Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/59213
Automatic Translation
1, 2
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

Summary

אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.

Abstract

מינים אחדים למציצת צוף כנימות עש הם חלק המזיקים יבשתי המזיק ביותר ברחבי העולם בגלל הנזק היבול שהם ממיטים ווירוסים צמח שהם וקטור. למרות מחקרים רבים של הביולוגיה של המינים הללו בסביבות שונות, פרמטר היסטוריית החיים, יחסי מין הצאצא, קיבל תשומת לב מועטה, עדיין חשוב לניבוי המלאכותיות. היחס סקס ראשי (יחס מין בבית ההטלה) של כנימת עש הטבק לא דווחה, אך ניתן למצוא על ידי קביעת שיעור הפריה הביצית של החרק haplodiploid. הטכניקה מערבת את dechorionation של ביצים עם אקונומיקה, סדרה של צעדים קיבוע של היישום של הכתם פלורסנט כללי ה-DNA, דאפי (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, מחייב הדי הפלורסנט), כדי לאגד pronuclei נשי. כאן, אנו מציגים את הטכניקה, דוגמה של היישום שלה, כדי לבדוק אם החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, השפיע על היחס המין העיקרי של עש. שיטה זו עשויה לסייע לימודי אוכלוסיה של כנימות עש, או לקבוע אם קיימת הקצאת סקס עם גירויים סביבתיים מסוימים.

Introduction

המחקר של הקצאת סקס, או את ההשקעה היחסית בצאצאים זכר ונקבה, הוא אבן יסוד של אקולוגיה התנהגותית1,2,3. בנוסף כוחה לבדיקת דגמי התנהגות מסתגלת, לדעת את האסטרטגיה הקצאת סקס של אורגניזם עשוי לשפר את דגמי שלה המלאכותיות. במינים רבים, הקצאת מין נשלטת על ידי אמהות. כדי לקבוע מין ההקצאה, חשוב לקבוע את היחס סקס ראשי או את הפרופורציה של נקבות בזמנו של ביצה התצהיר. למרות היחס מין אצל הבוגרים עשוי לספק רמזים להקצאת סקס, דיפרנציאלי התפתחותית התמותה בין קטינים זכר ונקבה עשויים בדרך כלל להטות היחס סקס למבוגרים באופן משמעותי. במינים מסוימים של דבוראים, הסדר של חרקים המכיל נמלים, דבורים, צרעות, היחס מין העיקרי נקבע עם מבחני cytogenetic, מכתימה את העוברים כדי להציג את ה-DNA הגנטי. בגלל hymenopterans haplodiploid, ביצה זכר התחלתית הוא הפלואידי ומכיל רק את הנקבה pronucleus (n), בעוד ביצים הנשי התחלתית דיפלואידי ומכילים pronuclei גם זכר וגם נקבה (2n). למרות Aleyrodidae, משפחת האכלה sap של פשפשים (פשפשאים) המכונה כנימות עש, גם haplodiploid, לא חלה assay הוקמה כדי למצוא את יחס מין העיקרי חרקים אלה. זה אולי מפתיע בהתחשב האינטנסיביות של מחקר של כמה מזיקים רציניים הקוסמופוליטית במשפחה הזאת ואת החשיבות של יחסי מין באינטראקציות תחרותי של כנימות עש4,5,6,7 ,-8,-9,-10 ב המלאכותיות בדרך כלל. בחרקים haplodiploid גם יחסי מין הם עכבות סקס נחישות מערכות, מתן אפשרות הפריה סלקטיבית, יחסי מין יציב להשתנות עם הסביבה2. כאן אנו מציגים טכניקה כדי לקבוע את היחס המין העיקרי של המתחם מינים של כנימות עש המכונה באופן קולקטיבי כנימת עש הטבק sweetpotato, עש ב. שם זה מין אחד כוללת מינים יותר מ-28 ברחבי העולם11, כולל חלק12,הכללית מזיקים פולשנית המזיק ביותר13. היישום של טכניקה זו לקביעת מין דפוסי הקצאת עש ב ו Aleyrodidae אחרים יאפשרו חקירה קפדנית יותר של משתנים, כולל טמפרטורה, מצמח פונדקאי, endosymbiotic חיידקים או צמח/כנימת עש הטבק גורמי מחלה, שעשוי להשפיע על יחסי המין העיקרי כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק המלאכותיות.

