Summary
4 ′、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 受精率を決定して haplodiploid 侵襲的病害虫タバココナジラミの一次性比を使用して単純な細胞遺伝学的手法を提案します。
Abstract
Sap を吸うコナジラミのいくつかの種は世界の最も有害な地上の害虫の一部を作物損傷、植物ウイルスのベクトルの彼らのためです。異なる環境でこれらの種の生物学の多くの研究にもかかわらず、キーの生活史パラメーター、子孫の性の比率はほとんど注目されて、まだ個体群動態を予測することが重要です。タバココナジラミの一次性比 (産卵性比) ことが報告されているが、この haplodiploid の昆虫の卵の受精率を決定することによって見つけることができます。このテクニックは、漂白剤、一連の固定の手順、一般的な DNA 蛍光染色 DAPI (4 '、6-diamidino-2-phenylindole、DNA 結合色素)、女性と男性の前核にバインドするアプリケーションと卵の dechorionation を伴います。ここでは、技法と共生細菌、リケッチアの sp nr かどうかをテストするのには、そのアプリケーションの一例を提案します。bellii、 B. タバココナジラミの一次性比に影響。このメソッドには、コナジラミ、個体群の研究、ある特定の環境の刺激のセックス割り当てが存在する場合を決定するを助けるかもしれない。
Introduction
性配分に関する研究または男性および女性の子孫の相対的な投資行動生態1,2,3の礎石です。行動の適応モデルをテストするため、その力に加え生物のセックス割り当て戦略を知ることがその個体群の動態のモデルを向上します。多くの種で性配分は母親によって制御されます。セックスの割り当てを調べるには、産卵の時に一次性比や女性の割合を決定することが重要です。羽化で性比が性配分への手がかりを提供しますが、男性と女性の稚魚の間発達死亡率差分が大人の性比を大幅に偏る一般的可能性があります。ハチ、アリ、ハチやハチを含む昆虫の順序のいくつかの種の細胞遺伝学的アッセイ、遺伝的 DNA を表示する胚の汚損と一次性比が決定しました。ハエは haplodiploid なので初期オス卵は半数体と初期女性卵は二倍体で、男性と女性の両方前核 (2 n) が含まれている間のみの雌性前核 (n) が含まれています。コナジラミ科、sap 供給族 (半翅目) カメムシ、コナジラミとして知られているがまた haplodiploid、これらの昆虫で主の性比を見つける確立されたアッセイされてはいません。これはおそらく、意外なこの家族にいくつかの国際的な深刻な害虫の研究とコナジラミ4,5,6,7 の競争の相互作用性比の重要性強度を与えられました。 ,8,9,10と個体群動態の一般に。Haplodiploid 昆虫でも、性の比率にとらわれない選択受精と環境2変化する不安定性比の可能性を可能にするセックス定量システム。サツマイモ コナジラミと総称コナジラミの種複合体の主要な性比を把握する手法の紹介B. タバココナジラミ。この 1 つの種名以上 28 種世界11を包含する、最も有害なグローバル侵襲害虫12,13のいくつかが含まれています。B. タバココナジラミと他のコナジラミ科セックス割り当てパターンを決定するためのこの技術の応用は、温度、植物、細胞内共生細菌植物/コナジラミなどの変数のより厳密な調査になります病原体は、コナジラミ一次性比とコナジラミ個体群動態に影響を与える可能性があります。
B. タバココナジラミのための同等の卵染色テクニックと意識しております。プロトコルは、一晩固定ステップを省略し、したがって、3 h 以内に完了することができます他の昆虫の卵14用染色法と比較すると便利です。としてアプリケーション、細胞内共生細菌、リケッチアの sp nr の一例。bellii、 B. タバココナジラミ中東アジア マイナー 1 (MEAM1)15,16の研究室ライン女性のバイアスに関連付けられます。B. タバココナジラミMEAM1 研究室に 1 行で (「MAC1、「マリコパ農業センターから収集) 我々 はテストどうかリケッチアの感染 (R+) 女性 (R-) の感染していない女性よりより多くの卵を受精させます。
