Summary
Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.
Abstract
Een paar soorten sap-zuigende wittevlieg zijn enkele van de meest schadelijke terrestrische plagen wereldwijd vanwege de gewas-schade die ze toebrengen en plantenvirussen die ze vector. Ondanks talrijke studies van de biologie van deze soorten in verschillende omgevingen, een belangrijke levensgeschiedenis parameter, offspring sex ratio's, weinig aandacht heeft gekregen, maar is belangrijk voor het voorspellen van de populatiedynamiek. De primaire verhouding van de sex (sex ratio op oviposition) van Bemisia tabaci is nooit gemeld maar kan worden gevonden door de bepaling van het tarief van de bevruchting ei van dit insect van de haplodiploid. De techniek gaat de dechorionation van de eieren met bleekmiddel, een reeks fixatie stappen en de toepassing van de algemene DNA fluorescerende vlek, DAPI (4 ': 6-diamidino-2-phenylindole, een DNA-bindende fluorescente kleurstof), te binden aan mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Hier presenteren we de techniek, en een voorbeeld van de toepassing ervan, om te testen of een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, beïnvloed de primaire sex-ratio van B. tabaci. Deze methode kan helpen bij bevolkingsonderzoeken van wittevlieg, of vast te stellen of geslacht toewijzing bestaat met bepaalde milieu prikkels.
Introduction
De studie van geslacht verdeling, of de relatieve investering in mannelijke en vrouwelijke nakomelingen, is een hoeksteen van gedragsecologie1,2,3. Naast de macht voor het testen van adaptieve modellen van gedrag, kan te weten de seks toewijzing strategie van een organisme modellen voor de populatiedynamica verbeteren. In vele soorten, wordt seks toewijzing gecontroleerd door moeders. Ter vaststelling van geslacht toewijzing, is het belangrijk om te bepalen van de primaire sex-ratio of het aandeel van vrouwen op het moment van de ei-afzetting. Hoewel de sex ratio op volwassen opkomst aanknopingspunten seks toewijzing bieden kan, kan differentiële developmental sterfte tussen mannelijke en vrouwelijke exemplaren het volwassen sex-ratio aanzienlijk en algemeen scheeftrekken. In sommige soorten Hymenoptera (Vliesvleugeligen), de volgorde van insecten, mieren, bijen en wespen, met is de primaire sex-ratio vastgesteld met cytogenetische tests, kleuring van de embryo's om weer te geven van de genetische DNA. Omdat hymenopterans haplodiploid, een beginnende mannelijke ei is haploïde en bevat alleen de vrouwelijke pronucleus (n), terwijl beginnende vrouwelijke eieren diploïde zijn en zowel mannelijke als vrouwelijke pronuclei (2n bevatten). Hoewel Aleyrodidae, de sap-voeding-familie van true bugs (Hemiptera) bekend als wittevlieg, ook haplodiploid, is er geen een gevestigde assay te vinden van de primaire sex-ratio in deze insecten. Dit is misschien verwonderlijk gezien de intensiteit van de studie van de paar kosmopolitische ernstige plagen uit deze familie en het belang van de sex ratio's in concurrerende interacties van wittevlieg4,5,6,7 ,8,9,10 en in de populatiedynamiek in het algemeen. In haplodiploid insecten ook zijn sex ratio's onbeperkt door geslacht bepaling systemen, waardoor de mogelijkheid van selectieve bevruchting en onstabiele sex-ratio's die met de milieu-2 variëren. Hier presenteren we een techniek om te bepalen van de primaire sex-ratio van het complex van de soorten van wittevlieg gezamenlijk bekend als de sweetpotato wittevlieg, B. tabaci. Deze naam voor één soort omvat meer dan 28 soorten wereldwijd11en omvat enkele van de meest schadelijke global invasieve ongedierte12,13. De toepassing van deze techniek om seks patronen van geheugentoewijzingen die in B. tabaci en andere Aleyrodidae toestaat een strenger onderzoek van variabelen, met inbegrip van temperatuur, waardplant, endosymbiotic bacteriën of plant/wittevlieg ziekteverwekkers, die invloed op de wittevlieg primaire sex ratio's en de populatiedynamiek van de wittevlieg hebben kunnen.