. אנחנו מודעים כל טכניקות דומות מכתים ביצה עבור עש. הפרוטוקול נוח בהשוואה מכתימים שיטות אחרות ביצי חרקים14 כפי שהוא משמיט שלב קיבוע בין לילה, לפיכך, יכול להסתיים בתוך 3 שעות. דוגמה אחת של יישום, של החיידק endosymbiotic, ריקטסיה sp. ע נ. bellii, מזוהה עם הטיית נקבה שלנו שורות מעבדה עש ב 1 קטין במזרח התיכון-אסיה (MEAM1)15,16. בשורה אחת דרב עש הטבק MEAM1 מעבדה ("MAC1," שנאספו מן המרכז החקלאי Maricopa), אנחנו נבדוק אם ריקטסיה-נקבות (R.+) נגוע להפרות יותר ביצים מאשר נקבות (R.–) נגוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ודא כי כל העבודה מתבצעת בטמפרטורת החדר, מאוורר או תחת ברדס fume. כל "טיפות" ב פרוטוקול זה מוגדרים µL 5 – 20, בהתאם ההעדפה של המפעיל.

1. ההגדרה הראשונית

  1. לאפשר כנימות עש הנשי oviposit על עלים נקיים. דוגמאות ההטלה ארנאס כוללים קליפ כלובים או עלים וחתוכים על אגר בצלחת פטרי. תעשה חור coverable קליפ כלוב או צלחת פטרי כיסוי כדי להוסיף ולהסיר את המבוגרים. לחלופין, במהירות לשים כלי קיבול של מבוגרים שנאספו על קרח, ואז להפקיד אותם על העלה. להגביל את משך הזמן בין ההטלה ואת הביצה קיבעון על לא יותר מ- 60 דקות, כדי להבטיח את התצפית של המעבר זרע לתוך pronucleus אבהית הביצים.
    הערה: יכול להיות גדלו ביצים לא יוסרו מן העלה לבגרות כדי להקליט יחסי מין למבוגרים.
  2. לפני או במהלך ההטלה כנימת עש הטבק, הכן שקופית מיקרוסקופ על ידי לנקות אותו עם סבון ומים, ייבוש זה טוב, ומתיחה אז חתיכה של פרפין הסרט מעל קצה אחד, מוודא שהשטח הסרט פרפין לא לשבור (איור 1).
    הערה: הסרט פרפין הידרופוביות, אטום למחצה, ומאפשר נוזלים לטופס טיפות וביצים כדי להיראות יותר בקלות.

2. Dechorionation

  1. עם זכוכית פסטר פיפטה, להוסיף טיפות של אקונומיקה פתרון (0.83% נתרן תת-כלורי) לסרט פרפין.
    הערה: קל לעקוב אחר ביצים אם רק 2-3 ביצים נמצאות כל טיפה. לחלופין, כדי לנהל מספר ביצים גדולות, לאסוף את הביצים בתוך טיפות 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    התראה: אקונומיקה היא מאכל; ללבוש כפפות בעת טיפול אקונומיקה, לא לנשום.
  2. הסר את הרווחת ובצמח למבוגרים העלה.
  3. מניחים את העלה תחת מיקרוסקופ כדי לראות בבירור את הביצים לאסוף את הביצים ביחידים ובזהירות עם מכשיר בדיקה דק. כדי לבצע בדיקה, להוסיף סיכה נדל minuten ב 45 מעלות או בזווית של עבודה נוח לתוך טיפ פיפטה מומסת (איור 2).
  4. להעביר את הביצים באקונומיקה או 1 x PBS. אם משתמש 1 x PBS, הסר את ה-x 1 PBS עם זכוכית פסטר pipette פעם אחת כל הביצים נאספים, לאחר מכן, להוסיף מלבין הביצים.
    הערה: בעת איסוף ביצים, הרם לאט את הביצה מבסיסו עד pedicel יוסר העלה. Pedicel הוא דביק, הביצה ידבק נפוץ בין קצה המקדח עד זה מוכנס לתוך האקונומיקה.
    הערה: מומלץ לשימוש נפרד זכוכית פסטר סיליקון עבור כל ריאגנטים, ניתן לשנות את מדי סוכר עם חום כדי להצר את הטיפים ולהפחית את הסיכון בטעות כ רפה בעברית ביצים כנימת עש הטבק. כדי למנוע שריפה, זיהום, לנקות מדי של סוכר עם מים יונים לאחר כל שימוש.
  5. המתן 10 דקות. אם יש אינטרס מופרה בביצים שגילן עולה על 1 h, השאירו את הביצים מלבין עד 15 דקות.
    הערה: ביצים שאינן הישן עד 1 שעות, 10 דקות היא מספקת.