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Protocol
注:室温換気エリアまたはヒューム フードの下ですべての作業を行うことを確認します。このプロトコルのすべて 'ドロップ' は、オペレーターの好みに応じて、5-20 μ L として定義されます。
1. 初期設定
- きれいな葉のプレハブハウス女性コナジラミを許可します。産卵のアリーナのためクリップ ケージまたはペトリ皿の寒天培地に合うようにカットの葉があります。クリップ ケージまたはペトリ皿カバーを挿入したり削除大人に coverable 穴をあけます。また、すぐに氷の上収集した大人の容器を置くし、葉にそれらを預金し。卵で父方の前核に精子転移の観察を確実に産卵と卵注視特性から 60 分以上の時間を制限します。
注:卵葉から削除されませんは、大人の性比を記録する大人に飼育することができます。 - 前に、コナジラミ産卵期間中に、まあ、1 つの端、パラフィンの膜表面が壊れないかどうかを確かめる (図 1) にパラフィン フィルムの部分をストレッチして、石鹸と水、それを乾燥で洗浄顕微鏡スライドを準備します。
注:パラフィンの膜は疎水性、半透明、フォームに液体を許可する低下しより簡単に見られる卵します。
2. Dechorionation
- ガラス パスツール ピペット、パラフィン フィルムに漂白剤溶液 (0.83% ナトリウム次亜塩素酸) の滴を追加します。
注:それは場合にのみ 2-3 個の卵は、各ドロップ卵を追跡する簡単です。また、大きな卵の数を管理するリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 滴で卵を収集します。
注意:漂白剤は腐食性;処理漂白剤を吸い込まないようにと手袋を着用します。 - 葉から大人のコナジラミを削除します。
- 卵を明確に参照してくださいし、単独で卵を収集するには顕微鏡の下で、慎重に、プローブを用いた葉を配置します。プローブをするためには、45 ° または溶かされたピペット チップ (図 2) に心地よい働く角で minuten 地上ナダル ピンを挿入します。
- 漂白剤または 1 × PBS に卵を転送します。1x PBS を使用している場合は、PBS ガラス パスツール ピペット一度すべての卵を収集し、卵に漂白剤を追加し、1 x を削除します。
注:卵を収集する際、花柄が葉から削除されるまで、その基本から卵をゆっくりと持ち上げます。花柄が粘着性で、漂白剤に浸漬さまで、卵がプローブの先端にこだわる一般的。
注:すべての試薬に独立したガラス パスツール ピペットを使用する勧めし、ピペットの先端を細く、コナジラミ卵を誤って吸引のリスクを軽減し熱で修正が可能します。残留物や汚染を防ぐため、使用後は必ず純水でピペットをきれい。 - 10 分待ちます。1 h より古い卵の胚発生に興味がある場合は、最大 15 分の漂白剤で、卵を残します。
注:1 h まで古いの卵、10 分で十分です。
3. 固定
注:これらの手順は、ハチのプロトコル17から取得されます。
- ガラス パスツール ピペットで漂白剤 (絨毛膜の断片を含む) を削除し、それを破棄します。ガラス パスツールと氷酢酸の滴ピペットし、3 分待って追加します。
注意:ヒューム フードの下でこの手順に進みます。氷酢酸は腐食性;摩耗手袋とき氷酢酸を処理し、残留漂白剤との組み合わせでは特に、吸入しません。 - ガラス パスツール ピペットと氷酢酸を削除し、クラークのソリューションの滴を追加 (3:1 エタノール: 氷酢酸) ガラス パスツール ピペットします。ソリューションのほとんどが蒸発するまで待つ (か 10 分最大)。
- ガラス パスツール ピペットとエタノールのほとんどが蒸発するまで待機 (または 10 分 max) と卵を 70% のエタノールの滴を追加します。
4. 染色
- ガラス パスツール ピペットで任意の残留エタノールを削除し、ガラス pH 7.0 に近いを取得するパスツール ピペットで卵に 1 × PBS の滴を追加します。(図 3) 中に湿紙タオルで空のピペット チップ ボックスの乾燥などを防ぐために湿度チャンバーに顕微鏡のスライドを設定します。少なくとも 30 分を待ちます。
