Summary
Biz ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI fertilizasyon oranını belirlemek için) ve haplodiploid invaziv haşere Bemisia tabacibirincil seks oranını kullanarak basit bir sitogenetik teknik mevcut.
Abstract
Su emme whiteflies birkaç türün en zarar verici karasal zararlıları dünya çapında onlar yamamak ürün hasar ve onlar vektör bitki virüs nedeniyle bazılarıdır. Çok sayıda çalışma farklı ortamlarda bu türlerin biyolojinin rağmen bir anahtar yaşam öyküsü parametresi, çoluk çocuk seks oranları, az ilgi aldı, henüz nüfus dinamikleri tahmin için önemlidir. Bemisia tabaci birincil seks oranı (oviposition seks oranı) asla bildirilmiştir ama bu haplodiploid böcek yumurta döllenme oranı belirlenerek bulunabilir. Teknik çamaşır suyu, fiksasyon adımlar bir dizi ve genel DNA floresan leke, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, DNA'ya bağlanıcı floresan boya), kadın ve erkek pronuclei bağlamak için uygulanması ile yumurta dechorionation içerir. Burada, teknik ve endosimbiyotik bir bakteri olup olmadığını Rickettsia'nin sp. nr sınamak için kendi uygulamalarına örnek olarak mevcut. bellii, B. tabacibirincil seks oranı etkiledi. Bu yöntem, whiteflies nüfus çalışmaları veya seks ayırma ile bazı çevresel uyaranlara varsa belirlemede yardımcı.
Introduction
Seks ayırma çalışma veya göreli yatırım içinde erkek ve kadın çoluk çocuk, bir davranışsal ekoloji1,2,3temel taşıdır. Davranış adaptif modelleri sınama gücünü yanı sıra, seks ayırma stratejisi bir organizmanın bilerek onun nüfus dinamikleri modelleri iyileştirebilir. Birçok tür seks ayırma anneler tarafından kontrol edilir. Seks ayırma belirlemek için birincil seks oranı veya kadın oranı yumurta yükünün zaman belirlemek önemlidir. Yetişkin ortaya çıkması seks oranında seks ayırma ipuçları sağlayabilir rağmen diferansiyel gelişim mortalite erkek ve dişi gençler arasında yaygın olarak yetişkin seks oranı önemli ölçüde çarpık. Hymenoptera, karıncalar, arılar ve eşekarısı, içeren sipariş böceklerin bazı türleri içinde birincil seks oranı embriyolar genetik DNA görüntülemek için boyama sitogenetik deneyleri ile tespit edilmiştir. Hymenopterans haplodiploid olduğundan, yeni başlayan bir erkek yumurta haploit ve yeni başlayan kadın yumurta diploit ve hem erkek hem de dişi pronuclei (2n) içeren iken sadece kadın pronucleus (n), içerir. Aleyrodidae, true whiteflies bilinen böcek (Hemiptera) sap besleme Aile olmakla birlikte aynı zamanda haplodiploid, birincil seks oranı bu böcekler için kurulan bir tahlil olmamıştır. Bu belki de bu ailenin kaç kozmopolit ciddi zararlıları, çalışma ve cinsiyet oranları whiteflies4,5,6,7 rekabetçi etkileşimleri önemini yoğunluğu göz önüne alındığında şaşırtıcı olduğunu ,8,9,10 ve nüfus dinamikleri genellikle. Haplodiploid böcekler de seks belirlenmesi sistemleri, seçici döllenme ve çevre ile2farklı değişken seks oranları imkanı sağlayan tarafından seks oranları serbest. Burada topluca sweetpotato whitefly bilinen whiteflies türler kompleksinin birincil seks oranını belirlemek için bir teknik mevcut B. tabaci. Bu bir tür ismi birden fazla 28 tür dünya çapında11kapsar ve en zarar verici küresel invaziv zararlıları12,13bazılarını içerir. Bu tekniğin uygulanması seks ayırma şablonlarını B. tabaci ve diğer Aleyrodidae belirlemek için sıcaklık, ana bitki, endosimbiyotik bakteri veya bitki/whitefly gibi değişkenlerin daha titiz bir araştırma sağlayacak patojenler, whitefly birincil seks oranları ve whitefly nüfus dinamikleri etkileyebilir.