3. קיבוע

הערה: השלבים הבאים לקוחים מתוך פרוטוקול Hymenopteran17.

  1. הסר את המלבין (המכיל את השברים chorion) עם זכוכית פסטר פיפטה וזורקים אותו. להוסיף טיפות של חומצה אצטית עם זכוכית פסטר פיפטה, להמתין 3 דקות.
    התראה: להמשיך עם שלב זה ברדס fume. חומצה אצטית היא מאכל; ללבוש כפפות בעת טיפול חומצה אצטית קרחונית, לא לנשום, במיוחד בשילוב עם המלבין שיורית.
  2. להסיר את חומצה אצטית עם זכוכית פסטר פיפטה ולהוסיף טיפות של הפתרון של קלארק (3:1 של כוהל מוחלט: חומצה אצטית) עם זכוכית פסטר פיפטה. חכה עד רוב הפתרון התאדו (או מקסימום 10 דקות).
  3. להוסיף טיפות של 70% אתנול הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה, חכה עד רוב האתנול התאדו (או 10 דקות מקסימום).

4. מכתים

  1. להסיר כל אתנול שיורית עם זכוכית פסטר פיפטה ולהוסיף טיפות 1 x PBS הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה כדי לקבל את ה-pH קרוב 7.0. להגדיר את השקופית מיקרוסקופ תא לחות כדי למנוע לייבוש, לדוגמה, בתיבת עצה פיפטה ריק עם מגבת נייר רטובה בפנים (איור 3). המתן לפחות 30 דקות.
    הערה: זו הנקודה הטובה ביותר אם הפסקה נחוצה, כל עוד תא לחות יכול למנוע לייבוש.
  2. הסר את PBS 1 x עם זכוכית פסטר פיפטה, להוסיף טיפות של 0.1 μg/mL דאפי, כתם פלורסנט דנ א, עם זכוכית פסטר פיפטה. הגדר את השקופית מיקרוסקופ בחדר חשוך לחות ולא לחכות לפחות 15 דקות.
    התראה: דאפי היא מטרד, אז תתמודד עם זה עם כפפות.

5. כביסה

  1. הסר את דאפי עם זכוכית פסטר פיפטה.
  2. להוסיף טיפות 1 x TBST (פתרון x 5 זני 30 גרם של טריס, g 43.8 של NaCl, 5 מ של polysorbate 20 ו- 1.0 g של נאן3 [pH 7.5], והביא 1 ליטר מים כיתה ה-PCR) את הביצים עם זכוכית פסטר פיפטה. להמתין 5 דקות לפני הסרת ה-1 x TBST עם זכוכית פסטר פיפטה. חזור על שלב זה פי 2.