注:恒湿器は、乾燥を防ぐことができる限り、これは一時停止が必要な場合に最高のポイントです。 - ガラス パスツール ピペット、1 × PBS を削除し 0.1 μ g/mL DNA の蛍光染色 DAPI の滴を追加、ガラス パスツール ピペットします。暗い湿度チャンバー内で顕微鏡スライドを設定し、少なくとも 15 分を待機します。
注意:DAPI は刺激物、だから手袋をはめて処理します。
5. 洗浄
- ガラス パスツール ピペット DAPI を削除します。
- 1 滴を追加 x TBST (5 x で作られた溶液トリスの 30 g、NaCl の 43.8 g、ポリソルベート 20、5 mL とナン3 [pH 7.5] 1.0 g から PCR グレード水 1 L にもたらした) ピペット ガラス パスツールと卵。1 を削除する前に 5 分を待つガラス パスツール ピペットで x TBST。この手順を 2 回繰り返します。
6. 取付
- 最終的な洗浄後ピペット顕微鏡スライドのきれいな部分にパラフィン フィルムからすべての卵が慎重に。余分な 1 を削除する x TBST;メディアのマウントの 20 μ L を追加し、(20% と 80% のグリセロール 1 2 %n プロピルと x TBST)、卵の上にきれいなカバー スライドを配置。
- 長期保存のため明確なマニキュアでカバー スライド シールし、2 ° C で暗闇の中でスライドを保存またはすぐに蛍光顕微鏡下で表示。
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Representative Results
リケッチア B. タバココナジラミMEAM1 女性の受精率に影響を与えるかどうかをテストするため飼育リケッチア-感染 (R+) または (R-) の感染ササゲ植物 (下におけるササゲ) B. タバココナジラミ27 ° C、相対湿度が 70%、16 h 光/8 h 暗い日長でケージを区切ります。R+と R- 4 齢コナジラミが慎重に葉から削除され 200 μ L ストリップ管で分離されました。大人が現れると、彼らは 50% 女性のグループに収集され、ペトリ皿にきれいな葉に転送 (n = ~50-100/leaf) 交配の 4 日間。約 20 女性といくつかの男性のグループが 35 mm ペトリ皿 1% 寒天培地の上にきれいなリーフ ディスク (R-大人、R+大人用に 1 つ) に転送されます。シャーレの蓋カットされていたし、封じ込めのために使用される高級生地メッシュも過剰な結露は防止。約 45 分後すべての大人が削除された、いくつかの卵は受精率を決定する収穫された、大人の性比を計算する成人期に採取されなかった卵を飼育しました。R+の R- 、コナジラミ、一日 1 つのコホートは、ブロックとして定義されました。大人に育てるための 1 つのブロックから残り物の卵は十分ではありませんがあったので大人の性比を計算するための 6 ブロックにあるとき受精率または一次性比を計算するための 7 つのブロックがあった。一般化線形モデルは、受精率や大人の性比がリケッチア感染症および/またはブロックによって大きく影響したかどうかを判断する統計パッケージ R で使用されました。応答変数が卵や成人女性の割合、比率受精卵/すべて/すべての大人が、それぞれ中説明変数ブロックとリケッチア感染状態であった。
DAPI 染色性が核に続いて卵 dechorionation 許可受精 (と胚性) の明確な割り当て (図 4) の蛍光顕微鏡で観察。この実験のためB. タバココナジラミMEAM1 女性 R-によって置かれた 90 卵と R+B. タバココナジラミMEAM1 女性 82 卵にとどまった。成人期に飼育の卵は 60 R-と 95 R+大人にとどまった。大人の性の比率で女性のバイアスが大人 R+以前研究15,18,19、現在の研究で一貫して示されている性比 (69% 女性、中央値) であった女性偏りのある R と比較して-女性 (50% 女性、中央)、2 つの治療で性比が有意差は認められなかった (χ2 = 1.02、df = 1、 p = 0.31;図 5)。プライマリ R-セックス率 (60% 受精卵、中央値) だった女性バイアス R+の性の比率 (44% 受精卵、中央値) と比較してなかったも大幅に異なる (χ2 = 0.51、df = 1、 p = 0.47)、no を提供します。R+女性 (図 5) で高い受精率の証拠。ブロックはまた主に重大な影響を持っていなかった (χ2 = 0.29、df = 1、 p = 0.59) アダルト (χ2 = 1.20、df = 1、 p = 0.27) 性比。
図 1: パラフィン膜および漂白剤の滴を顕微鏡スライドの写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ピペット チップと minuten 地上 nadeln ピンからの熱で、プローブの例。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 空ピペット先端] ボックスとぬれたペーパー タオルから作られる湿度チャンバーの例。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
B. タバココナジラミ卵の図 4: 蛍光顕微鏡画像。(、) B. タバココナジラミMEAM1 受精、初期の女性の卵。(b) Unfertilized、初期オス卵。卵は、産卵後 1 h 未満で固定され、DAPI 染色します。それぞれの卵のベースが産んだ卵20,21に含まれている bacteriome の前駆細胞の細菌の DNA (Portiera、 Hamiltonella、およびリケッチア) により蛍光を発する。それぞれの卵雌性前核は、卵の中央近く、女性の卵のみ、精子が、おそらく autofluorescing 珠孔近く卵の頂点近くの明るい縞として表示されます。画像生成 Z スタックからビデオ、撮影したスクリーン ショットは、倒立顕微鏡走査型レーザーによって生成されます。スケール バーは、以前の顕微鏡画像から推定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: プライマリおよび成人性の比率リケッチア-感染または感染B. タバココナジラミ。黒にグレーのリケッチアの大人の性比 (成人女性の割合) と比較して一次性比 (受精卵の割合または女性の受精卵の割合) のボックスと、ウィスカのプロット-(R+) を感染し、感染 (R-) B. タバココナジラミMEAM1、"MAC1"遺伝ライン。ボックスと、ウィスカのプロットが真ん中のライン、プラス記号として平均ボックスの終了線として上下の四分位数と中央値を表示、範囲がボックスから伸びる外側の線で表されます。R-卵の得点のため: n = 90;R+卵の得点のため: n = 82。R-大人カウント: n = 60;R+大人カウント: n = 95。一次性比 (受精卵の割合) の統計パッケージ R で実行する物流分析、重要な効果の見つかりませんでしたブロック (n = 7、χ2 = 0.29、df = 1、 p = 0.59)、リケッチア感染症 (χ2 = 0.51、df = 1、 p = 0.47)。ブロックの影響を受け、大人の性比 (n = 6)、リケッチア感染状態、同様に検討を行った。ここで同様に、重大な影響が見つかりませんでしたブロック (χ2 = 1.20、df = 1、 p = 0.27)、リケッチア感染症 (χ2 = 1.02、df = 1、 p = 0.31)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコル受精率またはB. のタバココナジラミの一次性比をキャプチャする最初のです。このプロトコルへの挑戦はできない以上 1 h は、彼らが修正されるまで、卵が頭から経過したことを確認のコナジラミ卵を迅速に処理する方法について説明する研究者です。予備実験の間に 3 h またはより多くの postoviposition で固定した卵が配偶子が発生するいたし、の分裂が進められていた、受精を観察するには古すぎます。1 に 3 h 間前核を丸い形に取った。