Biz herhangi bir karşılaştırılabilir yumurta boyama teknikleri B. tabaciiçin farkında değiller. Bir gecede fiksasyon adım atlar ve bu nedenle, içinde 3 h tamamlanmış olması gibi diğer böcek yumurta14 için kullanılan boyama yöntemleri ile karşılaştırıldığında uygun iletişim kuralıdır. Bir uygulama, bir endosimbiyotik bakteri, Rickettsia'nin sp. nr bir örnek olarak. bellii, laboratuvar hatlarımız B. tabaci Orta Doğu Asya küçük 1 (MEAM1)15,16kadın önyargı ile ilişkilidir. Bir B. tabaci MEAM1 laboratuvar satırda ("MAC1," Maricopa tarım Merkezi'nden toplanan), biz test olup olmadığını Rickettsia'nin-virüslü (R+) kadın döllemek bulaşmamış (R-) dişilerden daha çok yumurta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Oda sıcaklığında iyi havalandırılmış bir alanda veya duman başlık altında gerçekleştirilmiş tüm işleri emin olun. Bu iletişim kuralı tüm 'damla' ın işleç tercihinize bağlı olarak 5-20 µL olarak tanımlanır.
1. ilk kurulum
- Kadın whiteflies temiz yapraklarda Hayır izin. Küçük kafes veya agar bir petri içinde sığacak şekilde kes yaprakları örnekler oviposition arenalarda için. Coverable bir delik küçük kafes veya ekleyebilir veya kaldırabilir yetişkinler için Petri kabına kapağı açın. Alternatif olarak, hızlı bir gemi toplanan yetişkinlerin buza koymak ve sonra onları yaprak üzerinde mevduat. Yumurta baba tarafından pronucleus içine sperm geçiş gözlenmesi sağlamak için oviposition ve en fazla 60 dk, yumurta fiksasyon arasındaki süreyi sınırlayın.
Not: Yumurta yaprak kaldırılmaz yetişkinliğe yetişkin seks oranları kaydetmek için yetiştirilen. - Önce veya whitefly oviposition sırasında mikroskop slayt sabun ve su, kurutma ile temizleyerek iyi ve parafin film bir parça bir ucuna, (şekil 1) parafin film yüzey değil kırmak emin germe hazırlayın.
Not: Parafin filmidir hidrofobik ve yarı opak, damla ve daha kolay görülmesi için yumurta sıvı formu için sağlar.
2. Dechorionation
- Bir cam Pasteur pipet, parafin filmin damla çamaşır suyu çözüm (%0,83 sodyum hipoklorit) ekleyin.
Not: Yumurta 2-3 yumurta içinde her damla eğer sadece izlemek daha kolaydır. Alternatif olarak, bir büyük yumurta sayı yönetmek için 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x damlaları içinde yumurta toplamak.
Uyarı: Çamaşır suyu aşındırıcı; Ne zaman işleme çamaşır suyu ve değil nefes eldiven giymek. - Yetişkin whiteflies yaprak kaldırın.
- Yaprak yumurta açıkça görmek ve tek başına yumurta toplamak için mikroskop altında ve ince bir sonda ile dikkatli bir şekilde yerleştirin. 45 ° veya erimiş pipet ucu (Şekil 2) bir rahat çalışma açıyla minuten nadel çiviyi yerleştirmeden bir araştırma yapmak için.
- Yumurta çamaşır suyu veya 1 x PBS aktarın. 1 x PBS kullanarak, PBS bir cam Pasteur pipette bir kez tüm yumurta toplanır ve çamaşır suyu yumurtalara ekleyin 1 x kaldırın.
Not: Pedicel yaprak kaldırılana kadar yumurta toplarken, yavaş yavaş onun temel yumurtadan kaldır. Pedicel yapış yapış ve çamaşır suyu daldırma kadar yumurta genellikle sonda ucuna kadar sopa.
