Summary
نقدم تقنية الخلوية الوراثية بسيطة باستخدام 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لتحديد معدل الإخصاب والابتدائي نسبة الجنس من الآفات هابلوديبلويد الغازية حيث دراسة.
Abstract
أنواع قليلة من مص ساب ويتيفليس هي بعض من الآفات الأرضية الأكثر ضررا في العالم بسبب أنها تلحق الضرر المحاصيل وفيروسات النباتات أنها متجهة. على الرغم من العديد من الدراسات لعلم الأحياء من هذه الأنواع في البيئات المختلفة، معلمة تاريخ حياته رئيسية، ذرية النسب بين الجنسين، تلقي اهتماما قليلاً، وهو بعد هام للتنبؤ بالديناميات السكانية. نسبة الجنس الأولية (نسبة الجنس في أوفيبوسيشن) من حيث دراسة قط أبلغ ولكن يمكن العثور عليها بتحديد معدل إخصاب البيض من هذه الحشرة هابلوديبلويد. الأسلوب الذي ينطوي على ديتشوريونيشن البيض مع التبييض، وسلسلة من خطوات التثبيت، والتطبيق العام الحمض النووي الفلورسنت وصمة عار، DAPI (4، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، وصبغة فلورسنت الحمض النووي ملزم)، لربط برونوكلي الذكور والإناث. نقدم هنا، التقنية، ومثالا لتطبيقه، اختبار ما إذا كان بكتيريا اندوسيمبيوتيك، الريكتسية sp. nr. بيلي، تتأثر نسبة الجنس الأولية من حيث (ب). قد يساعد هذا الأسلوب في الدراسات السكانية من ويتيفليس، أو في تحديد ما إذا كان يوجد تخصيص الجنس مع بعض المحفزات البيئية.
Introduction
دراسة تخصيص الجنس أو الاستثمار النسبي في نسل الذكور والإناث، حجر زاوية في الإيكولوجيا السلوكية1،،من23. بالإضافة إلى قوتها لاختبار نماذج التكيف للسلوك، يمكن أن يحسن معرفة استراتيجية تخصيص الجنس كائن نماذج في ديناميات السكان. في كثير من الأنواع، وتخصيص الجنس يسيطر الأمهات. لتحديد تخصيص الجنس، من المهم تحديد نسبة الجنس الأساسي أو نسبة الإناث في وقت ترسب البيض. وفيات الإنمائية التفاضلية بين الأحداث من الذكور والإناث على الرغم من أن نسبة الجنس عند ظهور الكبار قد توفر أدلة على تخصيص الجنس، قد يشيع تحرف نسبة الجنس الكبار إلى حد كبير. في بعض الأنواع من غشائيات الأجنحة، ترتيب الحشرات يحتوي على النمل والنحل والزنابير، وقد تحدد نسبة الجنس الأولية مع فحوصات الخلوية الوراثية، تلطيخ الأجنة لعرض الحمض النووي الوراثي. لأن هيمينوبتيرانس هابلوديبلويد، بيض ذكور وليدة فرداني ويحتوي على برونوكليوس الإناث فقط (ن)، بينما البيض أنثى وليدة مثنوية وتحتوي على برونوكلي من الذكور والإناث (2n). على الرغم من أن الييروديداي، الأسرة ساب-تغذية صحيح الأخطاء (Hemiptera) المعروفة باسم ويتيفليس، أيضا هابلوديبلويد، هناك لم يكن مقايسة الراسخة العثور على نسبة الجنس الأساسي في هذه الحشرات. هذا ربما يثير الدهشة نظراً لكثافة دراسة الآفات الخطيرة عالمية قليلة في هذه الأسرة وأهمية النسب بين الجنسين في التفاعلات التنافسية ويتيفليس4،،من56،7 ،،من89،10 وديناميات السكان عموما. في الحشرات هابلوديبلويد جداً، يقيد النسب بين الجنسين بنظم تحديد الجنس، مما يتيح إمكانية الإخصاب انتقائية ومجا النسب بين الجنسين التي تختلف مع البيئة2. هنا نقدم تقنية لتحديد نسبة الجنس الأولية من الأنواع المعقدة المعروفة كالذبابة البطاطا، ويتيفليس حيث. هذا اسم واحد من الأنواع يشمل الأنواع في العالم أكثر من 2811ويتضمن بعض من ال12،الآفات الدخيلة العالمية13الأكثر ضررا. تطبيق هذه التقنية على تحديد أنماط تخصيص الجنس حيث (ب) وأخرى الييروديداي سيتيح إجراء تحقيق أكثر صرامة من المتغيرات، بما في ذلك درجة حرارة النبات المضيف، والبكتيريا اندوسيمبيوتيك أو النباتية/الذبابة مسببات الأمراض، التي قد تؤثر على النسب بين الجنسين الابتدائي الذبابة والديناميات السكانية الذبابة.
