Summary
우리 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 수정 속도 결정 하 고 Bemisia tabacihaplodiploid 침입 해충의 기본 성 비율을 사용 하 여 간단한 cytogenetic 기법 제시.
Abstract
몇 종의 수액 빠는 whiteflies 그들은 입혀 작물 손상 및 식물 바이러스 벡터 그들이 전세계 가장 파괴적인 지상파 해충 있습니다. 서로 다른 환경에서 이러한 종의 생물학의 수많은 연구에도 불구 하 고 주요 생활 역사 매개 변수, 자손 성 비율, 작은 관심을 받고 있다, 아직 예측 인구 역학에 대 한 중요 한. Bemisia tabaci 의 기본 성 비율 (산란에서 성 비율) 적 보고 하지만이 haplodiploid 곤충의 달걀 수정 속도 결정 하 여 찾을 수 있습니다. 기술은 포함 표 백제, 일련의 고정 단계와 일반적인 DNA 형광 얼룩, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, DNA 바인딩 형광 염료), 여성 및 남성 pronuclei에 바인딩할 응용 프로그램 계란의 dechorionation. 여기, 우리 기술, 그리고 여부는 endosymbiotic 박테리아, 리케차 sp. nr 테스트 하는 응용 프로그램의 예 제시. bellii, B. tabaci의 기본 성 비율에 영향을 받습니다. 이 방법은 whiteflies의 인구 연구 또는 섹스 할당 특정 환경 자극으로 존재 하는 경우 결정 하는 데 도움이 수 있습니다.
Introduction
섹스 할당의 연구 또는 남성과 여성의 자손에 상대적인 투자 행동 생태학1,2,3의 초석입니다. 뿐만 아니라 그것의 행동의 적응 모델을 테스트 하기 위해 기체의 섹스 할당 전략을 알고 하는 것은 그것의 인구 역동성의 모델 높일 수 있습니다. 많은 종에서 섹스 할당 어머니에 의해 제어 됩니다. 섹스 할당을 확인 하려면 그것은 계란 증 착의 시간에 주 성 비율 또는 암컷의 비율을 결정 하는 것이 중요. 성인 출현에 섹스 률 섹스 할당에 단서를 제공할 수 있습니다, 하지만 남성과 여성 청소년 사이의 차동 발달 사망률 수 있습니다 일반적으로 왜곡 성인 섹스 률 크게. Hymenoptera, 포함 개미, 꿀벌, 말 벌, 곤충의 순서의 일부 수 종에 1 차 섹스 률 cytogenetic 분석 실험, 유전자 DNA를 보려면 배아 얼룩으로 결정 되었습니다. Hymenopterans haplodiploid 이기 때문에, 초기 남성 계란 단일 이며 초기 여성 계란 2 중이 고 둘 다 남성과 여성 pronuclei (2n)를 포함 하는 동안만 여성 pronucleus (n)를 포함 합니다. Aleyrodidae, true 버그 (Hemiptera) whiteflies로 알려진의 sap 먹이 가족 haplodiploid도 있지만, 거기 되지 않았습니다 이러한 곤충에 주 성 비율을 찾을 수 설립된 분석 결과. 이것은 아마도 놀라운 주어진이 가족에 몇 가지 국제적인 심각한 해충의 연구와 whiteflies4,,56,7의 경쟁적인 상호 작용에서 섹스 비율의 중요성의 강도 ,8,,910 인구 역학에 일반적으로. Haplodiploid 곤충에도, 섹스 비율 섹스 결정 시스템, 선택적 수정 및 환경2와 다 정한 섹스 비율의 가능성을 수 있도록 두지 않도록 됩니다. 여기에 우리가 whiteflies sweetpotato whitefly로 알려진 종 복합 기본 섹스 비율을 결정 하는 기법을 제시 B. tabaci. 이 한 종 이상 28 종 전세계11를 포함 이름과 파괴적인 글로벌 침입 해충12,13의 일부를 포함 합니다. B. tabaci 및 다른 Aleyrodidae 섹스 할당 패턴을 결정 하기 위해이 기술의 응용 프로그램 변수, 온도, 기 주 식물, endosymbiotic 박테리아, 또는 식물/whitefly 포함의 더 엄격한 조사를 허용할 것 이다 병원 체, whitefly 기본 섹스 비율 및 whitefly 인구 역학에 영향을 미칠 수 있습니다.