Not: Bu tüm Kimyasalları Pasteur Pipetler ayrı cam kullanmak için tavsiye edilir ve Pipetler ipuçları daraltmak ve yanlışlıkla whitefly yumurta alıyorum riskini azaltmak için ısı ile değiştirilebilir. Kalıntı ve kontaminasyonu önlemek için her kullanımdan sonra Pipetler deiyonize su ile temizleyin. - 10 dk bekle. Embriyo yumurta 1s büyük bir ilgi ise, yumurta çamaşır suyu ilâ 15 dakika bırakın.
Not: En fazla 1 saat eski olan yumurta için 10 dakika yeterlidir.
3. fiksasyon
Not: Bu adımlar bir Hymenopteran protokolü17alınır.
- (Koryon parçaları içeren) çamaşır suyu bir bardak Pasteur pipet ile kaldırmak ve o atın. Buzul Asetik asit bir cam Pasteur damlaları pipet ve 3 dakika bekleyin ekleyin.
Uyarı: Bu adım bir duman başlık altında devam etmek. Buzul Asetik asit aşındırıcı; Ne zaman eldiven giymek buzul Asetik asit işleme ve, özellikle de artık çamaşır suyu ile birlikte nefes değil. - Buzul Asetik asit bir cam Pasteur pipet ile kaldırın ve Clarke'nın çözüm damla ekleyin (3:1 mutlak etanol: buzul Asetik asit) ile bir bardak Pasteur pipet. Çözüm çoğu buharlaşıp kadar bekleyin (veya 10 min max).
- Bir cam Pasteur pipet ve etanol çoğu buharlaşıp kadar bekleyin (veya 10 min max) yumurta için % 70 etanol damla ekleyin.
4. boyama
- Bir cam Pasteur pipet ile herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak ve bir cam pH 7,0 yakın almak için Pasteur pipet ile yumurta için 1 x PBS damla ekleyin. Mikroskop slayt kurutulma, örneğin, bir boş pipet ucu kutusunda (şekil 3) içinde ıslak kağıt havlu ile önlemek için nem odası ayarlayın. En az 30 dakika bekleyin.
Not: Bir duraklama kullanılmıyorsa, nem odası kuruma engelleyebilirsiniz sürece bu en iyi noktasıdır. - 1 x PBS bir cam Pasteur pipet, kaldırmak ve 0,1 μg/mL DAPI, bir DNA floresan leke damla ekleyin, bir cam Pasteur pipet. Mikroskop slayt bir karanlık nem odasında ayarlayın ve en az 15 dakika bekleyin.
Uyarı: DAPI tahriş edici, eldiven ile hallederim.
5. çamaşır
- Bir cam Pasteur pipet ile DAPI kaldırın.
- 1 damla ekleyin x TBST (5 x çözüm 30 g Tris, NaCl 43.8 g, polysorbate 20 5 mL ve NaN3 [pH 7,5] 1.0 g yapılmış ve PCR sınıf su ile 1 L getirdim) yumurta bir cam Pasteur için pipet. 1 kaldırmadan önce 5 dakika bekleyin bir cam Pasteur pipet ile x TBST. Bu 2 kez tekrarlayın.
6. montaj
- Son yıkama sonra dikkatle mikroskop slayt temiz bir parçası üzerine parafin filmden tüm yumurta pipette. Fazla 1 çıkarın x TBST; daha sonra medya montaj 20 µL ekleyin (% 80 gliserol ve % 20 1 x TBST ile % 2 n-propil-gallat) ve temiz kapak slayt yumurtaları üstüne yerleştirin.