ونحن غير مدركين لأي تقنيات تلوين البيض مماثلة حيث. البروتوكول مناسب بالمقارنة مع المصبوغة الأساليب المستخدمة ل بيض الحشرات الأخرى14 كما يحذف خطوة تثبيت بين عشية وضحاها، وعليه، يمكن أن تنجز في غضون ح 3. وكمثال على تطبيق، وبكتيريا اندوسيمبيوتيك، الريكتسية sp. nr. بيلي، يرتبط بالتحيز الإناث في خطوطنا المختبر حيث باء- 1 ثانوية الشرق الأوسط وآسيا (MEAM1)15،16. في MEAM1 حيث باء- مختبر سطر واحد ("MAC1،" التي تم جمعها من مركز الزراعية ماريكوبا)، نقوم باختبار ما إذا كان الريكتسية-تسميد المصابة (R+) الإناث البيض أكثر من الإناث (R–) غير مصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: التأكد من أن جميع الأعمال تتم في درجة حرارة الغرفة في منطقة جيدة التهوية، أو تحت غطاء دخان. يتم تعريف كافة 'قطرات' في هذا البروتوكول ك 5 – 20 ميليلتر، اعتماداً على تفضيل للمشغل.
1-الإعداد الأولى
- السماح للنساء ويتيفليس أوفيبوسيت على أوراق نظيفة. وتشمل الأمثلة للساحات أوفيبوسيتيون أقفاص القصاصة أو يترك قطع لتناسب في أجار في طبق بتري. جعل حفرة تغطيها في قفص القصاصة أو غطاء صحن بيتري إدراج وإزالة الكبار. وبدلاً من ذلك، وضع سفينة التي تم جمعها من الكبار بسرعة على الجليد، وثم إيداعها على الورقة. يحدد الوقت الذي بين أوفيبوسيشن والتثبيت البيض أن لا يزيد عن 60 دقيقة، لضمان مراقبة انتقال الحيوانات المنوية إلى برونوكليوس الأب في البيض.
ملاحظة: يمكن تربيتها البيض لا إزالتها من الورقة إلى سن البلوغ لتسجيل النسب بين الجنسين البالغين. - قبل أو أثناء أوفيبوسيشن الذبابة، إعداد شريحة مجهر بتنظيفه بالصابون والماء، تجفيف أنها جيدا ومن ثم تمتد قطعة من الفيلم البارافين نهاية واحدة، مع التأكد من عدم كسر سطح الفيلم البارافين (الشكل 1).
ملاحظة: الفيلم البارافين مسعور والسماح للسوائل بشكل قطرات شبه معتمة، والبيض وأن ينظر إليها بسهولة أكبر.
2-ديتشوريونيشن
- مع زجاج باستور "الماصة؛"، إضافة قطرات من التبييض الحل (0.83% هيبوكلوريت الصوديوم) للفيلم البارافين.
ملاحظة: أنه من الأسهل لتتبع البيض إلا إذا كان البيض 2-3 في كل قطره. وبدلاً من ذلك، لإدارة عدد كبير من بيض، جمع البيض في قطرات 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
تنبيه: التبييض التآكل؛ ارتداء القفازات عند التعامل مع التبييض ولا يستنشق. - إزالة ويتيفليس الكبار من الورقة.
- ضع ورقة تحت مجهر لرؤية البيض بوضوح وجمع البيض منفردة وعناية بتحقيق رقيقة. لإجراء تحقيق، أدخل pin نادل دقيقة في 45°، أو بزاوية عمل مريحة في تلميح ماصة المذابة (الشكل 2).
- نقل البيض للتبييض أو برنامج تلفزيوني 1 x. في حالة استخدام برنامج تلفزيوني x 1، قم بإزالة x 1 برنامج تلفزيوني مع كوب باستور "الماصة؛" مرة واحدة كل ما يتم جمع البيض، وثم إضافة التبييض للبيض.
ملاحظة: عند جمع البيض، ببطء رفع البيض من قاعدته حتى تتم إزالة في عنيقة من الورقة. عنيقة لزجة، والبيض عادة سوف تتمسك بنصيحة التحقيق حتى أنه هو انخفض إلى المبيض.