우리는 어떤 유사한 계란 얼룩 기법 B. tabaci에 대 한 인식입니다. 프로토콜은 하룻밤 정착 단계를 생략 하 고, 따라서 3 h 이내 완료 될 수 있다 다른 곤충 계란14 사용 되는 착 색 방법에 비해 편리 합니다. 으로 응용 프로그램, endosymbiotic 박테리아, 리케차 sp. nr의 한 예입니다. bellii, B. tabaci 중동 아시아 부 1 (MEAM1)15,16의 우리의 실험실 라인에 여성 바이어스와 연결 됩니다. 우리가 테스트 한 B. tabaci MEAM1 실험실 줄 ("MAC1," Maricopa 농업 센터에서 수집), 여부 리케차-감염된 (R+) 여성 감염된 (R-) 여성 보다 더 많은 계란을 기름 지 게.
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Protocol
참고: 통풍이 잘되는 지역에서 나는 연기 후드 실 온에서 모든 작업 수행 됩니다 확인 합니다. 이 프로토콜에서 모든 '방울' 운영자의 취향에 따라 5-20 µ L로 정의 됩니다.
1. 초기 설정
- 깨끗 한 잎에 oviposit를 여성 whiteflies를 허용 합니다. 산란 경기장에 대 한 예로 클립 감 금 소 또는 잎에 한 천 배양 접시에서 잘라 있습니다. 클립 케이지 또는 삽입 및 제거는 성인 배양 접시 덮개에 coverable 구멍을 확인 합니다. 또는, 신속 하 게 수집 된 성인 배 얼음에 넣고, 다음, 잎에 그들을 입금. 계란에 아버지 pronucleus 정자 전환의 관찰을 위해 산란 및 계란 고정 더 이상 60 분 사이의 시간을 제한 합니다.
참고: 계란 잎에서 제거 되지 않습니다 성인 섹스 비율을 기록 하는 성인을 기르는 수 있습니다. - 전 또는 whitefly 산란 중, 잘, 그리고 다음 파라핀 필름 조각의 한쪽 끝, 파라핀 필름 표면 휴식 하지 않습니다 확인 하 고 (그림 1)을 통해 스트레칭 비누와 물, 건조 그것을 청소 하 여 현미경 슬라이드 준비.
참고: 파라핀 영화 소수는 고 세미 불투명, 삭제 하 고 더 쉽게 볼 수 계란 액체 형태를 허용.
2입니다. Dechorionation
- 유리 파스퇴르와 함께 플라스틱, 파라핀 영화 표 백제 솔루션 (0.83% 염소)의 방울을 추가 합니다.
참고: 그것은 경우에 각 드롭에 2-3 달걀은 달걀의 추적을 쉽게입니다. 또는, 큰 계란의 수를 관리 하기 위해 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 방울에 계란을 수집 합니다.
주의: 표 백제가 부식; 처리 표 백제 및 흡입 하지 할 때 장갑을 착용 한다. - 잎에서 성인 whiteflies를 제거 합니다.
- 계란을 명확 하 게 볼을 단독으로 달걀을 수집 현미경 그리고 신중 하 게 얇은 프로브 잎을 놓습니다. 탐사선을 45 ° 또는 녹은 피 펫 팁 (그림 2)으로 편안한 작업 각도에서 분 nadel 핀을 삽입 합니다.
- 표 백제 또는 1 x PBS 계란을 전송 합니다. 1 x PBS를 사용 하 여 1 x 유리 파스퇴르와 함께 PBS 한 번 계란 수집 하 고, 다음, 계란에 표 백제를 추가 모든 플라스틱을 제거 합니다.
참고: 계란을 수집 하는 때 천천히는 pedicel 잎에서 제거 될 때까지 그것의 기초에서 계란을 들어올립니다. pedicel 스티커, 그리고 표 백제에 담근는 때까지 계란 일반적으로 프로브 팁에 충실 합니다.