Wij zijn niet op de hoogte van eventuele vergelijkbare ei-kleuring technieken voor B. tabaci. Het protocol is handig in vergelijking met verkleurende methoden die worden gebruikt voor andere insecten eieren14 omdat het nalaat een overnachting fixatie stap en, dus, kan worden voltooid binnen de 3 uur. Als een voorbeeld van een toepassing, een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, wordt geassocieerd met vrouwelijke bias in ons laboratorium lijnen B. tabaci Midden-Oosten en Azië kleine 1 (MEAM1)15,16. In één B. tabaci MEAM1 laboratorium regel ("MAC1," verzameld vanuit het midden van de landbouw Maricopa), testen we of Rickettsia-besmette (R+) vrouwen bevruchten meer eieren dan niet-geïnfecteerde (R-) vrouwtjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Zorg ervoor dat alle werkzaamheden wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Alle 'druppels' in dit protocol worden gedefinieerd als 5 – 20 µL, afhankelijk van de voorkeur van de exploitant.
1. eerste Setup
- Toestaan dat vrouwelijke wittevlieg te oviposit op schone bladeren. Voorbeelden voor oviposition arenas zijn clip kooien of bladeren gesneden te passen op agar in een petrischaal. Maak een coverable gat in de kooi van de clip of de petrischaal cover invoegen en verwijderen van de volwassenen. Alternatief, zet snel een vaartuig van de verzamelde volwassenen op ijs en dan storten ze op het blad. Beperk de tijd tussen oviposition en eieren fixatie aan niet meer dan 60 min, zodat de waarneming van de overgang van de zaadcellen in de vaderlijke pronucleus in eieren.
Opmerking: Eieren niet verwijderd uit het blad kunnen naar volwassenheid opnemen van volwassen sex-ratio's worden gehouden. - Vóór of tijdens de wittevlieg oviposition, bereid een microscoopglaasje door het schoonmaken met water en zeep, drogen goed, en vervolgens het uitrekken van een stuk van paraffine film over één uiteinde, ervoor te zorgen dat het oppervlak van de film paraffine niet breekt (Figuur 1).
Opmerking: De paraffine film is hydrofoob en semi-dekkend, zodat vloeistoffen aan formulier druppels en eieren te bezien gemakkelijker.
2. Dechorionation
- Pipetteer met een glas Pasteur, bleekwater oplossing (0,83% natriumhypochloriet) druppels toevoegen aan de paraffine-film.
Opmerking: Het is makkelijker om bij te houden eieren als slechts 2-3 eieren verpakt in elke druppel zijn. Als alternatief voor het beheren van een groot ei nummer, verzamelen de eieren in druppels 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Let op: Bleach is bijtend; Draag handschoenen bij het verwerken van bleekmiddel en niet inademen. - De volwassen wittevlieg uit het blad verwijderen.
- Plaats het blad onder een microscoop te zien van de eieren en het verzamelen van de eieren afzonderlijk en zorgvuldig met een dunne sonde. Aanbrengen van een sonde, invoegen van een minuten nadel pin op 45°, of in een comfortabele hoek van het werken in een gesmolten pipette uiteinde (Figuur 2).
- De eieren overbrengen met bleekmiddel of 1 x PBS. Als met behulp van 1 x PBS, verwijdert u de 1 x PBS met een glas Pasteur Pipetteer zodra de eieren zijn verzameld en, dan, Voeg bleekwater op de eieren.