- Uzun süreli depolama için kapak slayt açık oje ile mühür ve, sonra slayt 2 ° C'de karanlıkta saklamak veya hemen floresan mikroskop altında görüntülemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rickettsia'nin B. tabaci MEAM1 kadın fertilizasyon oranını etkiler olup olmadığını sınamak için biz Rickettsia'ninyetiştirilen-(R+) enfekte veya (R-) bulaşmamış B. tabaci börülce bitkilerde (Vigna unguiculata) üzerinde kafesleri 27 ° C, bağıl nem % 70 ve 16 h ışık/8 s karanlık photoperiod ayırın. R+ ve R- dördüncü INSTAR whiteflies dikkatle yapraklarından kaldırıldı ve 200 µL şerit tüplerde izole. Yetişkin ortaya zaman, % 50 kadın gruplarında toplanmıştır ve Petri yemeklerinde temiz yaprakları transfer (n = ~50-100/leaf) çiftleşme 4 gün için. Yaklaşık 20 kadın ve birkaç erkek grupları sonra diske bir temiz yaprak (bir R- yetişkin, R+ yetişkinler için bir tane) 35 mm Petri yemeklerinde %1 agar üzerinde dinlenme transfer edildi. Petri kabına kapağı kesilmişti ve kapsama için kullanılan ince kumaş mesh de aşırı yoğunlaşma engelledi. Yaklaşık 45 dakika sonra tüm yetişkin çıkarıldı, bazı yumurta döllenme oranı belirlemek için hasat edildi ve değil toplanan yumurtalar yetişkinliğe yetişkin seks oranını hesaplamak için yetiştirilen edildi. R+ ve R- whiteflies, tek bir gün için bir kohort bir taşı olarak tanımlanmıştır. Oradayken yetişkin seks oranı hesaplamak için altı blok olduğu gibi bir blok yetişkinliğe arka yetersiz kalan yumurta döllenme oranı veya birincil seks oranı hesaplamak için yedi blok vardı. Genelleştirilmiş bir doğrusal model istatistik paketi R fertilizasyon oranları veya yetişkin seks oranları önemli ölçüde Rickettsia'nin enfeksiyon ve/veya blok tarafından etkiledi olup olmadığını belirlemek için kullanıldı. Yanıt değişkenler vardı oranı döllenmiş yumurta/tüm yumurta veya kadın yetişkin oranı/tüm yetişkin, sırasıyla, süre açıklayıcı değişkenler blok ve Rickettsia'nin enfeksiyon durumu vardı.
Yumurta dechorionation DAPI nükleer boyama tarafından takip izin fertilizasyon (ve embriyo seks) kesin atama gözlenen floresan mikroskop (şekil 4). Bu deneme için 90 yumurta R tarafından-B. tabaci MEAM1 kadın koydu ve R+B. tabaci MEAM1 kadın tarafından 82 yumurta skorlanmıştır. Yetişkinliğe yetiştirilen yumurta gelince, 60 R- ve 95 R+ yetişkin skorlanmıştır. Yetişkin R+ yetişkin seks oranları kadın bir önyargı sürekli olarak daha önceki çalışmalar15,18,yılında19geçerli çalışmada gösterilmiştir seks oranları (% 69 kadın, medyan) R için karşılaştırıldığında erkek önyargılı önemli katkılarda bulunmuştur - kadın (% 50 kadın, medyan), ama iki tedavisine seks oranları önemli ölçüde farklı değildi (χ2 1.02, df = 1, p = 0.31; = Şekil 5). Birincil R- seks oranları (% 60'ı döllenmiş yumurta, medyan) R+ sex oranları (% 44 döllenmiş yumurta, medyan) göre erkek önyargılı ama aynı zamanda önemli ölçüde farklı değildi (χ2 0,51, df = 1, p = 0.47 =), hayır sağlama R+ kadın (şekil 5) tarafından büyük fertilizasyon oranları için kanıt. Blok da birincil üzerinde önemli bir etkisi yoktu (χ2 0,29, df = 1, p = 0.59 =) ya da yetişkin (χ2 1,20, df = 1, p = 0.27 =) seks oranı.