참고: 모든 시 약에 대 한 별도 유리 파스퇴르 펫을 사용 하는 것이 좋습니다 하 고는 펫 팁 좁은 고 실수로 whitefly 계란 발음의 위험을 줄이기 위해 열을 수정할 수 있습니다. 잔여물 및 오염 방지, 모든 사용 후 이온된 수와 펫을 청소. - 10 분을 기다립니다. 계란 1 시간 보다 오래 된 embryogenesis에 관심 있다면, 최대 15 분 동안 표 백제에 계란을 둡니다.
참고: 계란을 1 시간까지 10 분은 충분 합니다.
3입니다. 고정
참고: 이 단계는 Hymenopteran 프로토콜17에서 가져옵니다.
- 유리 파스퇴르 피 펫 (chorion 파편을 포함 하는) 표 백제를 제거 하 고 그것을 폐기. 유리 파스퇴르와 빙 초 산의 방울 플라스틱 기다려 3 분 추가 합니다.
주의: 증기 두건 아래이 단계를 진행 합니다. 빙하 아세트산은 부식; 착용 장갑 때 빙 초 산을 처리 하 고, 잔여 표 백제와 함께에 특히 흡입 하지 마십시오. - 유리 피 펫 파스퇴르와 빙 초 산을 제거 하 고 클라크의 솔루션의 방울을 추가 (3: 1의 절대 에탄올: 빙 초 산) 플라스틱 유리 파스퇴르. 대기 솔루션의 대부분은 증발 때까지 (또는 10 분 최대).
- 유리 파스퇴르 피 펫 및 대기는 에탄올의 대부분은 증발 때까지 (또는 10 분 최대) 계란을 70% 에탄올의 방울을 추가 합니다.
4. 얼룩
- 유리 피 펫 파스퇴르와 모든 잔여 에탄올을 제거 하 고 유리 파스퇴르 피 펫 7.0에 가까운 pH를 계란에 1 x PBS의 방울을 추가. 건조, 예를 들어 (그림 3) 내부는 젖은 종이 타월로 빈 피 펫 팁 상자에서 방지 하기 위해 습도 챔버에 현미경 슬라이드를 설정 합니다. 적어도 30 분을 기다립니다.
참고: 이것은 최고의 포인트 일시 필요한 경우로 습기 건조를 방지할 수 있습니다. - 유리 파스퇴르 피 펫, 1 x PBS를 제거 하 고 0.1 μ g/mL DAPI, DNA 형광 얼룩의 방울을 추가, 플라스틱 유리 파스퇴르. 어둠의 습도 챔버에 현미경 슬라이드를 설정 하 고 15 분 이상 기다립니다.
주의: DAPI 자극, 그래서 장갑 처리.
5입니다. 세척
- 유리 피 펫 파스퇴르 DAPI를 제거 합니다.
- 1 방울을 추가 x TBST (5 배 솔루션 트리 스의 30 g, NaCl의 43.8 g, 폴 20의 5 mL 및 1.0 g 앤3 [pH 7.5]의 만든 및 PCR 학년 물 1 L에 가져온) 플라스틱 유리 파스퇴르와 함께 계란. 1을 제거 하기 전에 5 분 기다립니다 유리 파스퇴르 피 펫 x TBST. 2 번이이 단계를 반복 합니다.
6입니다. 장착
- 최종 세척 후 신중 하 게 현미경 슬라이드의 깨끗 한 부분에 파라핀 영화에서 모든 계란 플라스틱. 초과 1 제거 x TBST; 그런 다음 미디어를 장착의 20 µ L를 추가 (80% 글리세롤과 20 %1 2 %n-틸-gallate와 x TBST) 계란 위에 깨끗 한 커버 슬라이드를 놓습니다.
- 장기 저장을 위한 투명 매니큐어와 커버 슬라이드를 봉인, 다음, 2 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 하거나 즉시 형광 현미경 아래 그것을 볼 합니다.