Opmerking: Bij het verzamelen van eieren, lift langzaam het ei vanuit zijn basis tot de pedicel wordt verwijderd uit het blad. De pedicel is kleverig, en het ei zal vaak vasthouden aan de sondepunt totdat het is ondergedompeld in het bleekmiddel.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om aparte glas Pasteur pipettes gebruiken voor alle reagentia en de pipetten kunnen worden gewijzigd met warmte aan de tips smaller maken en het risico van per ongeluk zuigen wittevlieg eieren. Om te voorkomen dat residuen en besmetting, reinig de pipetten met gedeïoniseerd water na elk gebruik. - Wacht 10 minuten. Als er belangstelling voor embryogenese in eieren die ouder zijn dan 1 h, laat de eieren in bleekmiddel gedurende maximaal 15 minuten.
Opmerking: Voor eieren die maximaal 1 uur oud zijn, is 10 minuten voldoende.
3. fixatie
Opmerking: Deze stappen zijn ontleend aan een Hymenoptere protocol17.
- Verwijder het bleekmiddel (met het chorion fragmenten) met een glazen pipet van Pasteur en verwerpen. Voeg druppels ijsazijn met een glas Pasteur Pipetteer en 3 min wachten.
Let op: Ga verder met deze stap in een zuurkast. Ijsazijn is corrosief; Draag handschoenen wanneer omgaan met ijsazijn en niet inademen, vooral in combinatie met het residuele bleekmiddel. - Verwijder de ijsazijn met een glazen pipet van Pasteur en voeg druppels van Clarke's oplossing (3:1 van absolute ethanol: ijsazijn) met een glas Pasteur Pipetteer. Wacht totdat het grootste deel van de oplossing is verdampt (of 10 min max).
- Voeg druppels van 70% ethanol op de eieren met een glazen pipet van Pasteur en wacht totdat het grootste deel van de ethanol is verdampt (of 10 min-max).
4. vlekken
- Verwijder eventuele resterende ethanol met een glazen pipet van Pasteur en voeg druppels 1 x PBS op de eieren met een glazen pipet van Pasteur om de pH dichtbij 7.0. Stel de microscoopglaasje in een zaal van de luchtvochtigheid ter voorkoming van uitdroging, bijvoorbeeld in een lege pipette uiteinde doos met een natte papieren handdoek binnen (Figuur 3). Wacht minstens 30 min.
Opmerking: Dit is het beste punt als een pauze nodig is, zolang de kamer vochtigheid kan uitdroging voorkomen. - Verwijderen van de PBS 1 x met een glazen pipet van Pasteur, en voeg druppels 0.1 μg/mL DAPI, een fluorescerende vlek van DNA, met een glas Pasteur Pipetteer. Stel het microscoopglaasje in een donkere vochtigheid kamer en wacht ten minste 15 minuten.
Let op: DAPI is een irriterend, dus omgaan met handschoenen.
5. wassen
- Verwijder de DAPI met een glazen pipet van Pasteur.
- Voeg druppels 1 x TBST (5 x oplossing gemaakt van 30 g van Tris, 43.8 g NaCl, Polysorbaat 20 5 mL en 1,0 g van NaN3 [pH 7.5], en bracht aan 1 L met PCR rang water) op de eieren met een glas Pasteur Pipetteer. 5 min wachten met het verwijderen van de 1 x TBST met een glazen pipet van Pasteur. Herhaal deze stap 2 keer.
6. montage
- Na de definitieve wash, Pipetteer zorgvuldig alle eieren uit de paraffine film op een schoon deel van het microscoopglaasje. Verwijderen van de overtollige 1 x TBST; dan, Voeg 20 µL media te monteren (80% glycerol en 20% 1 x TBST met 2% n-propyl-gallate) en plaats een schone cover dia op de top van de eieren.