ملاحظة: ينصح باستخدام الزجاج منفصلة باستور الماصات لجميع المواد الكاشفة، ويمكن تعديله الماصات مع الحرارة لجعل النصائح أضيق والحد من خطر يسفط بيض الذبابة بطريق الخطأ. لمنع التلوث والمخلفات، تنظيف الممصات بالمياه بعد كل استعمال. - انتظر لمدة 10 دقائق. إذا لم يكن هناك مصلحة في امبريوجينيسيس في البيض أقدم من ح 1، ترك البيض في التبييض لمدة تصل إلى 15 دقيقة.
ملاحظة: للبيض أن ما يصل إلى 1 س القديمة، 10 دقيقة كافية.
3-التثبيت
ملاحظة: يتم اتخاذ هذه الخطوات من بروتوكول هيمينوبتيران17.
- إزالة المبيض (التي تحتوي على أجزاء المشيمة) مع كوب ماصة باستور وتجاهل ذلك. أضف قطرات حمض الخليك الجليدية مع كوب باستور "الماصة؛" وانتظر 3 دقائق.
تنبيه: المضي قدما في هذه الخطوة تحت غطاء دخان. حمض الخليك الجليدية التآكل؛ ارتداء القفازين عند التعامل مع حمض الخليك الجليدية ولا يستنشق، لا سيما في تركيبة مع التبييض المتبقية. - إزالة حمض الخليك الجليدية مع كوب ماصة باستور وإضافة قطرات حل كلارك (3:1 إيثانول المطلقة: حمض الخليك الجليدية) مع كوب باستور "الماصة؛". الانتظار حتى يتبخر معظم الحل (أو 10 دقائق كحد أقصى).
- إضافة قطرات الإيثانول 70% للبيض مع الزجاج ماصة باستور والانتظار حتى يتبخر معظم الإيثانول (أو ماكس 10 دقيقة).
4-التلوين
- إزالة أي الإيثانول المتبقية مع كوب ماصة باستور وإضافة قطرات من س 1 برنامج تلفزيوني للبيض مع كوب ماصة باستور للحصول على درجة الحموضة قريبة من 7.0. تعيين الشريحة المجهر في غرفة رطوبة لمنع الجفاف، على سبيل المثال، في مربع تلميح ماصة فارغة مع منشفة ورقية مبللة داخل (الشكل 3). انتظر 30 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: هذا هو أفضل نقطة إذا كانت هناك حاجة إلى وقفه، ما دام دائرة الرطوبة يمكن أن يمنع جفاف. - إزالة برنامج تلفزيوني 1 x مع كوب ماصة باستور، وإضافة قطرات من 0.1 ميكروغرام/مل DAPI، وصمة عار فلورسنت الحمض النووي، ومع كوب باستور "الماصة؛". تعيين الشريحة المجهر في غرفة مظلمة رطوبة والانتظار 15 دقيقة على الأقل.
تنبيه: DAPI مصدر إزعاج، وحتى التعامل معها مع القفازات.
5-الغسيل
- إزالة DAPI مع كوب ماصة باستور.
- إضافة قطرات 1 x TBST (5 x الحل مصنوعة من 43.8 غرام من كلوريد الصوديوم و 5 مل من بوليسوربيت 20، 30 جرام تريس وز 1.0 من نان3 [الرقم الهيدروجيني 7.5]، وأحضر إلى 1 لتر مياه الصف PCR) للبيض مع كوب باستور "الماصة؛". الانتظار مدة 5 دقائق قبل إزالة 1 x TBST مع كوب ماصة باستور. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
6-تركيب
- بعد الغسيل النهائي، بعناية "الماصة؛" كل البيض من البارافين الفيلم على جزء نظيف من الشريحة المجهر. إزالة الزائدة 1 x TBST؛ ثم قم بإضافة 20 ميليلتر من تركيب وسائط (والغليسيرول 80% و 20% 1 x TBST مع 2% n-بروبيل-يبيغاللوكاتيشين) ووضع شريحة نظيفة غطاء فوق البيض.