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Representative Results
리케차 B. tabaci MEAM1 여성에 대 한 수정 속도 영향을 미치는 여부를 테스트 하려면 우리 reared 리케차-감염 (R+) 또는 (R-)를 감염 되지 않은 B. tabaci 에서 cowpea 식물 (Vigna unguiculata)에 27 ° C, 상대 습도 70%, 그리고 빛/8 h 16 h 어두운 photoperiod 케이지를 분리 합니다. R+ 및 R- 4 탈피 whiteflies 신중 하 게 잎에서 제거 하 고 200 µ L 스트립 튜브에서 고립 되었다. 성인 등장, 그들은 50% 여성의 그룹에 수집 하 고 접시에 깨끗 한 잎을 전송 (n = ~50-100/leaf) 짝짓기의 4 일 동안. 약 20 명의 여성 및 여러 남성 그룹 다음 35 mm 접시 1 %agar 휴식에 (R- 성인, R+ 성인 한 한) 깨끗 한 잎 디스크에 옮겨 졌다. Petri 접시 뚜껑 잘라 되었습니다 하 고 좋은 직물 메시 봉쇄에 대 한 사용 또한 초과 결로 방지. 약 45 분 후 모든 성인 제거 하 고 계란의 일부 수정 속도 결정 하기 위해 수확 했다 계란 수집 된 성인 성인 섹스 비율을 계산에 reared 했다. 한 코 호트 연구+ 및 R- whiteflies, 단 하루에 대 한 블록으로 정의 되었다. 성인 기에 후면 한 블록에서 충분 하지 않은 남은 계란 처럼 성인 섹스 비율 계산 6 블록 거기 동안 수정 속도 또는 1 차 섹스 률 계산을 위한 7 개의 블록을 확인 하 고 있었다. 일반화 선형 모델 수정 요금 또는 성인 섹스 비율 리케차 감염 또는 블록에 의해 크게 좌우 되었다 여부를 확인 하려면 통계 패키지 R에에서 사용 되었다. 응답 변수 했다 계란, 또는 여성 성인의 비율의 비율 계란/모든 수정/모든 성인, 각각, 동안 설명 변수 블록 및 리케차 감염 상태를 했다.
계란 dechorionation DAPI 핵 얼룩 다음 수정 (및 태아 성)의 명확한 지정 허용 (그림 4) 형광 현미경으로 관찰 하는 경우. 이 실험에 대 한 90 달걀 누워 r-B. tabaci MEAM1 여성 하 고 R+B. tabaci MEAM1 여성에 의해 82 계란 득점 했다. 계란은 성인 기에 reared에 관해서는 60 R- 와 95 R+ 성인 득점 했다. 성인 섹스 비율에 여성 바이어스 성인 R+ 이전 연구15,18,19, 현재 연구에서에서 일관 되 게 표시 되었습니다 섹스 비율 (평균 69% 여성) 했다 여성 편견 R에 비해 - 여성 (50%, 여성 평균), 두 치료에서 섹스 비율 하지만 크게 다른 없었다 (χ2 = 1.02, df = 1, p = 0.31; 그림 5)입니다. 기본 R- 섹스 비율 (60% 수정 된 달걀, 중간) R+ 섹스 비율 (44% 수정 된 달걀, 중간)에 비해 여성 편견 했다 하지만 했다 또한 크게 다른 (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0.47), 아니오를 제공 R+ 여성 (그림 5)에 의해 큰 수정 요금에 대 한 증거. 블록도 하지 않은 기본에 큰 영향 (χ2 0.29, df = = 1, p = 0.59) 또는 성인 (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) 섹스 비율.
