og lamellær Ben har utviklet gjennom feilen. Brusk deponering er ikke sett (Figur 4).
Histology (H & E flekken) ble også utført for både en infisert kontroll og et eksempel på en infisert femur (figur 5). Infiserte femur er betydelig utvidet, viser tegn til en endosteal reaksjonen infiltrere bein cortex. Pilene angir områder av osteoclast-mediert patologisk benresorpsjon. Infisert femur cortex er kompakt og med et klart avgrenset lamellær cortex. Antibiotika dosering var optimalisert for å inkludere maksimal presseomtalen postoperatively. Mens infeksjon rundt området feil kan oppstå, fortsatt administrasjon av antibiotika dagsaktuellt rundt pin nettsteder og vann og kosthold framgangsrikt minimere postoperativ infeksjon.
Videre imaging bruker I Vivo Imaging System (IVIS) viser evne til bioluminescent celler å visualiseres i feilen etter implantasjon av den eksterne fixator (figur 6). Ekstern plate kan lett fjernes for bildebehandling og erstattes ved ferdigstillelse. Celler i medullær hulrom luminesce etter hva med kompleksbundet mRNA koding for Gaussia luciferase. Høyeste luminescence er fokusert på stedet av femur feilen og signalet er ikke hindret av fiksering enheten pinner. Dette er lovende for fremtidige studier stole på bioluminescens eller fluorescens måle biologiske endringer som et genet eller protein uttrykk i helbredelsesprosessen.
Figur 1: Eksterne fixator fabrikasjon. A: CAD skjematisk av den sammensatte eksterne fixator med kommenterte dimensjoner for riktig fabrikasjon. Hver fixator er sammensatt av to aluminiumsplater holdt sammen med to skruer. B: platene er kuttet fra 1,4 "x 6" aluminium ark med 'V' spor kuttes i bunnen av arket. C: skruehullene er boret inn i platene (gjenger i platen med 'V' grooves) og alle kanter og hjørner er pusset rundt og redusere vekten. D: montert eksternt fixator strammes med skruene (4-40 x 0,25", 18-8 rustfritt stål knappen hodet cap) når pinner er på plass i 'V' rillene på innsiden av aluminium platene. Venstre pin er ikke-gjenger og mest proksimale på femur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk av pin plassering, fixator plassering og defekt etableringen. A: distale pin (1.0 mm gjenger k-wire) er plassert på epicondyle metaphyseal regionen med dekopaj (blå firkant) til å lede riktig pin innsetting. Dekopaj plasseres på anterolaterale femur overflaten. B: proksimale pin (1.0 mm ikke-gjenger k-wire) er plassert bruker dekopaj etter et lite innsnitt i gluteal senen. C: midten pinnene (1.0 mm gjenger k-wire) settes bruker dekopaj. D: jigg er fjernet og 2 platene er knyttet til pinnene bruker de 2 skruene for å sikre platene. Platene er strammet 1 cm over huden nivå å unngå press på huden. E: en sagittal oscillerende så brukes til å opprette en 5 mm defekt mellom de to midterste pinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant høyoppløselig røntgenbilder Vis bein healing med rhBMP-2 behandling. Bilder for negativ kontroll kollagen svamp og rhBMP-2 gjennomvåt svamp gruppene vises på 0, 4 og 12 uker postoperatively. RhBMP-2 behandlingsgruppe utstillinger betydelige healing etter 4 uker med ufølsom spenner over feilen. Negativ kontroll femur ender gro. ikke med brokobling bein og feilen er fortsatt en ikke-union. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Betydelige nye bein formasjon er sett med rhBMP-2 behandling. Representant 4 x forstørret H & E histologiske bilder for negativ kontroll kollagen svamp og rhBMP-2 gjennomvåt svamp grupper både ytterst kutt femur og feilen. Nye bein dannet rundt kontroll femur kanten, men betydelig utvidelser av både nye trabekulært bein samt periostal ufølsom prosjektet fra behandlet femur. Ingen benete materiale er sett i kontroll mangelen, mens betydelig bein formasjon kan observeres hele rhBMP-2 behandlet feilen. NB: nye bein, F: femur, C: brusk, H: blødning, PC: periostal ufølsom. Skala