- Voor langdurige opslag, afdichting van de deksel dia met duidelijke nagellak en vervolgens opslaan van de dia in het donker bij de 2 ° C of onmiddellijk onder een fluorescente microscoop bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te testen of Rickettsia is van invloed op het tarief van de bevruchting van B. tabaci MEAM1 vrouwtjes, die wij gefokt Rickettsia-besmet (R+) of niet-geïnfecteerde (R-) B. tabaci op cowpea planten (Vigna unguiculata) in aparte kooien op een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode, 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid. R+ werden R- vierde instar wittevlieg zorgvuldig verwijderd uit bladeren en geïsoleerd in 200 µL strip buizen. Wanneer volwassenen ontstaan, ze werden verzameld in groepen van 50% vrouwen en overgedragen aan schone bladeren in petrischalen (n = ~50-100/leaf) voor 4 dagen voor de paring. Groepen van ongeveer 20 vrouwtjes en enkele mannetjes werden vervolgens overgedragen aan een schone blad schijf (één voor R- volwassenen, één voor R+ volwassenen) in 35 mm petrischalen rustend op 1% agar. De petrischaal deksel waren uitgesneden en de fijne stof gaas gebruikt voor insluiting tevens verhinderd bovenmatige condensatie. Na ongeveer 45 min, alle volwassenen werden verwijderd, enkele van de eieren zijn geoogst om te bepalen van het tarief van de bevruchting en de eieren die niet werden verzameld zijn gefokt naar volwassenheid voor het berekenen van de erotische sex-ratio. Een cohort voor één dag, voor zowel o+ en R- wittevlieg, werd gedefinieerd als een blok. Er waren zeven blokken voor het berekenen van het tarief van de bevruchting of primaire sex ratio, terwijl er zes blokken voor de berekening van de erotische sex-ratio, waren als er niet genoeg overgebleven eieren uit één blok naar de achterzijde naar volwassenheid. Een veralgemeende lineaire model was het statistisch pakket R gebruikt om te bepalen of de bevruchting tarieven of erotische sex-ratio's werden aanzienlijk beïnvloed door Rickettsia -infectie en/of blok. De respons-variabelen waren het percentage bevruchte eieren/all eieren, of het aandeel van vrouwelijke volwassenen/alle volwassenen, respectievelijk, terwijl verklarende variabelen waren het blok en de status van Rickettsia -infectie.
Ei dechorionation gevolgd door de DAPI nucleaire kleuring toegestaan de duidelijke toewijzing van bevruchting (en embryo seks) wanneer waargenomen met een fluorescente microscoop (Figuur 4). Voor dit experiment, 90 eieren gelegd door R-B. tabaci MEAM1 vrouwtjes en 82 eieren door R+B. tabaci MEAM1 vrouwtjes werden gescoord. Wat betreft eieren gefokt naar volwassenheid, werden 60 R- en 95 R+ volwassenen gescoord. Terwijl een vrouwelijke bias in erotische sex-ratio's is gebleken consequent in eerdere studies15,18,19, in de huidige studie, volwassen R+ sex ratio's (69% vrouwen, mediaan) waren vrouwelijke-vooringenomen ten opzichte van R - vrouwtjes (50% vrouwen, mediaan), maar de sex ratio's in de twee behandelingen waren niet significant verschillend (χ2 = 1.02, df = 1, p = 0.31; Figuur 5). De primaire R- sex ratio's (60% bevruchte eieren, mediaan) waren vrouwelijke-vooringenomen ten opzichte van R+ sex ratio's (44% bevruchte eieren, mediaan) maar ook niet beduidend verschillend waren (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0,47), verstrekken van neen bewijs voor grotere bevruchting tarieven door R+ vrouwtjes (Figuur 5). Blok ook niet had een significant effect op de primaire (χ2 = 0,29, df = 1, p = 0.59) of volwassen (χ2 = 1,20, df = 1, p = 0.27) sex ratio.