- للتخزين على المدى الطويل، ختم غطاء الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة، ثم، أما تخزين الشريحة في الظلام عند 2 درجة مئوية أو مشاهدته فورا تحت مجهر فلوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لاختبار ما إذا كان الريكتسية يؤثر معدل الإخصاب حيث MEAM1 الإناث، نحن تربى الريكتسية-إصابة (R+) أو وقاية (R–) حيث (ب) على نباتات اللوبيا (Vigna unguiculata) في فصل أقفاص في 27 درجة مئوية ورطوبة نسبية 70% من ضوء/8 ح 16 ح كبيرة مظلمة. R+ ويتيفليس الطور الرابع ص– بعناية إزالة من أوراق ومعزولة في 200 ميليلتر قطاع أنابيب. عندما ظهرت الكبار، أنها جمعت في مجموعات من الإناث 50% ونقل إلى أوراق نظيفة في أطباق بتري (n = ~50-100/leaf) لمدة 4 أيام من التزاوج. مجموعة من حوالي 20 من الإناث والذكور عدة ثم نقلوا إلى قرص أوراق نظيفة (واحد ل R– الكبار، واحد للبالغين R+ ) في أطباق بتري 35 ملم يستريح في أجار 1%. قطع الغطاء طبق بيتري وشبكة النسيج الجميلة المستخدمة للاحتواء كما منعت التكثيف الزائد. بعد حوالي 45 دقيقة، وأزيلت جميع البالغين وبعض البيض تم حصادها لتحديد معدل الإخصاب، وكانت تربى البيض التي تم جمعها لا لسن البلوغ لحساب نسبة الجنس الكبار. فوج واحد ليوم واحد، لكل من البحث والتطوير+ وار– ويتيفليس، عرف ككتلة. وكانت هناك سبعة كتل لحساب معدل الإخصاب أو نسبة الجنس الأولية، في حين كانت هناك ست كتل لحساب نسبة الجنس الكبار، كما كانت هناك لا يكفي البيض بقايا من كتلة واحدة الخلف إلى سن البلوغ. استخدم نموذج خطي معمم في الحزمة الإحصائية R لتحديد ما إذا كانت معدلات التسميد أو النسب بين الجنسين البالغين تأثرت كثيرا الريكتسية العدوى و/أو كتلة. كانت المتغيرات واستجابة النسبة إخصاب البيض/جميع البيض، أو نسبة الإناث البالغات/جميع البالغين، على التوالي، في حين كانت المتغيرات التفسيرية كتلة وحالة العدوى الريكتسية .
ديتشوريونيشن البيض تليها DAPI تلطيخ النووية يسمح التعيين لا لبس فيه للاخصاب (وجنس الجنين) عندما لاحظ مع مجهر فلوري (الشكل 4). لهذه التجربة، البيض 90 التي زرعتها R–الإناث MEAM1باء-حيث وقد سجل 82 بيض MEAM1باء-حيث R+الإناث. أما بالنسبة للبيض تربيتها إلى سن البلوغ، كان سجل 60 R– و 95 ص+ الكبار. بينما تحيز الإناث في نسب الجنسين البالغين وقد تبين استمرار في سابق الدراسات15،،من1819، في الدراسة الحالية، والكبار R+ النسب بين الجنسين (الإناث 69%، متوسط) كانت متحيزة للإناث مقارنة بالبحث والتطوير الإناث – (50% الإناث، متوسط)، لكن نسب الجنسين في المعالجتين لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا (χ2 = 1.02، مدافع = 1، ف = 0.31؛ الشكل 5). النسب بين الجنسين R– الابتدائي (60% يخصب البيض، الوسيط) كانت متحيزة للإناث مقارنة بالنسب بين الجنسين R+ (44% يخصب البيض، الوسيط) ولكن أيضا لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا (χ2 = 0.51، مدافع = 1، ف = 0.47)، تقديم لا دليل لزيادة معدلات التسميد R+ الإناث (الشكل 5). كتلة ليس لها أيضا تأثير كبير على المرحلة الابتدائية (χ2 = 0.29، مدافع = 1، ف = 0.59) أو الكبار (χ2 = 1.20، مدافع = 1، ف = 0.27) النسبة بين الجنسين.