Şekil 1: mikroskop slayt parafin film ve damla çamaşır suyu ile fotoğrafı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ısı, pipet ucu ve minuten nadeln PIN ile moda bir sonda örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir örnek, bir boş pipet ucu kutu ve ıslak kağıt havlu moda bir nem odasının. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Floresan mikroskop görüntüleri B. tabaci yumurta. (bir) B. tabaci MEAM1 döllenmiş, yeni başlayan kadın yumurtası. (b) Unfertilized, yeni başlayan erkek yumurta. Yumurta az 1 h oviposition sonra sabit ve DAPI ile lekeli. Her yumurta Bankası nedeniyle koydu yumurta20,21' dahil bacteriome progenitör hücre bakteriyel DNA (Portiera, Hamiltonellave Rickettsia'nin) Floresanda. Her yumurta kadın pronucleus yumurta merkezine yakın olduğunu ve sadece dişi yumurta, sperm, muhtemelen bir autofluorescing micropyle nedir yakınındaki yumurta tepe yakınındaki parlak bir çizgi olarak görünür. Bir Z-oluşturulan yığından video, alınan ekran görüntüleri bulunmaktadır confocal ters mikroskobu tarama lazer tarafından üretilen. Ölçek çubukları önceki mikroskop imge--dan tahmin edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Rickettsia'ninbirincil ve yetişkin seks oranları-enfekte veya bulaşmamış B. tabaci. Birincil seks oranı (yüzde döllenmiş yumurta veya kadın zigotları yüzdesi) gri, Rickettsia'nin, yetişkin seks oran (percentage Yetişkin kadın) göre siyah kutu ve bıyık araziler-enfekte (R+) ve (R bulaşmamış -) B. tabaci MEAM1, "MAC1" genetik hattı. Kutusu ve bıyık araziler Ortanca orta çizgi, artı işareti olarak ortalama ve üst ve alt Dörttebirlikler biter kutusunun satırları olarak göstermek ve Aralık kutusundan uzanan dış hatlarında temsil edilir. R- yumurta attı: n = 90; R+ yumurta attı: n 82 =. R- yetişkin sayılır için: n = 60; R+ yetişkin sayılır için: n 95 =. İstatistik paketi R gerçekleştirilen bir lojistik analizinde birincil seks oranı (döllenmiş yumurta oranı), blok için hiçbir önemli etkisi bulundu (n = 7, χ2 0,29, df = 1, p = 0.59 =) veya Rickettsia'nin için Enfeksiyon (χ2 0,51, df = 1, p = 0.47 =). Blok etkisinde olarak yetişkin seks oranları (n = 6) ve Rickettsia'nin enfeksiyon durumu, benzer şekilde analiz edildi. Burada hiçbir önemli etkisi bloğu için de, bulundu (χ2 1,20, df = 1, p = 0.27 =) veya Rickettsia'nin enfeksiyonu (χ2 1.02, df = 1, p = 0.31 =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu döllenme oranı veya B. tabacibirincil seks oranını yakalamak için ilk kuralıdır. Bu protokol bu değil daha onlar düzeltilinceye kadar yumurta oviposited beri 1 saat geçti sağlamak whitefly yumurta hızlı bir şekilde ele alınacağını öğrenmek araştırmacılar gerektirir mücadeledir. Ön deneyler sırasında 3 h ya da daha fazla postoviposition tespit edildi yumurta döllenme, syngamy meydana gelmiş ve Mitotik bölünmeler devam edildi olarak gözlemlemek için çok yaşlı idi. 1-3 h arasında pronuclei üzerinde biraz daha yuvarlak bir şekil aldı. Biraz sonra döllenmiş yumurta, iki çekirdek erken varlığını gösterir iken, syngamycan için hazırlık iki çekirdeği appozisyon gibi görünüyor bir çekirdek ve daha sonra tekrar, ilk Mitotik bölünme iki ürün içinde her ikisi erkek ve dişi yumurta bulunur. Bu nedenle, cinsiyetler arasındaki ayrım değil net daha sonra bu zaman noktalarda, ve oviposition elde edilen Aralık. fiksasyon muhafazakar bir ölçü olarak 1 h için sınırlama tavsiye ediyoruz. Böylece yanlışlıkla pipet emişli değil her transfer sıvı ile yumurta ile nazik öğrenmek zordur. Floresan mikroskop altında yumurta ile ilgilenen zamanda, birkaç yumurta iletişim kuralı sırasında yumurtalar sexed ve pronuclei sayılır ve sarısı kaçmış olabilir kırılmış olabilir. Bir kez operatör adımları ile rahat olur, o does değil istemek bir gecede fiksasyon adım gibi aksi takdirde, protokol içinde elverişli bir konuma sahip 3 h, tamamlanabilir. Bu araştırmacılar geliştirme yakalama baktılar için büyük yumurta, leke için değiştirilebilir olduğunu da esnektir.