bar: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Infisert femur utstillinger hypertrofi og provoserende celle markører. H & E histologiske bilder av en infisert femur sammenlignet med en infisert femur, i full størrelse og 4 x forstørrelse eske steder. Infisert femur cortex er organisert og kodedel, med liten betennelse. Infiserte femur forstørrer sterkt, sett i full størrelse og cortex er brutt opp av benresorpsjon og nekrose (lilla celle klynger angitt av svarte piler). F: femur. Skala bar: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Gaussia luciferase signal oppdaget i mangelen. Transfekterte med Gaussia luciferase mRNA er avbildet med IVIS etter ekstern plate fjerning luminescence av celler. Rødt angir høyeste luminescence intensiteten på stedet av femur feilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Små dyr modeller av Ortopedisk skader som fullstendig benbrudd aktiverer forskning som utforsker mekanismer for osteogenesis og vurdere terapeutiske potensialet i biologisk materiale20. Denne studien introduserer rotte Segmentinformasjon feil modell stabiliseres av en egendefinert eksterne fixator som en lab og biomedisinsk engineering team kan lett reprodusere for videre studier av bærende osteosynthetic bein reparasjon.
Tidligere studier med kritisk størrelse defekter i rotte modeller vanligvis stole på interne fiksering, plater,21,,22,,23,,24. Selv om enten fiksering er klinisk akseptabelt, har eksterne fiksering forskjellige fordelene forårsaker mindre bløtvev avbrudd og blodtap, redusere totale implantert arealet for å redusere mulighetene for bakteriell kolonisering, og tillate postoperativ justerbarhet og trinnvis kirurgiske inngrep6. Tidligere eksterne fiksering dyr brudd modeller har brukt ulike plate materialer, pin securement eller bein kutte metoder12,13,14. Fordi den eksterne fixator i denne protokollen ble gjort i lab workshop med rimelig aluminium og kan være lett oppussede ble utgifter minimert. Dette gir en økonomisk eksterne fixator tillater forskere å utføre eksperimenter med flere dyr grupper uten tilværelse begrenset økonomisk. Sammenlignet med en intern fiksering modell tror vi at dette systemet er teknisk enklere og mer reproduserbare i en liten dyr modell. Vår erfaring med disse modellene, interne fiksering er betydelig mer krevende teknisk og kan kreve egendefinert-maskinert implantater. Forfatternes vet, denne generelle protokollen er unik i sin bruk av en spesialdesignet gigg kombinert med en tilpasset metall eksterne fixator design15, samt bruken av en oscillerende bein så bedre representerer vanlige klinisk scenariet av periostal stripping utført for å forberede brudd nettsteder fiksering. En endelig oppmerksom på bruk av en oscillerende så i denne modellen er at varmen generert og periostal avbrudd som oppstår gir en siste elementet for kontroll i forming en ikke-unionen modell. Vår erfaring er at med andre metoder, i disse dyr modeller, etterforskere risikerer kontrollene helbredelse.
For å sikre kirurgisk suksess, forsiktighet bør utvises på flere viktige trinn: Når incising og utføre omkrets dissection å avsløre femur fra omkringliggende muskler, unngår forstyrrende i sciatic nerve caudally, femur fartøyene medialt, og gluteal sene proximally. Pass på å plassere jig apparater parallell og flush mot flat, anterolaterale ansiktet av femur slik at alle pinnene er nettopp vinkelrett til benet. Dette bekrefter det lated oppstilling av det eksterne fixator og redusere sannsynligheten for pin brekkasje. Rekkefølgen på pin plassering funnet å være enkleste var distale først, etterfulgt av proksimale og deretter både midt pinner. Dette tillatt for mindre avbrudd i gluteal senen av proksimale pin. Til slutt, er det viktig at hver pin er plassert bicortically, gjennomtrengende begge halvdelene slik at det ikke ut av benet eller Skift til medullær hulrom.