رقم 1: صورة لشريحة مجهر مع الفيلم البارافين وقطرات من التبييض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مثال عن التحقيق، الطراز مع الحرارة، من طرف ماصة ودبوس ناديلن دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مثال على دائرة الرطوبة، الطراز من شكل مربع تلميح ماصة فارغة ومنشفة ورقية مبللة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مجهر فلوري الصور من البيض حيث . () MEAM1 (ب) حيث المخصبة، وليدة البيض الإناث. (ب) أونفيرتيليزيد، وليدة الذكور البيض. كانت ثابتة في أقل من 1 ساعة بعد أوفيبوسيشن البيض والملون مع DAPI. هو الاستشعاع القاعدة لكل بيضة بسبب الحمض النووي البكتيري (بورترا، هاميلتونيلا، وربما الريكتسية) في الخلية السلف باكتيريومي، التي يتم تضمينها في20،بيضة وضعت21. في كل بيضة، برونوكليوس الإناث بالقرب من المركز للبيض، وفي الإناث البيض فقط، الحيوانات المنوية تظهر كخط مشرق قرب قمة البيضة قرب ما هو يفترض أن ميكروبيلي أوتوفلوريسسينج. لقطات مأخوذة من Z-مكدس الذاكرة المؤقتة التي تم إنشاؤها بالفيديو، والصور التي تنتجها ليزر المسح الضوئي المجهر المقلوب [كنفوكل]. وقدرت أشرطة مقياس من صور المجهر السابقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: الابتدائي والكبار الجنس نسب الريكتسية-المصابة أو وقاية حيث. قطع مربع والخط الطولي لنسبة الجنس الأولية (النسبة المئوية للبيض المخصب، أو النسبة المئوية للإناث zygotes) باللون الأسود بالمقارنة مع نسبة الجنس الكبار (النسبة المئوية للإناث البالغات) في الرمادي، الريكتسية-إصابة (R+) ووقاية (R --) حيث (ب) MEAM1، "MAC1" خط الوراثية. قطع الخط الطولي والمربع إظهار الوسيط كخط المنتصف والوسط كعلامة زائد quartiles العلوي والسفلي كالخطوط التي تجعل نهايات المربع، ويمثل النطاق في الخطوط الخارجية التي تمتد من المربع. للبحث والتطوير– البيض وسجل: n = 90؛ للبحث والتطوير+ البيض وسجل: n = 82. للكبار R– عد: n = 60؛ للكبار R+ عد: n = 95. في تحليل السوقي نسبة الجنس الأولية (نسبة البويضات المخصبة) يؤديها في الحزمة الإحصائية R، تم العثور على لا آثار كبيرة لكتلة (n = 7، χ2 = 0.29، مدافع = 1، ف = 0.59) أو الريكتسية العدوى (χ2 = 0.51، مدافع = 1، ف = 0.47). النسب بين الجنسين البالغين، كما تتأثر بكتلة (n = 6) وحالة العدوى الريكتسية ، حللت المثل. هنا كذلك، عثر لا آثار كبيرة لكتلة (χ2 = 1.20، مدافع = 1، ف = 0.27) أو الإصابة بعدوى الريكتسية (χ2 = 1.02، مدافع = 1، ف = 0.31). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول هو الأول من التقاط معدل الإخصاب أو نسبة الجنس الأولية من حيث (ب). التحدي المتمثل في هذا البروتوكول أنه يتطلب الباحثين لمعرفة كيفية التعامل مع البيض الذبابة بسرعة وضمان أن لا أكثر من ح 1 انقضى منذ كانت أوفيبوسيتيد البيض حتى أنها ثابتة. أثناء تجارب أولية، البيض التي تم إصلاحها في ح 3 أو أكثر بوستوفيبوسيشن كانت قديمة جداً لمراقبة الإخصاب، كما قد حدث سينجامي وانقسامات فتيلية جارية. بين 1 إلى 3 ح، أخذت برونوكلي على شكل مستدير. بينما يشير إلى الوجود المبكر هما نواة البويضة مخصبة، قليلاً في وقت لاحق، بدل الأنوية اثنين تحضيرا سينجاميكان تظهر لتكون نواة واحدة، وبعد ذلك مرة أخرى، تم العثور على اثنين من المنتجات للشعبة الأولى الانقسامية في البيض الذكور والإناث على حد سواء. ولذلك، التمييز بين الجنسين ليست واضحة في هذه النقاط وقت لاحق، وإننا ننصح الحد الفاصل الزمني من أوفيبوسيشن للتثبيت إلى ح 1 كتدبير محافظ. كما أنها تمثل تحديا لمعرفة كيفية تكون لطيف مع البيض مع كل عملية نقل للسائل بحيث لا يستنشق بطريق الخطأ إلى الماصة. في وقت عرض البيض تحت مجهر فلوري، قد كسرت عدد قليل من البيض خلال البروتوكول، حتى تلك البيض لا يمكن مسحه وتحسب برونوكلي وصفار البيض قد فروا. وبخلاف ذلك، حالما يصبح المشغل مريحة مع هذه الخطوات، يمكن إكمال البروتوكول مريح ضمن ح 3، كما أنها لا تتطلب خطوة تثبيت بين عشية وضحاها. كما أنها مرنة في ذلك أنه يمكن تعديل لوصمة عار البيض المسنين، لهؤلاء الباحثين المهتمين في القبض على التنمية.