Figuur 1: de foto's voor een microscoopglaasje met paraffine film en druppels bleekmiddel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: een voorbeeld van een sonde, ouderwets met warmte, van een pipette uiteinde en een pin minuten nadeln. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: een voorbeeld van een kamer vochtigheid, gevormd uit een lege pipette uiteinde box en een natte papieren handdoek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Fluorescente microscoop beelden van B. tabaci eieren. (een) B. tabaci MEAM1 bevruchte, beginnende vrouwelijke ei. (b) Unfertilized, beginnende mannelijke ei. De eieren werden vastgesteld op minder dan 1 uur na oviposition en gekleurd met DAPI. De basis van elk ei is oplichtende als gevolg van bacteriële DNA (Portiera, Hamiltonellaen eventueel Rickettsia) in de bacteriome progenitor cel, die is opgenomen in de vastgestelde ei20,21. In elk ei, de vrouwelijke pronucleus is in de buurt van het centrum van het ei, en in de vrouwelijke eicel alleen, het sperma is zichtbaar als een lichte streep in de buurt van de top van het ei in de buurt van wat vermoedelijk een autofluorescing micropyle is. De beelden zijn screenshots genomen uit een Z-stack gegenereerd video, geproduceerd door een laser confocal omgekeerde Microscoop scannen. De schaal balken werden geraamd van vorige Microscoop beelden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Primaire en erotische sex ratio's van de Rickettsia-geïnfecteerd of niet-geïnfecteerde B. tabaci. Vak en friemeltje percelen van de primaire sex ratio (percentage van bevruchte eieren, of percentage vrouwelijke zygoten) in het zwart in vergelijking met de volwassen sex ratio (percentage van de volwassen vrouwtjes) in het grijs, van de Rickettsia-besmet (R+) en niet-geïnfecteerde (R -) B. tabaci MEAM1, "MAC1" genetische regel. De doos en friemeltje percelen Toon de mediaan als de middelste lijn, het gemiddelde als een plusteken (+) en bovenste en onderste kwartielen als de lijnen die de eindjes van het vak, en het bereik is vertegenwoordigd in de buitenste lijnen die zich uitstrekt van het vak. Voor R- -eieren scoorde: n = 90; voor R+ eieren scoorde: n = 82. Voor R- volwassenen geteld: n = 60; voor R+ volwassenen geteld: n = 95. In een logistieke analyse van de primaire sex ratio (percentage bevruchte eieren) uitgevoerd in het statistisch pakket R, geen significante effecten werden gevonden voor blok (n = 7, χ2 = 0,29, df = 1, p = 0.59) of voor Rickettsia infectie (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0,47). Adult sex-ratio's, als beïnvloed door blok (n = 6) en de status van de infectie van de Rickettsia , werden op dezelfde manier geanalyseerd. Hier ook, geen significante effecten werden gevonden voor blok (χ2 = 1,20, df = 1, p = 0.27) of voor Rickettsia -infectie (χ2 = 1.02, df = 1, p = 0.31). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is de eerste om de bevruchting tarief of primaire sex ratio van B. tabacite leggen. De uitdaging van dit protocol is dat er onderzoekers om te leren hoe te te behandelen de wittevlieg eieren snel, ervoor te zorgen dat niet meer dan 1 uur verstreken is sinds de eieren waren oviposited totdat ze zijn vastgesteld. Tijdens voorbereidende experimenten waren de eieren die waren vastgesteld op 3 uur of meer postoviposition te oud om te observeren van bevruchting, als syngamy had plaatsgevonden en mitotische divisies aan de gang waren. Tussen de 1 tot 3 h nam de pronuclei op een rondere vorm. Terwijl de vroege aanwezigheid van twee kernen geeft een bevruchte eicel, een beetje later, de bijstelling van de twee kernen ter voorbereiding van de syngamycan lijken te zijn een kern, en later weer, de twee producten van de eerste mitotische divisie zijn te vinden in zowel mannelijke als vrouwelijke eieren. Daarom, het onderscheid tussen de geslachten is niet duidelijk op deze latere tijdstippen, en we adviseren de interval van oviposition tot fixatie tot 1 h als een conservatieve maatregel te beperken. Het is ook uitdagend om te leren hoe te zacht met de eieren met elke overdracht van vloeistof, zodat ze zijn niet per ongeluk aanzuiging in de pipet. Op het moment van het bekijken van de eieren onder een fluorescente microscoop, kunnen een paar van de eieren hebben gebroken tijdens het protocol, zodat die eieren niet sexed en geteld als de pronuclei en dooier kan ontgaan. Anders, zodra de operator comfortabel met deze stappen wordt, het protocol kan worden voltooid gunstig binnen 3 uur, zoals op niet een overnachting fixatie stap vergen doet. Het is ook flexibel in die zin dat het kan worden aangepast voor de vlek van oudere eieren, voor die onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het vastleggen van de ontwikkeling.