그림 1: 파라핀 영화와 백제의 드랍 스 현미경 슬라이드의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로브, 유행 열, 피 펫 팁과 분 nadeln 핀에서의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 빈 피 펫 팁 상자와 젖은 종이 수건에서 유행 하는 습도 챔버의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
B. tabaci 계란의 그림 4: 형광 현미경 이미지. (한) B. tabaci MEAM1 수정, 초기 여성 계란. (b) 초기 Unfertilized 남성 계란. 계란 산란 후 1 시간 미만에서 고정 되었고 DAPI 스테인드. 각 계란의 누워 계란20,21에 포함 되어 있는 bacteriome 조상 세포의 세균성 DNA (Portiera, Hamiltonella, 그리고 리케차) 인 fluorescing입니다. 각 계란에서 여성 pronucleus는 계란의 중앙 이며 여성 계란만, 정자 무엇입니까 autofluorescing micropyle 아마도 근처 계란의 꼭대기 근처 밝은 연속으로 표시 됩니다. 이미지 비디오, Z 스택 생성에서 가져온 스크린샷입니다 레이저 confocal 거꾸로 현미경 검사에 의해 제작. 스케일 바 이전 현미경 이미지에서 견적 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 기본 및 성인 섹스 비율이 리케차-감염 또는 감염 되지 않은 B. tabaci. 주 성 비율의 (수정 된 달걀의 비율 또는 여성 zygotes의 비율) 검은 회색, 리케차의 성인 섹스 률 (성인 여성의 비율)에 비해 상자와 수염 음모-감염 (R+)와 (R 감염 되지 않은 -) B. tabaci MEAM1, "MAC1" 유전 선. 상자와 수염 음모 쇼 중간 중간 라인, 더하기 기호로 평균 및 상위 및 하위 quartiles 상자의 끝을 확인 하는 선으로 하 고 범위 상자에서 확장 외부 라인에 표시 됩니다. R- 달걀 득점: n = 90; R+ 달걀 득점: n 82을 =. R- 성인 계산: n = 60; R+ 성인 계산: n = 95. 주 성 비율 (수정 된 달걀의 비율)의 물류 분석 통계 패키지 R에서, 아니 상당한 효과 블록에 대 한 발견 (n = 7, χ2 0.29, df = 1, p = = 0.59) 또는 리케차 감염 (χ2 = 0.51, df = 1, p = 0.47). 블록에 의해 영향으로 성인 섹스 비율 (n = 6)와 리케차 감염 상태를 유사 하 게 분석 했다. 여기 뿐만 아니라, 어떤 중요 한 영향을 미칠 발견 블록 (χ2 = 1.20, df = 1, p = 0.27) 또는 리케차 감염에 대 한 (χ2 1.02, df = 1, p = = 0.31). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 수정 속도 또는 B. tabaci의 1 차 섹스 률을 캡처 처음 이다. 이 프로토콜의 도전은 그것 whitefly 계란을 신속 하 게 처리 하는 방법은 연구자 1 h는 고정 될 때까지 계란 oviposited 했다 이후 통과 했다 보다 더 보장 요구 이다. 예비 실험, 동안 3 h 또는 더 postoviposition에서 수정 된 계란 너무 오래 수정, syngamy 발생 했다 고 mitotic 사단 진행 했다 관찰 했다. 1 ~ 3 h, 사이 pronuclei 라운드 모양에 했다. 두 핵의 초기 존재 이면 수정 된 계란, 조금 나중에, syngamycan에 대 한 준비에 두 핵의 apposition 표시 한 핵, 그리고 나중에 다시, 첫번째 mitotic 사단의 두 제품 모두 남성과 여성의 계란에서 찾을 수 있습니다. 따라서, 남녀 간의 구별이 분명이 나중 시간 지점에서 그리고 산란에서 보수적인 측정으로 1 시간에 고정 간격을 제한 하는 것이 좋습니다. 또한 각 전송 액체의 계란과 부드러운 될 실수로 피펫으로으로 발음 하지는 그 방법은 도전 이다. 형광 현미경에서 계란을 볼 당시, 계란의 몇 가지 수 있습니다 깨진 있다 프로토콜, 동안 그래서 그 알 수 없는 수 sexed는 pronuclei로 계산 하 고 노른자위를 탈출할 수 있는. 그렇지 않으면, 일단 운영자 되 다음이 단계와 함께 편안 하 게 하 고, 프로토콜 완료할 수 있습니다 3 h 이내에 편리 하 게 하룻밤 정착 단계를 필요로 하지 않습니다. 그것은 또한 유연한에 캡처 개발에 관심이 그 연구자에 대 한 더 오래 된 계란 얼룩을 수정할 수 있습니다.