6. הרכבה

  1. לאחר השטיפה הסופית pipette בקפידה כל הביצים מהסרט פרפין לתוך חלק נקי של השקופית מיקרוסקופ. להסיר את עודף 1 x TBST; לאחר מכן, הוסף µL 20 הגוברת מדיה (גליצרול 80% ו-20% 1 x TBST עם 2% n-propyl-מספר) ומניחים שקופית כיסוי נקי על הביצים.
  2. לאחסון לטווח ארוך, לאטום את השקופית כיסוי עם לק ברורה, לאחר מכן, לאחסן את השקופית בחושך ב 2 מעלות צלזיוס או מיד להציג אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבדוק אם ריקטסיה משפיע על הקצב הפריה של עש ב MEAM1 נשים, אנחנו גדלו ריקטסיה-נגוע (R.+) או uninfected (R.–) נולד ב- עש הטבק על לוביה הצמח (Vigna unguiculata) הפרד בין הכלובים-27 ° C, 70% לחות יחסית, של 16 h אור/8 h כהה photoperiod. R+ ו- R– הרביעית לחלל כנימות עש היו בזהירות להסיר עלים, מבודד צינורות רצועת µL 200. כאשר מבוגרים הגיח, הם היו שנאספו בקבוצות של 50% נשים, הועבר עלים נקיים בפטרי (n = ~50-100/leaf) ארבעה ימים של ההזדווגות. קבוצות של 20 נקבות וזכרים מספר הועברו אז דיסק עלה נקי (אחד עבור R– מבוגרים, אחד למבוגרים R+ ) ב- 35 מ מ פטרי נח על אגר 1%. המכסה פטרי נחתכו ומנעו רשת בד בסדר המשמש הבלימה גם עיבוי עודף. לאחר כ- 45 דקות, כולנו מבוגרים הוסרו כמה הביצים נבצרו כדי לקבוע את שיעור ההפרייה, הביצים שנאספו לא שמשקל לבגרות כדי לחשב את יחס מין למבוגרים. עוקבה אחד יום אחד, R+ וגם R– כנימות עש, הוגדר בלוק. היו 7 רחובות לחישוב את קצב הפריה או יחס העיקרי, ואילו היו שישה גושי בניינים לחישוב היחס סקס למבוגרים, ומאחר שלא היו מספיק ביצים שאריות מ גוש בניינים אחד נמצאת מאחור לבגרות. מודל לינארי מוכללת היה בשימוש בחבילת סטטיסטי R כדי לקבוע אם המחירים הפריה או יחסי מין למבוגרים הושפעו באופן משמעותי ריקטסיה זיהום ו/או לחסום. המשתנים התגובה היו שיעור מופרית ביצים/כל הביצים, או היחס של בוגרות/כולנו מבוגרים, בהתאמה, תוך הסבר המשתנים היו בלוק מצב זיהום ריקטסיה .

Dechorionation ביצה ואחריו מכתים גרעיני דאפי מותר ההקצאה ברורה וחד משמעית של הפריה (וגם מין העובר) כאשר נצפתה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4). עבור ניסוי זה, ביצים 90 מאת R–נקבותעש דרב MEAM1 וכן זכו ב 82 ביצים על-ידי הנקבות R+עש נולד ב- MEAM1. באשר ביצים גדלו לבגרות, זכו 60 R– ומבוגרים R+ 95. בעוד דעה קדומה הנשי של יחסי מין למבוגרים הוכח באופן עקבי ב קודמות מחקרים15,18,19, במחקר הנוכחי, R למבוגרים+ יחסי מין (69% נקבות, חציון) היו מוטים נקבה בהשוואה ל- R הנקבות – (50% נשים, חציון), אבל יחסי המין של שני הטיפולים לא היו שונים באופן משמעותי (χ2 = 1.02, df = 1, p = 0.31; איור 5). יחס סקס ראשי R– (ביצים 60% מופרית, חציון) היו מוטה-נקבה בהשוואה ל- R+ יחסי מין (44% מופרית ביצים, חציון) אבל היו גם לא שונה באופן משמעותי (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0.47), מתן לא ראיות עבור שיעורי ההפריה גדול יותר על-ידי הנקבות R+ (איור 5). בלוק גם לא היה אפקט משמעותי על הראשית (χ2 = 0.29, df = 1, p = 0.59) או למבוגרים (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) יחס.