Syngamycan の準備のために 2 つの核の同格が 1 つの核のように見える 2 つの核の初期の存在では、受精卵を少し後を示します中、以降では男性と女性の卵の最初の分裂の 2 つの製品を発見するまた。したがって、男女間の区別は、これらの後の時点でクリアと保守的な措置として 1 h に固定する産卵から間隔を制限することをお勧めします。また、ピペットに誤って吸引されますない、液体の各転送で卵に優しくなるようにする方法を学習するは困難です。蛍光顕微鏡下で卵の表示の時に、卵黄がエスケープとそれらの卵を性欲を刺激され前核としてカウントできないので、プロトコルの中に卵の数が壊れているかもしれない。それ以外の場合、オペレーターが手順と快適になると、一度、プロトコルは、一晩固定ステップを必要としない、3 時間以内に完了できます。研究開発を取り込むため、古い卵を染色する変更できるという点で、柔軟性も。
この議定書の適用には性配分に関する研究が含まれます。コナジラミの生物学の研究の多くの多数が異なる環境で大人のセックス率を報告している大人の性比ニンフの性特異的発達の死亡率と母親の最適性を混同しないため、原因を特定することが不可能任意の性比のパターン。ここで説明した細胞遺伝学的手法により理解コナジラミの可能性より一般的にセックス割り当てパターン。B. タバココナジラミと他の温室コナジラミなどの害虫の大規模な分散型集団中、オンシツコナジラミに対する1:1 の性比、頻繁に実験室の設定22,で展示する予測可能性があります。23, 我々 はまた生殖干渉、共生、および可能性のあるホスト植物の品質が主の性比に影響を及ぼすことを想定します。これらの同じ要因ことができる過程を体系的に男女比を傾斜性特異的死亡率パターンを影響も予測、主の性比の直接測定のための必要性を強調します。
リケッチア感染症に関連付けられている女性のバイアスは、一貫して遺伝ライン"MAC1"15,18,19で発見されている、しながら大人の性比はなかった大幅女性現在におけるバイアス。プライマリ性器の細胞遺伝学を用いた観察比で大幅はなかったどちらか一方に片寄ります。我々 は censused であるB. タバココナジラミ雌産卵試合、いたとき、女性 4 から 5 日間、古いので性の比率の研究の初めの 1 日だけのプライマリおよび大人の性比がない我々 が長い期間にわたって観察した性の比率を表しています。それにもかかわらず、テクニックを可能にした受精率または一次性比を決定し、このインスタンスは、プライマリおよび大人の性の比率の間に対応を示した。
受精の決定は、研究者がコナジラミ集団間での生殖隔離の種類を決定する必要がありますインスタンスで貴重な場合もあります。それはいくつかの論争の12,24,の25の問題をされている、それが今一般に受け入れられる名前B. タバココナジラミを指すこと数十種、両方の遺伝的分化によって提供されている証拠で、12,25を生産テストいくつかの女性を渡るします。これらの研究で、分離が発生します知っている興味のでしょう。精子を転送しては異種の精子受精卵、または試行された交配が成功?一次性比の決定に関するこの手法は、一次性比が、共生、利己的な遺伝的要素、または個体、競合他社、捕食者を含む他の多くの要因の 1 つを受けますかどうか判断できます。寄生蜂、病原体、宿主植物または非生物的効果。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
細胞刺戟する NSF grant (デブ 1020460) 細胞刺戟して米国農務省アフリカ グラント (2010-03752) によって資金が供給されたこの研究著者は、多くのスキルと禅コナジラミ卵の汚損のためブレナン ジョンゼをありがとうございます。著者は、マイク Riehle が彼の蛍光顕微鏡イメージングのための使用を許可することをありがちましょう。著者らは、卵画像スザンヌ ケリーとマルコ Gebiola をありがとうございます。著者は、実験中に重要な瞬間を助けるのためのスザンヌ ケリーとジミー コンウェイをありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
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