이 프로토콜의 응용 프로그램 섹스 할당에 대 한 연구를 포함합니다. Whitefly 생물학의 연구의 많은 수십 서로 다른 환경에서 성인 섹스 비율 보고, 비록 성인 섹스 비율 nymphs의 섹스 관련 발달 사망률과 어머니의 섹스 할당을 혼동 하 고 원인을 확인 하는 것이 불가능 합니다. 어떤 섹스 비율 패턴입니다. 여기에 설명 된 cytogenetic 기술은 수 있습니다 이해 whitefly 가능성 섹스 할당 패턴을 더 일반적으로. B. tabaci 와 온실 whitefly 같은 다른 유해물의 큰 분산 인구, 동안 이 살충제, 자주 실험실 설정22, 전시, 1:1 섹스 비율을 예측할 수 있습니다. 23, 우리는 또한 생식 간섭, endosymbionts, 및 잠재적으로 호스트 공장 품질 기본 섹스 비율 영향 수 예측. 이 동일한 요인은 또한 영향을 미칠 수 섹스 관련 사망률 패턴 개발, 체계적으로 기울이기 섹스 률 추정, 주 성 비율의 직접 측정에 대 한 필요성을 밑줄.
반면 여성 바이어스 리케차 감염 연관 유전 선 "MAC1"15,,1819에 일관 되 게 발견 되었습니다, 성인 섹스 비율 했다 크게 여성 현재 연구에 있는 편견. 세포 유전학 기술 관찰 비율 크게 되지 않은 기본 섹스 편견 중 하나. 우리 censused는 산란 시 합, 암컷 4 ~ 5 일 오래 된, 그래서 섹스 비율 공부 때의 처음에 단지 1 일에 B. tabaci 여성 기본 및 성인 섹스 비율이 오랜 동안 관찰 섹스 비율 표시는 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 기술을 가능 하 게 했다 수정 속도 또는 1 차 섹스 률을 결정 하 고,이 경우, 기본 및 성인 섹스 비율 간의 관계를 보였다.
수정 결정 또한 whitefly 인구 가운데 생식 격리의 유형을 결정 하기 위해 연구원 수도 경우에 유용할 수 있습니다. 동안 그것은 몇 가지 논쟁12,,2425의 문제는, 그것은 지금 일반적으로 수용 이름 B. tabaci 는 것 이상한 종의 수만 증거 두 유전 발산에 의해 제공 되 고 테스트 몇 암컷은 건너12,25생산. 이러한 연구에, 그것은 관심을 분리 하 여 발생 하는 위치를 알고 있을 것 이다. 정자 전송지 않습니다 heterospecific 정자 비 옥 달걀, 또는 성공 하지 않는 시도 matings? 주 성 비율의 결정에 관한이 기술은 기본 섹스 비율 endosymbionts, 이기적인 유전 요소, 또는 conspecifics, 경쟁, 포식 자를 포함 하 여 다른 많은 요소 중 하나에 의해 영향을 여부를 확인할 수 있습니다. parasitoids, 병원 균, 기 주 식물, 또는 비 생물 적인 효과.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 M.S.H.를 NSF 그랜트 M.S.H. (뎁 1020460)와 USDA AFRI 그랜트 (2010-03752)에 의해 투자 되었다 저자는 브 레 넌 Zehr 많은 기술과 선 whitefly 계란 얼룩 하지 감사. 저자는 마이크 Riehle 이미징에 대 한 그의 형광 현미경의 사용을 허용 하지 감사. 저자 수잔 켈리와 마르코 Gebiola 그 이미지에 대 한 감사. 저자 수잔 켈리와 지미 콘웨이 실험 중 중요 한 순간에 도움을 주셔서 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Any | ||
| 1x TBST | Any | 5x solution made from 30 g Tris, 43.8 g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0 g NaN3 pH 7.5, and brought to 1 L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10x magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18 mm x 18 mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
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