Figure 1
איור 1: צילום של שקופית מיקרוסקופ עם הסרט פרפין, טיפות של אקונומיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דוגמה של החללית, מיושן עם חום, טיפ פיפטה ואת סיכת nadeln minuten. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דוגמה של חדר לחות, עוצב על ידי קופסת עצה פיפטה ריק, מגבת נייר רטובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של ביצי עש ב . הביצית () MEAM1 נולד ב- עש מופרית, התחלתית. ביצה זכר (b) Unfertilized, התחלתית. הביצים היו קבועות פחות מ 1 h לאחר ההטלה, מוכתם דאפי. הבסיס של כל ביצה הוא ואזוריט עקב DNA חיידקי (Portiera, Hamiltonella, ואולי ריקטסיה) בתא קדמון bacteriome, כלול הביצה הניח20,21. ב כל ביצה, pronucleus הנשי הוא סמוך למרכז הביצה, ב הביצית בלבד, הזרע הוא גלוי כמו פס בהיר ליד השיא של הביצה ליד מה זה ככל הנראה micropyle autofluorescing. התמונות הן צילומי מסך שנלקחו ערימה-Z שהופקו וידאו, המיוצר על ידי לייזר הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי סורק. פסי סולם הוערך מתמונות מיקרוסקופ הקודם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ראשי, למבוגרים סקס יחסי של ריקטסיה-נגוע או uninfected עש ב. תיבת, שפם מתווה של ראשי יחס סקס (אחוז של הביצים, או אחוז מופרות נקבה) שחור לעומת היחס סקס למבוגרים (אחוז של נשים בוגרות) אפור, של ריקטסיה-נגוע (R.+), uninfected (R -) עש נולד ב- MEAM1, קו הגנטית "MAC1". שפם ותיבת מראים את החציון כמו הקו האמצעי, הממוצע כמו סימן חיבור עליון ותחתון רביעונים כמו הקווים שהופכים את הקצוות של תיבת, הטווח מיוצג הקווים החיצוניים הארכת מהתיבה. עבור R– ביצים הבקיע: n = 90; עבור R+ ביצים הבקיע: n = 82. למבוגרים R– נספרים: n = 60; למבוגרים R+ נספרים: n = 95. לוגיסטי ניתוח של היחס סקס ראשי (הפרופורציה של הביצים) ביצע בחבילה סטטיסטי R, נמצאו ללא תופעות משמעותיות עבור בלוק (n = 7, χ2 = 0.29, df = 1, p = 0.59) או נגד ריקטסיה זיהום (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0.47). יחסי מין למבוגרים, כמו מושפע בלוק (n = 6) ומצב ריקטסיה זיהום, נותחו באופן דומה. כאן גם אין תופעות משמעותיות נמצאו עבור בלוק (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) או זיהום ריקטסיה (χ2 = 1.02, df = 1, p = 0.31). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה הוא הראשון כדי ללכוד את קצב הפריה או יחס העיקרי של עש. האתגר של פרוטוקול זה הוא כי הוא דורש חוקרים ללמוד כיצד להתמודד עם הביצים כנימת עש הטבק במהירות, להבטיח כי לא יותר 1 h עבר מאז הביצים היו oviposited עד הם קבועים. במהלך הניסויים ראשוני, ביצים זה תוקנו ב 3 h או postoviposition עוד היו זקן מדי כדי להתבונן הפריה, כפי syngamy אירע חטיבות mitotic בעיצומם. בין 1 עד 3 h, לקח pronuclei בצורה יותר עגול. בעוד נוכחות המוקדמות שני גרעינים מציין ביצה מופרית, קצת אחר כך, הפרד של שני גרעינים כהכנה syngamycan מופיעים להיות גרעין אחד, ומאוחר יותר שוב, שני המוצרים של אגף mitotic הראשון מצויים ביצים גם זכר וגם נקבה. לפיכך, ההבחנה בין המינים אינה ברורה בנקודות זמן מאוחר יותר אלו, אנו ממליצים להגביל את מרווח הזמן של הטלה על קיבוע ש 1 כאמצעי השמרני. . זה גם מאתגר כדי ללמוד כיצד להיות עדינה עם הביצים עם כל העברה של נוזל כך הם לא הם בטעות aspirated לתוך פיפטה. בזמנו של הצגת את הביצים במיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמה מן הביצים קוראים לו במהלך הפרוטוקול, אז לא יכול להיות למינים, נספר כ pronuclei הביצים האלו אולי נמלט חלמון. אחרת, ברגע המפעיל הופך נוח עם השלבים, הפרוטוקול יכולה להסתיים בנוחות בתוך 3 שעות, כפי שהוא אינו מצריך שלב קיבוע בין לילה. הוא גם גמיש בכך שניתן יהיה לשנותה כתם ביצים בוגרים, לחוקרים הללו מעוניינים לכידת פיתוח.