Een toepassing van dit protocol omvat onderzoek over seks toewijzing. Hoewel vele tientallen studies van de wittevlieg biologie hebben gemeld adult sex-ratio's in verschillende omgevingen, erotische sex-ratio's verwarren seks toewijzing van de moeder met seks-specifieke ontwikkelingsstoornissen sterfte van nimfen en maken het onmogelijk om de oorzaak te achterhalen van een patroon van de sex ratio. De cytogenetische techniek beschreven hier biedt de mogelijkheid van begrip wittevlieg patronen van geheugentoewijzingen die seks meer in het algemeen. Terwijl de grote dispersief populaties van B. tabaci en andere plagen zoals de kas-wittevlieg, kan Trialeurodes vaporariorum, worden voorspeld resulteren in 1:1 sex ratio's, zo vaak tentoongesteld in laboratorium instellingen22, 23, we ook voorspellen dat reproductieve inmenging, endosymbionten, en potentieel host plant kwaliteit primaire sex-ratio's kunnen beïnvloeden. Dat deze factoren ook geslacht-specifieke sterfte patronen kunnen beïnvloeden tijdens ontwikkeling, systematisch scheeftrekken sex ratio schat, onderstreept de noodzaak van een directe maat voor de primaire sex-ratio.
Terwijl de vrouwelijke bias verbonden met Rickettsia -infectie heeft consequent gevonden in de genetische regel "MAC1"15,18,19, waren de erotische sex-ratio's niet significant vrouwelijke bevooroordeeld in de huidige studie. De primaire sex ratio's waargenomen met de cytogenetica techniek waren niet aanzienlijk beïnvloed hetzij. We censused de primaire en erotische sex ratio's van B. tabaci vrouwtjes op net 1 dag, aan het begin van een bout van de oviposition, toen de vrouwtjes 4 tot 5 dagen oud, zodat de sex ratio's studeerde kan niet hebben vertegenwoordigd de sex ratio's dat we gedurende langere perioden waargenomen. Echter de techniek het mogelijk gemaakt om te bepalen van het tarief van de bevruchting of primaire sex ratio en, in dit geval, toonde een correspondentie tussen de primaire en erotische sex-ratio's.
Bepaling van de bevruchting mogelijk ook waardevolle in gevallen waarin onderzoekers misschien wilt bepalen welk type van reproductieve isolatie onder wittevlieg populaties. Hoewel het is een kwestie van enkele controverse12,24,25, wordt nu algemeen aanvaard dat de naam B. tabaci verwijst naar tientallen cryptische soorten, met bewijsmateriaal door zowel genetische verschillen en overschrijding van de tests in die paar vrouwtjes zijn geproduceerd12,25. In deze studies zou het van belang om te weten waar de isolatie optreedt. Is sperma overgedragen, en heterospecific sperma bevruchten eieren, of poging tot verparingen mislukt? Met betrekking tot de vaststelling van de primaire sex-ratio, deze techniek kunt bepalen of de primaire sex-ratio wordt beïnvloed door endosymbionten, egoïstisch genetische elementen, of een van de vele andere factoren, met inbegrip van soortgenoten, concurrenten, predatoren, parasitoïden, ziekteverwekkers, de waardplant of abiotische effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van NSF (DEB-1020460) te M.S.H. en een USDA AFRI-grant (2010-03752) te M.S.H. De auteurs bedanken Brennan Zehr kleuring wittevlieg eieren met veel vaardigheid en Zen. De auteurs bedanken Mike Riehle voor het toestaan van het gebruik van zijn fluorescente microscoop voor imaging. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Marco Gebiola voor de beelden van het ei. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Jimmy Conway voor het helpen op beslissende momenten tijdens de experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