En x-ray maskin kan høyoppløselig røntgenfotograferingen ble brukt til å overvåke statusen for bein-healing som kvalitative endringer kan visualiseres enkelt og ikke-invasively over tid. Imidlertid er konsekvent etappe posisjonering avgjørende for nøyaktig røntgen tolkning som forskjeller i plassering kan være misvisende. Resultater fra denne studien er enige med tidligere arbeid viser at en 5 mm femur defekten forhindrer spontan bein healing i vanlig rotter25. Derfor registrert noen healing som er med ekstra terapier som rhBMP-2 gjennomvåt svamp kan definitively tilskrives respektive behandling (Figur 3).
Mulige bekymringer for denne teknikken inkluderer pin brekkasje, løsne og infeksjon. Problemer med proksimale pin brudd i foreløpige tester bedt om en bryter fra gjengede til ikke-gjenger k-wire. Non-threaded pins er mekanisk sterkere, men også utgjør mer fare for backing ut på cortex. Spesielt i tomme Ben defekter, k-ledninger kan bryte eller bli fordrevet rundt 8 uker på grunn av langvarig syklisk pin lasting og mangel av healing (tilsvarende til sykling/bøying en binders). En streng antibiotikumet område ble benyttet for å inkludere en umiddelbar cefazolin injeksjon, daglig bruk av antibiotika sårsalve på webområdet snitt, 7 dager i enrofloxacin lagt til drikkevann, og en medicated feed. Denne antibiotika protokollen, sammen med den riktige kirurgiske teknikker skissert ovenfor, minimert infeksjon (figur 5).
En av de ekstra fordelene ved hjelp av eksterne fiksering i en dyremodell er enkel fjerning for en uhindret utsikt over defekt og erstatning etter bildebehandling. Dette gjør mer effektive i vivo imaging teknikker stole på fluorescens eller luminescence å vurdere endringer i genet eller protein uttrykk. Vi har for eksempel vist at celler i medullær hulrom transfekterte med kompleksbundet mRNA koding for Gaussia luciferase kan visualiseres med IVIS. Figur 6 illustrerer at luminescence signal oppdagelsen evnen ikke er hindret av denne eksterne fiksering tilnærmingen som det kan være med interne plater, skruer, eller mulig intramedulær negler21,22,23 , 24. Denne kostnadseffektive og reproduserbar kirurgisk protokollen gir konsekvent etableringen og stabilisering av en kritisk størrelse femur defekt som etterligner den første kliniske behandlingen av disse komplekse frakturer. Etablering av en pålitelig dyremodell er avgjørende for noen eksperimentelle behandlinger ment for eventuell klinisk bruk. Vår modell har vist forutsigbare resultater og minimal atferdsendringer eller ubehag i dyr. Denne modellen kan brukes med en rekke biomateriale-baserte stillaser sammen med imaging teknikker brukes i dette dokumentet for fremtidige translasjonsforskning testeformål. Det er vårt håp at arbeider med denne modellen, forskere vil kunne utarbeide romanen måter å behandle kritiske benete defekter i traumer pasienter. Dette kan hjelpe unngå sykelighet og kostnader i lange behandlinger for tiden ansatt og muligens redusere antall amputasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller fordeler. Det er ingen fordeler mottatt direkte eller indirekte av forfatterne av denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en NIH utstyr Grant 1S10OD023676-01 med ekstra støtte University of Wisconsins avdelinger av ortopedi og rehabilitering og School of Medicine og folkehelse. Vi ønsker å erkjenne UW'S Carbone Cancer Center støtte Grant P30 CA014520 og bruk av deres liten dyr Imaging anlegg, samt NIH trening Grant 5T35OD011078-08 for støtte av H. Martin. Vi takker også Michael og Mary Sue Shannon for deres støtte av muskel gjenfødelse partnerskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R. The mechanics of external fixation. The Musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery. 3 (1), 13-29 (2007).
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