ويشمل تطبيق هذا البروتوكول البحوث بشأن تخصيص الجنس. على الرغم من أن العشرات من دراسات البيولوجيا الذبابة سجلت نسب الجنس الكبار في بيئات مختلفة، نسب الجنسين البالغين إرباك تخصيص الجنس الأم مع وفيات التنموية الخاصة بالجنس من الحوريات وتجعل من المستحيل لتحديد سبب أي نمط النسبة بين الجنسين. الأسلوب الخلوية الوراثية الموصوفة هنا يتيح إمكانية الذبابة فهم أنماط تخصيص الجنس أعم. بينما سكان المشتتة كبير حيث (ب) وغيرها من الآفات مثل الذبابة الدفيئة، فابوراريوروم ترياليوروديس، قد يمكن التنبؤ بأن يسفر عن نسب الجنسين 1:1، غالباً ما أظهرت في المختبر إعدادات22، 23، نتوقع أيضا أن تدخل الإنجابية، اندوسيمبيونتس، ويحتمل أن تكون نوعية النبات المضيف يمكن أن تؤثر الأولية النسب بين الجنسين. أن هذه العوامل نفسها يمكن أن تؤثر أيضا في أنماط الوفيات حسب الجنس خلال التنمية، وانحراف نسبة الجنس بانتظام التقديرات، يؤكد الحاجة إلى تدبير مباشر لنسبة الجنس الأولية.
بينما الإناث التحيز المرتبطة بالعدوى الريكتسية قد وجد دائماً في السطر الوراثية "MAC1"15،،من1819، نسب الجنس الكبار لم تكن الإناث إلى حد كبير متحيزة في الدراسة الحالية. جنس الابتدائي نسب لاحظ مع تقنية سيتوجينيتيكس لم تكن كبيرة منحازة أما. ونحن الجمهرة النسب بين الجنسين الابتدائي والكبار من الإناث حيث (ب) في يوم واحد فقط، في بداية نوبة أوفيبوسيشن، عندما كانت الإناث من 4 إلى 5 أيام، حيث درس النسب بين الجنسين قد لا تمثيل النسب بين الجنسين التي لاحظنا على مدى فترات أطول. على الرغم من ذلك، الأسلوب جعل من الممكن لتحديد معدل الإخصاب أو نسبة الجنس الأولية، وفي هذه الحالة، قد أظهرت وجود تناظر بين نسب الجنسين الابتدائي والكبار.
كما قد يكون من المفيد في الحالات التي قد ترغب الباحثون في تحديد نوع العزل الإنجابية بين السكان الذبابة تحديد الإخصاب. بينما كان مدعاة لبعض الجدل12،،من2425، الآن من المقبول عموما أن الاسم (ب) حيث يشير إلى عشرات الأنواع خفي، مع الأدلة التي يقدمها كل الاختلاف الجيني و اجتياز الاختبارات التي فيها عدد قليل من الإناث تنتج12،25. في هذه الدراسات، وأنه سيكون من المهم معرفة أين يحدث معزل. يتم نقل الحيوانات المنوية، وهل هيتيروسبيسيفيك الحيوانات المنوية تخصب البيض، أو من هم ماتينجس محاولة غير ناجحة؟ فيما يتعلق بتحديد نسبة الجنس الأولية، هذا الأسلوب يمكن تحديد ما إذا كانت نسبة الجنس الأساسي يتأثر اندوسيمبيونتس، والعناصر الوراثية الأنانية، أو واحدة من العديد من العوامل الأخرى، بما في ذلك كونسبيسيفيكس، والمنافسين، والحيوانات المفترسة، الطفيليات مسببات الأمراض، والنبات المضيف، أو آثار اللاأحيائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث بمنحه جبهة الخلاص الوطني (ديب-1020460) إلى M.S.H. ومنحة وزارة الزراعة أفري (2010-03752) إلى M.S.H. يشكر المؤلفون زيهر برينان لتلطيخ بيض الذبابة بقدر كبير من المهارة وزين. يشكر المؤلفون مايك ريلي للسماح باستخدام مجهر فلوري له للتصوير. يشكر المؤلفون سوزان كيلي وماركو جيبيولا للصور البيض. يشكر المؤلفون كيلي سوزان وجيمي كونواي للعون في اللحظات الحاسمة من خلال التجارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