Bir uygulama Bu protokol seks ayırma araştırma içerir. Her ne kadar birçok çalışmalar whitefly Biyoloji onlarca yetişkin seks oranları farklı ortamlarda bildirdin, yetişkin seks oranları annesi tahsisi seks seks özel gelişimsel ölüm perileri ile şaşkın ve nedenini belirlemek imkansız hale herhangi bir cinsiyet oranı deseni. Burada açıklanan sitogenetik tekniği daha genel olarak seks ayırma şablonlarını anlama whitefly imkanı sağlar. Büyük dağıtıcı nüfus B. tabaci ve diğer zararlıları sera whitefly gibi Trialeurodes vaporariorum, 1:1 seks oranları, sık laboratuvar ayarları22', sergilenen neden için öngörülen 23, biz de tahmin üreme girişim, endosymbionts ve potansiyel olarak ana bilgisayar tesisi kalite birincil seks oranları etkileyebilir. Bu aynı faktörler de sistematik olarak cinsiyet oranı eğriltme geliştirme sırasında seks özel ölüm desenleri etkileyebilir tahminleri, birincil seks oranı doğrudan bir ölçüsü ihtiyacını vurgular.
Kadın önyargı Rickettsia'nin enfeksiyonu ile ilişkili tutarlı bir şekilde genetik satırında "MAC1"15,18,19bulundu iken, yetişkin seks oranları geçerli çalışmada önyargılı önemli ölçüde kadın değildi. Sitogenetik tekniği ile gözlenen oranları önemli ölçüde değildi birincil seks ya da önyargılı. Biz birincil ve yetişkin seks oranları B. tabaci kadın seks oranları okudu bu yüzden dişiler 4-5 gün eski, ne zaman bir oviposition ne dersin, başında sadece 1 gün daha uzun sürelerle gözlenen seks oranları temsil censused. Yine de, teknik yaptı bu döllenme oranı veya birincil seks oranı belirlemek mümkün ve bu örnekte, birincil ve yetişkin seks oranları arasında bir ilişkiyi gösterdi.
Gübreleme belirlemek de durumlarda hangi araştırmacılar whitefly popülasyonlar arasında üreme yalıtım türünü belirlemek isteyebilirsiniz değerli olabilir. Bazı tartışmalara12,24,25meselesi olmuştur iken, bu şimdi genellikle bu ad ile her iki genetik sapma tarafından sağlanan gelen kanıt için şifreli türlerin onlarca B. tabaci eder kabul edilir ve kaç kadın olan testleri geçiş12,25üretti. Bu çalışmalarda, yalıtım oluştuğu bilmek ilginizi. Sperm transfer edilir ve heterospecific sperm yumurta döllemek mu veya teşebbüs matings başarısız olur? Birincil seks oranı tayini ile ilgili, bu teknik birincil seks oranı endosymbionts, bencil genetik öğeleri veya conspecifics, rakipler, yırtıcı da dahil olmak üzere birçok diğer faktörlerden biri tarafından etkiledi belirleyebilirsiniz, parasitoids, patojenler, ana bitki veya abiyotik etkileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma için M.S.H. bir NSF grant (DEB-1020460) M.S.H. için ve USDA AFRI grant (2010-03752) tarafından finanse edildi Yazarlar Brennan Zehr whitefly yumurta çok beceri ve Zen ile boyama için teşekkür ederiz. Yazar Mike Riehle onun floresan mikroskop görüntüleme için kullanımına izin için teşekkür ederiz. Yazarlar Suzanne Kelly ve Marco Gebiola yumurta görüntüler için teşekkür ederiz. Yazarlar Suzanne Kelly ve Jimmy Conway deneyler sırasında çok önemli anlarda yardım ettiğin için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