יישום של פרוטוקול זה כולל מחקר על הקצאת סקס. למרות עשרות רבות של מחקרים של כנימת עש הטבק ביולוגיה דיווחו על יחסי מין למבוגרים בסביבות שונות, יחסי מין למבוגרים וחיסול סקס הקצאה של האמא עם מין ספציפי התמותה התפתחותית של נימפות, בלתי אפשרי לקבוע את הגורם של כל דפוס יחס. הטכניקה cytogenetic המתוארים כאן מאפשר האפשרות של כנימת עש הטבק הבנת דפוסי הקצאת סקס באופן כללי יותר. בזמן ואנליזת אוכלוסיות גדולות של עש דרב , מזיקים אחרים כגון כוקטורים החממה, Trialeurodes vaporariorum, אולי ניתן לחזות את התוצאה 1:1 יחסי מין, לעיתים קרובות הציג מעבדה הגדרות22, 23, אנחנו גם לחזות כי הפרעה הרבייה, endosymbionts ואיכות שעשויות להיות מארח המפעל יכול להשפיע יחסי המין העיקרי. כי אותם גורמים אלה יכול גם להשפיע על דפוסי מין ספציפי התמותה במהלך הפיתוח, באופן שיטתי הטיית יחס הערכות, מדגישה את הצורך מדד ישיר של היחס סקס ראשי.

בזמן הטיית נקבה המשויך ריקטסיה זיהום נמצאה באופן עקבי בשורה גנטי "MAC1"15,18,19, יחסי המין למבוגרים לא היו באופן משמעותי הנשי מוטה במחקר הנוכחי. המין הראשי יחסי נצפתה עם טכניקה ציטוגנטיקה לא היו באופן משמעותי משוחד גם. אנו censused יחס סקס ראשי ומבוגרים של נקבות עש ב - רק יום אחד, בתחילת התקף ההטלה, כאשר הנקבות היו 4-5 הימים הישנים, אז למד יחסי המין עשוי אינו מיוצג על יחסי מין שהבחנו לאורך תקופות ארוכות יותר. בכל מקרה, הטכניקה אפשרו לקבוע את שיעור הפריה או יחס הראשי, ו, במקרה זה, הראתה התאמה בין יחס סקס ראשי ומבוגרים.

קביעת הפריה עשוי גם להיות יקר במקרים שבהם חוקרים ייתכן שתרצה לקבוע את סוג בידוד הרבייה בקרב אוכלוסיות כנימת עש הטבק. בזמן זה היה עניין של כמה24,12,מחלוקת25, בדרך כלל מקובל לחשוב כעת כי השם דרב עש הטבק מתייחס עשרות מינים נסתר, בראיה סופקו ע י שני סטייה גנטית, חציית בדיקות שבו כמה הנקבות הפיק12,25. במחקרים אלה, זה יהיה עניין לדעת איפה מתרחשת הבידוד. . מועבר הזרע, heterospecific הזרע להפרות את הביצים, או נמצאים matings ניסיון לא מוצלח? לגבי הקביעה של היחס סקס ראשי, טכניקה זו יכולה לקבוע אם היחס מין הראשי מושפע endosymbionts, אנוכי מרכיבים גנטיים או של גורמים רבים אחרים, כולל בני מינו, המתחרים, טורפים, צירעת האפידיוס, פתוגנים, מצמח פונדקאי או אפקטים והאביוטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מענק של ה-NSF (דב-1020460) כדי M.S.H. מענק אפריק USDA (2010-03752) כדי M.S.H. המחברים מודים ברנן Zehr על צביעת ביצים כנימת עש הטבק עם הרבה מיומנות, זן. המחברים תודה מייק ריהלה להתרת השימוש שלו מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הדמיה. המחברים מודים סוזן וקלי מרקו Gebiola על הדימויים ביצה. המחברים תודה סוזן קלי בג'ימי קונוואי על העזרה ברגעים מכריעים במהלך הניסויים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Any
1x TBST Any 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Tags

גנטיקה גיליון 146 כנימת עש הטבק סקס הקצאת יחס העיקרי קצב הפריה ציטוגנטיקה דאפי
קביעת שיעור הפריה הביצית של <em>כנימת עש</em> הטבק בטכניקה Cytogenetic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bondy, E. C., Hunter, M. S.… More

Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter