Summary
Formålet med denne protokol er at beskrive en fremgangsmåde til analyse af opførsel af voksne neurale stamceller/progenitorcellerne som reaktion på kemo genetisk manipulation af en specifik lokal neurale kreds.
Abstract
Adult neurogenese er en dynamisk proces, hvorved Nyaktiverede neurale stamceller (nscs) i den subgranulerede zone (SGZ) af dentate gyrus (DG) genererer nye neuroner, som integreres i et eksisterende neurale kredsløb og bidrager til specifikke hippocampus-funktioner . Vigtigere, voksne neurogenese er meget modtagelig for miljømæssige stimuli, som giver mulighed for aktivitets afhængige regulering af forskellige kognitive funktioner. Et stort udvalg af neurale kredsløb fra forskellige hjerneområder orkestrater disse komplekse kognitive funktioner. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan specifikke neurale kredsløb regulere voksne neurogenese. Her beskriver vi en protokol til at manipulere neurale kredsløb aktivitet ved hjælp af designer receptor udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs) teknologi, der regulerer NSCs og nyfødte afkom i gnavere. Denne omfattende protokol omfatter stereotaxisk injektion af virale partikler, kemo genetisk stimulation af specifikke neurale kredsløb, thymidinanalog administration, vævs behandling, immunofluorescens mærkning, confokale Imaging og billeddannelse analyse af forskellige stadier af neurale prækursorceller. Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner om de antigen søgnings teknikker, der anvendes til at visualisere NSCs og deres afkom, og beskriver en enkel, men effektiv måde at modutere hjerne kredsløb ved hjælp af clozapin N-oxid (CNO) eller CNO-holdige drikkevand og DREADDs-udtrykker vira. Styrken af denne protokol ligger i dens tilpasningsevne til at studere en bred vifte af neurale kredsløb, der påvirker voksne neurogenese afledt af NSCs.
Introduction
Adult neurogenese er en biologisk proces, hvorved nye neuroner er født i en voksen og integreret i de eksisterende neurale netværk1. I mennesker, denne proces sker i dentate gyrus (DG) af hippocampus, hvor omkring 1.400 nye celler fødes hver dag2. Disse celler er placeret i den indre del af Generaldirektoratet, som huser en neurogene niche, betegnet subgranuleret zone (SGZ). Her gennemgår hippocampus Adult neurale stamceller (nscs) en kompleks udviklingsproces for at blive fuldt funktionelle neuroner, der bidrager til reguleringen af specifikke hjernefunktioner, herunder indlæring og hukommelse, humør regulering og stress respons3 ,4,5,6. For at påvirke adfærd, voksne NSCs er stærkt reguleret af forskellige eksterne stimuli i en aktivitet afhængig måde ved at reagere på en bred vifte af lokale og distale kemiske signaler. Disse kemiske signaler omfatter neurotransmittere og neuromodulatorer og handle i en kreds specifik måde fra forskellige hjerneområder. Vigtigere, kredsløb bred konvergens af disse kemiske signaler på NSCs giver mulighed for unik og præcis regulering af stamcelle aktivering, differentiering, og skæbne beslutninger.
En af de mest effektive måder at forhøre kredsløb regulering af voksne NSCs in vivo er ved parring immunofluorescens analyse med kredsløb brede manipulationer. Immunofluorescens analyse af voksne NSCs er en almindeligt anvendt teknik, hvor antistoffer mod specifikke molekylære markører anvendes til at indikere udviklingsstadiet af voksne NSCs. Disse markører omfatter: nestin som en radial glia celle og tidlig neurale stamfader markør, Tbr2 som en mellemliggende progenitorceller markør, og DCX som en neuroblast og umoden neuron markør7. Desuden, ved at administrere thymidinanaloner såsom brdu, CIDu, Idu, og edu, cellepopulationer undergår S fase kan være individuelt mærket og visualiseret8,9,10. Ved at kombinere disse to tilgange, kan en bred vifte af spørgsmål undersøges lige fra hvordan spredning reguleres på specifikke udviklingsmæssige stadier, til hvordan forskellige stikord påvirker NSC differentiering og Neurogenesis.
Flere muligheder findes for effektivt at manipulere neurale kredsløb, herunder elektrisk stimulation, optogenetik, og chemogenetics, hver med deres egne fordele og ulemper. Elektrisk stimulation involverer en omfattende operation, hvor elektroder implanteres til en bestemt hjerneregion, som senere bruges til at transmittere elektriske signaler til at moduere en målrettet hjerneregion. Men, denne tilgang mangler både cellulære og kredsløb specificitet. Optogenetik involverer levering af virale partikler, at indkode en lys aktiveret receptor, der stimuleres af en laser udsendes gennem en implanteret optisk fiber, men kræver omfattende manipulationer, store omkostninger, og komplekse operationer11. Chemogenetics involverer levering af virale partikler, der koder en designer receptor udelukkende aktiveret af designer drugs eller DREADDs, som efterfølgende aktiveres af en specifik og biologisk inert ligand kendt som clozapin N-oxid (CNO)12 . Fordelen ved at udnytte DREADDs til at manipulere lokale neurale kredsløb, der regulerer voksne NSCs ligger i lethed og forskellige ruter af CNO administration. Dette giver mulighed for en mindre tidskrævende tilgang med reduceret dyre håndtering, som let kan tilpasses til langtidsundersøgelser for at moduere neurale kredsløb.
Den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol er en omfattende samling af forskellige protokoller, der kræves for at kunne afhøre kredsløb regulering af voksne hippocampus Neuro Genesis, som kombinerer både immunofluorescens teknikker og kredsløb manipulationer ved hjælp af chemogenetik. Den metode, der er beskrevet i følgende protokol, er egnet til at stimulere eller hæmme et eller flere kredsløb samtidigt in vivo til at bestemme deres reguleringsfunktion på voksne neurogenese. Denne fremgangsmåde udnyttes bedst, hvis spørgsmålet ikke kræver en høj grad af tidsmæssig opløsning. Spørgsmål, der kræver præcis tidsmæssig kontrol af stimulation/hæmning på en bestemt frekvens, kan løses bedre ved hjælp af optogenetik13,14. Den fremgangsmåde, der beskrives her, er let at tilpasse til langtidsundersøgelser med minimal håndtering af dyr, især hvor stress er et stort problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Committee (IACUC) på University of North Carolina Chapel Hill.
1. stereotaxisk injektion af virale partikler
- Fastlægge de pågældende neurale kredsløb. Dette vil bestemme virus og musen linje udnyttes til følgende procedure.
Bemærk: For dette eksempel, kontralaterale Mossy celle fremskrivninger stimuleres til at analysere dens virkninger på voksne neurogenese. Virale partikler kodning AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry leveres til Generaldirektoratet for 5ht2A-CRE mus15. - Meloxicam (5 mg/kg subkutant) administreres mindst 30 min før operativt for at give forebyggende analgesi til en 8-ugers gammel mandlig heterozygot 5ht2A-CRE-mus.
- Bedøve musen ved hjælp af en 4% isofluran oxygen blanding indtil dens vejrtrækning bremser og musen er bevidstløs ved hjælp af en isofluran kammer. Toe Knib med musen for at sikre, at den ikke reagerer.
- Placer musen i stereoskatten på en lille dyre varme pad til termisk regulering og anvende øjet smøremiddel til hvert øje. Reducer isofluran til 1,5%, når dyret er inde i stereoskatten.
Bemærk: Det er vigtigt at placere ørestangen i denne fase. Sørg for, at hovedet er niveau efter ørestang placering. Mere detaljerede anvisninger findes i Geiger et al.16. - Placer hårfjerning produkt på hovedet og lad det sidde i op til 1 min maksimum. Fjern håret ved at tørre hovedet med ethanol klude. Hvis håret ikke er helt fjernet, Gentag denne proces, indtil toppen af hovedet er hårløs.
- Desinficer det hårløse område med en povidon-jod-opløsning mindst 3 gange.
- Placer aktuel lidocain opløsning på den hårløse hud i hovedet og vent 1 min. Fjern aktuel lidocain fra hovedet og lav et lille snit på hovedet fra starten af øjnene til starten af ørerne omkring 2 mm ved hjælp af en kirurgisk skalpel.
Bemærk: Tåen knivspids musen for at sikre, at det er helt bedøvede, før du foretager nogen incisioner. - Træk hovedbunden tilbage, og rengør bindevæv på toppen af hovedet ved hjælp af steriliserede vatpinde, indtil bregma er let at identificere.
- Find bregma og Juster hovedet, så bregma og lambda begge er i samme plan ved at placere boret ved begge koordinater og sikre, at de justeres. Derudover skal du justere venstre og højre halvkugle ved at placere boret til venstre/højre for en region mellem bregma og lambda.
Bemærk: Dette skridt er meget vigtigt; forkert afstemt Hovedplacering vil forstyrre stereotaxiske koordinater. - Bor ved følgende koordinater fra bregma ved hjælp af en 0,5 mm bore bit: forreste posterior akse (AP)-2,00 mm, mediale lateral akse (ml) + 1,50 mm. Lav en 0,5 mm til 1 mm i diameter borehullet.
Bemærk: Ændr dette trin med koordinater, som er specifikke for det pågældende kredsløb. Dette eksempel er rettet mod en ensidig dentate gyrus, der indeholder Mossy celler og afgør deres virkning på voksne neurale stamceller på den kontralaterale side. - Skift bore til 5 μL sprøjte og 26 − 33 G nål. Nul ved bregma og derefter indsprøjtes ved følgende koordinater ved at placere nålen i borehullet ved forreste posterior akse-2,00 mm, mediale lateral akse-1,50 mm, dorsale ventrale akse-2,3 mm.
- Infuse 500 nL af adeno-associeret virus (AAV) fra en viral kerne eller kommerciel kilde til den relevante halvkugle, ved 50 − 100 nL/min ved hjælp af en infusionspumpe (tabel over materialer). Vent mindst 5 min efter injektion, før du langsomt fjerner nålen fra hjernen.
Bemærk: Disse koordinater kan kræve justering baseret på alder og størrelse af musen. Visse virale serotyper har forskellige diffusions mønstre, det er bedst at udføre pilotforsøg for at teste viral spredning før et komplet eksperiment. - Rengør hovedbunden og huden omkring indsnit ved hjælp af saltvand, og forsegl indsnit ved hjælp af vævsklæber (tabel over materialer), mens du holder huden sammen med pincet. Udfør alle postoperative procedurer såsom overvågning under genopretning på en varmepude, indtil musen er aktiv, anvende analgetikum på såret, og administration af smertestillende medicin i to dage.
Bemærk: Mange eksperimenter kræver 2 − 4 ugers ventetid efter viral infusion for korrekt viral ekspression.
2. administration af clozapin N-oxid
- Forbered en Stock CNO-opløsning ved at opløse 10 mg CNO i 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO) og vortexing.
Bemærk: Hvis opløsningen ikke opløses helt, øge mængden af DMSO, men for meget DMSO kan gøre vandet bitter. Må ikke overstige 0,1% DMSO i CNO vand opløsning eller mere end 200 μL DMSO til en 200 mL opløsning. CNO stamopløsning kan opbevares ved-20 °C i op til to uger. - Der tilsættes 10 − 50 μL 10 mg/100 μL CNO-stamopløsning til hver 200 mL vand i en slutkoncentration på 1 − 5 mg/200 mL. Forbered CNO vand blandingen frisk hver dag.
Bemærk: Nogle grupper har suppleret op til 1% saccharin i vandet for at maskere bitterhed, hvis mus undlader at drikke. Det undersøgte kredsløb viste en anden respons baseret på aktiverings graden. Generelt er 1 mg CNO/200 mL tilstrækkeligt til at stimulere de fleste kredsløb17. - CNO-opløsningen placeres i en foliebelagt eller let beskyttet beholder, når der administreres til mus to uger efter genfinding fra stereotaxisk injektion fra trin 1,13 over en periode på 4 dage.
Bemærk: CNO er let følsom; Reducer eksponeringen for lys under hele processen. - Måle og registrere forbrugt CNO vandløsning hver dag, når du forbereder frisk CNO opløsning. I gennemsnit vil en voksen mus forbruge omkring 4 mL CNO vand blanding. Derudover optage mus vægt dagligt for at sikre, at de drikker.
- Sørg for, at der anvendes korrekt kontrol for hvert eksperiment. Medtag både en CNO-og DREADD-kontrol. Et eksempel på en eksperimentel opsætning ville omfatte: (1) køretøj + autonomt amfibiekøretøj (AAV) med viral reporter No DREADD, (2) CNO + AAV med viral reporter No DREADD, og (3) CNO + AAV DREADD.
Bemærk: Alle grupper omfatter DMSO i løsningen. DMSO-kontroller er ikke inkluderet, fordi dyrene får mindre end 0,1% DMSO, hvilket ikke har vist sig at have negative virkninger på voksne neurale stamceller hos mus. Hvis der er betænkeligheder med hensyn til DMSO-anvendelse i drikkevand, tilsættes yderligere ingen DMSO-og saltvands kontrol.
3. thymidinanalog mærkning
-
På vævs indsamlingsdagen, 4 dage efter indgivelse af CNO, etiketten prolifererende celler ved at udføre en serie af thymidinanaloge, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) intraperitoneale injektioner.
Bemærk: denne protokol bruger edu. Men, der er flere thymidinanaloner, der effektivt kan mærke prolifererende cellepopulationer herunder Brdu, Idu, og CIDu8.- Veje edu og opløses i veterinær kvalitet 0,9% natriumchloridopløsning ved 4 mg/mL ved vortexning og placering på en rotor i 15 min.
Bemærk: Thymidinanaloner er giftige og lysfølsomme. Følg materialesikkerhedsdatablade (MSDS) ved håndtering og afdækning af lys eksponering ved hjælp af aluminiumsfolie. - Edu intraperitonealt administreres ved 40 mg/kg eller 0,1 mL/10 g legemsvægt af 4 mg/mL edu-opløsningen 4 gange hver 2 h.
Bemærk: Doser over 50 mg/kg nå nær mætnings niveauer og vil ikke øge mængden af mærket prolifererende celler betydeligt18. Det er afgørende, at alle mus får den samme mængde edu-injektioner, da ukorrekt mærkning kan skævvride resultater.
- Veje edu og opløses i veterinær kvalitet 0,9% natriumchloridopløsning ved 4 mg/mL ved vortexning og placering på en rotor i 15 min.
4. klargøring og behandling af væv
- To timer efter den sidste edu injektion, bedøve musen ved hjælp af en isofluran kammer indtil vejrtrækning er signifikant reduceret og tå knivspids for at sikre, at det er helt bedøvet.
- Fastgør musen til overfladen ved hjælp af nåle og gøre et lille snit udsætter hjertet. Indsæt en 25 G nål til venstre aorta og skær højre ventrikel til transcardial perfusion med fosfat Buffered Saline (PBS) opløsning ved en strømningshastighed på 1 − 4 mL/min, indtil levervævet er ryddet.
- Skift perfusions opløsningen til 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og perfuse omkring 15 − 20 mL for at fastgøre hjernevæv.
Bemærk: Mere detaljerede anvisninger om perfusions processen kan findes i Gage et al.19. Dyr rystelser vil blive observeret, når det gøres ordentligt. - Fjern hovedet ved hjælp af et par store saks og derefter udføre en række omhyggelige incisioner at befri hjernen fra kraniet. Opbevar hjernevæv ved 4 °C i 4% PFA natten over for at fortsætte fikserings-
- Fjern hjernevæv fra 4% PFA opløsning og Placer i en 10% saccharose opløsning i PBS til cryoprotect væv i 24 h ved 4 °C. Derefter overføres vævet til en 30% saccharose PBS opløsning i yderligere 24 timer ved 4 °C før skæring.
Bemærk: Hjernevæv vil synke i saccharose, når den er klar til mikrotomskæring. Hjernevæv kan lagres på lang sigt i 30% saccharose. - Sektion hjernevæv coronally i 40 μm sektioner ved hjælp af en mikrotom. Saml sektioner begynder i starten af dentate gyrus, omkring-1,20 mm fra bregma, og slutter efter pladen er komplet med den første sektion er den mest forreste og den sidste sektion er den mest posterior. Konsultere en mus Brain Atlas til præcist at identificere Generaldirektoratet og start vævs indsamling koordinater.
- Serielt gemme hver sektion i rækker af 6 i en 48 brønd plade fyldt med frostvæske løsning (tabel 1).
| Frostvæske, opløsning | Ethylenglycol 150 mL + saccharose 150 g + fyld til 500 mL 0,1 M PB til 500 mL opløsning |
| Citrat buffer | 9 mL citronsyre bestand + 41 mL Tri-natriumcitrat buffer + 450 mL ddH2O |
| Citronsyre Stock- | [0,1 M] Citronsyre 21 g/1 L ddH2O |
| Tri-natriumcitrat Stock | [0,1 M] Tri-natriumcitrat 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris bufferet saltvand-Triton (TBS-Triton) | 0,05% 100-x Triton i TBS |
| Permeabiliserings buffer | 0,5% 100-x Triton i TBS |
| Blokerende buffer | 0,33 mL æsel serum i 10 mL TBS-Triton |
| Edu-reaktions løsning | Lav en CuSO4· 5H2o opløsning ved at tilsætte 1 mg CuSO4· 5H2o i 4 ml opløsning af [0,1 M] Tris pH 8,5. Derefter tilsættes 1:40 af en 600 μM Alexa488-Azid opløsning og 10 mg/mL L-na+ Ascorbat til CuSO4· 5H2O opløsning, før påføring på væv. |
Tabel 1: opløsninger anvendt til immun histokemi.
5. immun histokemi
- Grundlæggende flydende protokol
Bemærk: Hvis farvning nestin, springe afsnit 5,1 og gå videre til afsnit 5,2. Den grundlæggende flydende protokol er kun til Tbr2 eller doublecortin (DCX) uden thymidinanalog edu-farvning.- Overfør sektioner fra den frost løse opløsning til Tris-Buffered Saline (TBS) i seriel rækkefølge i en 48 brønd plade.
- Vask sektioner to gange i TBS-Triton (0,05% TBS-Triton, tabel 1) i 5 min ved at aspirere opløsningen hver gang, mens du ryster eller på en rocker ved langsomme hastigheder.
- Permeabilize sektioner ved hjælp af permeabilization buffer (0,5% TBS-Triton, tabel 1) for 20 − 30 min under omrystning ved langsomme hastigheder.
- Lav blokerende buffer ved at tilsætte 0,33 μL æsel serum til 10 mL TBS-Triton. Gør frisk og brug inden for 3 dage.
- Aspirér permeabiliserings buffer og Inkuber sektioner i blokerende buffer i 30 min til 1 time ved stuetemperatur (RT).
- Gør den primære antistof opløsning i blokerende buffer og tilsæt til hver brønd. 500 μL/brønd er tilstrækkelig til, at alle vævs sektioner kan nedsænkes fuldstændigt. Incubate natten over på RT på en rocker eller shaker.
- Aspirere opløsning og skylle sektioner i TBS-Triton 3x for 10 min hver for at fjerne spor af primære antistof.
- Der inkubateres i fluoroforet konjugeret sekundært antistof mod primære antistoffer fremstillet i blokerende bufferopløsning i 2 timer ved rt på en rocker.
- Vask sektioner 3x for 5 min hver i TBS-Triton og derefter inkubere sektioner i 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) opløsning (300 μM opløsning ved 1:100) fortyndet i PBS i 15 min.
- Vask sektioner 3x i PBS og montere sektioner opretholde seriel rækkefølge fra forreste til posterior på en positivt ladet slide. Lad vævet tørre ved RT, indtil fugt er synligt væk, normalt ca. 2 − 5 min, før coveret glider med monterings medier.
- Antigen hentning
Bemærk: Dette afsnit er kun påkrævet for nestin. Ved farvning af nestin, udføres dette afsnit før thymidinanalog farvning (punkt 5,3). Spring for Tbr2 eller DCX farvning med edu.- Placer vævs sektioner i PBS og monter 5 − 8 sektioner på en positivt ladet slide, der vedligeholder seriel rækkefølge fra forreste til posterior. Lad vævs sektioner tørre ved RT for helt at overholde slides, som tager ca. 2 − 5 min. væv skal være synligt fraværende af fugt.
- Forbered citratbuffer (tabel 1) i en beholder, normalt en 1.000 μl pipettespids boks.
- Varme citratbuffer i en mikrobølgeovn (1.000 W) i 5 min., indtil opløsningen koges. Mens opløsningen er opvarmning, Placer monterede sektioner i en 20-slide glas slide holder. Efter 5 minutter skal du forsigtigt placere slide holderen med sektioner i pipette boksen.
- Sæt mikrobølgeovnen strøm til 50% og kog tid til 7 min. Start en timer i 7 min og se mikrobølgeovnen. I løbet af disse 7 minutter, stop mikrobølgeovnen, når opløsningen begynder at koge og fortsætte mikrobølgeovnen efter kogning stopper.
Bemærk: Målet med dette trin er at holde vandtemperaturen lige under kogepunktet i 7 min. stop efter timeren løber ud, selv om tilberedningstid på mikrobølgeovnen ikke er færdig. Mere detaljerede anvisninger findes i Hussaini et al.20. - Tag den varme boks med citratbuffer og vævs glider ud, og anbring den i en isspand for at køle af. For at forhindre, at is eller andre materialer kommer ind i opløsningen. Vent ca. 30 min. eller indtil opløsningen er kølig at røre ved.
- Fortsæt til thymidinanalog farvning trin 5.3.2, hvis du bruger thymidinanalog.
- Thymidinanalog farvning
Bemærk: Start her, hvis farvning edu og Tbr2 eller edu og DCX.- Placer vævs sektioner i PBS og monter 5 − 8 sektioner på en positivt ladet slide, der vedligeholder seriel rækkefølge fra forreste til posterior og samme retning. Lad vævs sektioner tørre for helt at overholde slides og derefter trække en grænse ved hjælp af en hydrofobe pen eller PAP pen.
- Permeabilize sektioner med permeabiliserings buffer (0,5% TBS-Triton) i 20 − 30 minutter. Derefter vaskes sektioner 2x ved hjælp af TBS-Triton for 5 min hver.
Bemærk: Permeabilization aids intracellulære antistof penetration. Permeabiliseringstid kan justeres afhængigt af vævs tykkelse og antistof effektivitet. Alternativt kan man øge koncentrationen af vaskemiddel for at øge permeabiliseringstyrken. Der bør dog udvises forsigtighed for ikke at permeabilize alt for længe, da vævs skrøbelighed øges med forlænget permeabiliseringstid. - Forbered edu-reaktions opløsningen i henhold til tabel 1. Den endelige koncentration af Alexa488-Azid er 15 μM i 1 mL edu-reaktions opløsning.
- Inkuber sektioner i edu-reaktions opløsning i 30 min til 1 time og vask derefter 3x i TBS-Triton i 5 min. hver. Cover slides i aluminiumsfolie for at beskytte mod lys efter dette trin. På dette stadium kontrollere, om edu reaktion virker ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. Edu-mærkede celler vil fluorescerer under et epifluorescens mikroskop.
- Monteret vævs afsnit protokol
- Bloker vævs sektioner monteret på et dias fra trin 5.3.4 ved hjælp af blokerende buffer, der er rejst i de samme dyr som det sekundære antistof, fx æsel serum, i 30 min til 1 time og vask derefter 2x i TBS-Triton i 5 min. hver.
- Forbered primært antistof (dvs. kylling anti-nestin) opløsning under blokerings trinnet ved at blande primære antistoffer i blokerende bufferopløsning ved 1:200. 250 μL pr. slide er tilstrækkelig til at sikre, at vævet er helt nedsænket i opløsningen.
- Incubate vævs sektioner i en primær antistof opløsning natten over ved RT efter blokering af vaske. Ændre dette trin afhængigt af det primære antistof, der anvendes.
Bemærk: Hvis antistoffer har høj baggrunds-eller ikke-specifik binding, kan inkuberet ved 4 °C i stedet for RT forbedre resultaterne. Antistoffer med dårlig vævspenetration kan overlades til at inkubere i 2 dage, hvis det er nødvendigt. - Incubate vævs sektioner 3x i TBS-Triton i 5 min for at fjerne overskydende primære antistof. Derefter inkubateres vævs sektioner i fluoroforet konjugerede sekundære antistoffer (dvs. Alexa 647 anti-kylling ved 1:200), som er fremstillet i blokerende bufferopløsning i 2 timer ved rt.
- Inkuber vævs sektioner 3x i TBS-Triton i 5 minutter for at fjerne overskydende sekundært antistof og anvende 300 μM DAPI-opløsning ved 1:100 i PBS i 15 minutter ved RT.
- Incubate vævs sektioner 3x i PBS i 5 min at fjerne overskydende DAPI og fjerne pap pen cirkel fra omkring væv ved hjælp af en vatpind eller en delikat opgave tørre. Lad sektioner tørre og derefter anvende monterings medier og Cover slip. Lad monterings mediet tørre før billedbehandlings slides.
6. billedsamling
- Blind eksperimentelle grupper fra kontrolgrupper ved at dække slide etiketter og billede den samme side af DG ved hjælp af en confokal mikroskop (tabel over materialer) med 40x olie forstørrelse optisk linse ved 1 μm trin størrelse eller en 20x 2x zoom ved 1 μm.
Bemærk: 40x olie forstørrelse vil give øget opløsning, men tager længere tid end 20x 2x zoom. - Sæt objektiv linse til 40x og derefter klikke på Find fanebladet i øverste venstre hjørne i konfokale software (tabel over materialer) og indstille den ønskede GD sektion i midten af synsfeltet.
- Find DG, Skift til fanen anskaffelse i øverste venstre hjørne, og Markér følgende felter: Z-stack, Tile-Scanog position.
- Indstil Kanalindstillinger mellem 600 − 750 Gain, 1% − 15% laser intensitet og 1 − 10 offset. Må ikke overskride 20% laser intensitet for nogen af kanalerne. Sørg for, at ingen pixels er overmættede, når du indstiller forstærkning og intensitet.
Bemærk: Disse intervaller vil variere afhængigt af effektiviteten af det anvendte udstyr og farvning effektivitet. - Indstil fliserne til 7 vandret ved 3 lodret i vinduet flise scanning, og tryk på Scan oversigt billede med de samme indstillinger som dem, der bruges i øjeblikket. For eksempel, brug 7 vandret ved 3 lodret og 20x mål med 2x zoom.
- Sørg for, at Generaldirektoratet er helt inden for det forventede billede efter oversigts scanning. Hvis ikke, skal du justere visningen af Generaldirektoratet, indtil det er helt i oversigten billede, da dette er et repræsentativt billede, at man vil opnå.
- Indstil billedbehandlings dybden ved at rulle gennem forskellige Z-stakke med fine Focus-knappen. Sikre, at hele Generaldirektoratet er inden for start-og slutpunkterne. Hvis du antager en trin størrelse på 1 μm, skal hvert billede være ca. 40 trin.
- Indstil scanningshastigheden til 9 med tovejs scanning og ingen gennemsnit i vinduet anskaffelses tilstand. Tilføj derefter position i positions vinduet.
Bemærk: Gentag trin 6.3 − 6.8 for at afbilde flere GD'er på én gang. Forøgelse af scanningshastigheden sænker billedkvaliteten, men reducerer den samlede billedbehandlings periode. Hvis billedkvaliteten er for lav, så Reducer scanningshastigheden eller Forøg gennemsnittet. - Klik på knappen Start eksperiment , når du er klar. Scan 5 sektioner af DG per mus langs den forreste til posterior akse. For eksempel, hvis det venstre GD er afbildet for sektion et, billede det næste mest posterior venstre GD for sektion to.
- Sy separate billeder sammen for at danne et komplet billede af dentate gyrus ved hjælp af sting funktionen under fanen proces i konfokale-softwaren. Alternativt kan du bruge FIJI (ImageJ) til at sy billeder sammen for at danne en komplet dentate gyrus.
- Gem syede billeder til kvantificering.
7. billedanalyse
- Åbn hvert billede af hver dentate gyrus sektion ved hjælp af FIJI som både en maksimal projektion og som et sammensat billede med kanalerne fusioneret i forskellige farver for nemt at visualisere samlokalisering.
- Mål området for DG for hver sektion af det maksimale projicerings billede ved hjælp af polygon markeringsværktøjet (tredje boks fra venstre) og Optag for hver sektion af hver mus. Dette vil være det GD-område, der anvendes til at beregne tætheden.
- Optag antallet af celler i DG fra det sammensatte billede, der har colocalizing primære antistof (dvs. nestin) og thymidin analog edu, ved hjælp af Fiji plugin Cell Counter fundet under plugins | Analysér | celle tæller | celle tæller. Derudover, registrere det samlede antal edu positive og nestin positive celler med en radial proces.
Bemærk: I tilfælde af nestin, er det meget vigtigt at være opmærksom på morfologi. Ved kvantificering af neurale stamceller, sikres det, at kun celler med en radial proces kvantificeres. Når du kvantificerer dentate gyrus sektioner, skal du anvende de samme kriterier for alle, især når du visualiserer celler uden for et brændfly. Hvis cellerne ikke er inden for brændplanet, skal du ikke tælle dem. Se venligst West et al.21 for mere detaljerede anvisninger om stereologisk kvantificering. - Angiv celle optællinger i et regnearksprogram for at kompilere alle dataelementer til analyse senere.
- Beregn tætheden af colokaliserede celler for hver sektion ved at dividere det samlede antal samlokaliserede celler med det samlede volumen for hver sektion i hvert dyr. F. eks. opnå stamcelle tæthed ved at dividere summen af nestin +/edu + celler i ét dyr med summen af Generaldirektoratet for volumen i ét dyr. Beregn lydstyrken for hver sektion ved at multiplicere området med de samlede intervaller i Z-trin, forudsat at hvert trin er 1 μm.
Bemærk: I denne protokol skal de samlede trin være tæt på 40, da vævet er opdelt i 40 μm. Sørg for, at hvert dyr er et datapunkt, da målet med denne tilgang er at anslå den samlede mængde af colokaliserede celler i en halvkugle i en hippocampus. - Foretag yderligere nødvendige beregninger for det spørgsmål, man forsøger at løse. I dette eksempel beregnes det samlede antal prolifererende celler, den samlede stamcelle population og procent af prolifererende stamceller efter stimulering af kontralaterale Mossy-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de eksperimentelle procedurer beskrevet ovenfor (figur 1a,B), vi var i stand til at bestemme virkningerne af stimulerende kontralaterale Mossy celle fremskrivninger på den neurogene niche i hippocampus. Ved at udnytte en CRE-afhængig GQ-koblet stimulerende DREADD virus parret med en Mossy celle mærkning 5-HT2A CRE-line, vi var i stand til selektivt at aktivere excitatoriske fremskrivninger fra Mossy celler på den kontralaterale GD og fast besluttet på, at stærk Mossy celle stimulering fremmede stamcelle-inaktive (figur 1c). Vi kontrollerede nøjagtig viral levering før analyse af væv (figur 2a, B). Desuden, vi verificeret aktivering af Mossy celler via c-FOS Immunohistokemi eksperimenter (data ikke vist). I tilfælde af ukorrekt viral injektion, udelukke dyr fra yderligere analyse. En forkert injektion er en, der undlader at målrette de ønskede koordinater, har det meste af udtrykket uden for den ønskede region, eller har lidt at ingen viral levering. For dette eksperiment, Mossy celler i Hilus af Generaldirektoratet var den tilsigtede mål, og hvis injektioner var uden for Hilus, de blev udelukket. Ved at bruge en thymidinanalog, edu og antigen-hentning til nestin-farvning beskrevet i punkt 5,2 og 5,3 kunne vi med succes mærke prolifererende neurale stamceller (figur 3a). Desuden, ved at udelade antigen hentning trin, afsnit 5,2, vi var i stand til at mærke Tbr2 positiv neurale stamfader og neuroblast, og DCX positive neuroblast og umodne neuroner (figur 3a). Vi viser et eksempel på området kvantificeret og bruges til at beregne tæthed og give et eksempel på monteret væv på et dias (figur 3B og figur 4a). Desuden er både vellykkede og subpar eksperimenter tilvejebragt som referencer for eksperimentelle tilgange (figur 4b). Endelig er der flere forskellige kvantifikationer, der kan opnås ved et vellykket eksperiment (figur 5a-D)15. Kvantifikationerne omfatter tætheden af prolifererende neurale stamceller (Nestin +/edu +/Volume), procentdelen af prolifererende neurale stamceller (Nestin +/edu +/total nestin), samlede prolifererende celler (edu +/Volume) og total stamcelle pulje (Nestin +/Volume ). Ved kontralateral stimulering af en Mossy celler blev der observeret et fald i neurale stamcelle proliferation. Tilsvarende kvantifikationer kan opnås for neurale stamceller og umodne neuroner ved hjælp af passende antistof.
Figur 1: eksperimentel tilgang til analyse kreds regulering af voksne neurale stamceller. A) skematisk repræsenterende de forskellige trin, der er skitseret i protokollen. B) tidslinje for eksperimentel tilgang, der anvendes til at stimulere Mossy celler i gnavere. (C) sprøjte skematisk rettet mod kontralaterale Mossy celler til stimulation. D) skematisk udviklingslinje for voksne neurale stamceller i den subgranulerede zone (SGZ), granuleret cellelag (GCL) og molekyl lag (ml) med tilsvarende antistoffer, der anvendes i forskellige udviklingsstadier. De forskellige udviklingsstadier omfatter enten latent eller aktiverede radiale neurale stamceller (NSC), neurale progenitorer (NP), neuroblast (NB), umodne granulet celler (GC) og moden GC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: påvisning af effektiv viral levering. A) immunofluorescens billeder af nøjagtig viral levering. Virale partikler udtrykker en mCherry fluorescerende etiket, der målretter Mossy celler i Hilus (hvid boxed region). DAPI-etiketter cellekerner. Billedsiden af nøjagtig viral levering demonstrerer klare Mossy fiber fremskrivninger fra den kontralaterale injektion side. B) immunofluorescens billeder af off Target viral injektioner. Bemærk, at i dette tilfælde kontralaterale Mossy fibre er fraværende i billedet side. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af prolifererende neurale stamceller og afkom. A) immunhistokemisk billeder af thymidinanalog edu,dercolocaliserer med specifikke celle trin markører nestin (neurale stamceller og progenitorer), Tbr2 (neurale stamceller, neurale progenitorer) og DCX (neuroblast, umodne neuroner) indikeret af hvide pilespidser. Scale bar = 10 μm.B) repræsentativ måling af arealet inden for dentatgyrus, der anvendes til at beregne tæthed. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: påvisning af immunofluorescens præparat. A) skematisk påvisning af stereologisk adskillelse af monterede vævs sektioner fra forreste til posterior akse. Den røde boks angiver den side, som er imaged. B) påvisning af vellykkede og sub-par immunofluorescens eksperimenter for neuronal Lineage markører. Scale bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kontralateral aktivering af Mossy celler nedsætter neurale stamcelle proliferation. A) de Immunhistokemi-Kvantifikationer af nestin +/edu +-celler i dentatgyrus viser et fald i spredningen efter stimulering af kontralaterale Mossy-celler. (B) fald i procent af prolifererende neurale stamceller i gruppen med aktiverede kontralaterale Mossy celler. C) der var ingen signifikant ændring i den neurale stamcelle tæthed i begge grupper. D) der var ingen ændring i det samlede indhold af prolifererende celler i dentatgyrus. Værdier repræsenterer betyder ± standardfejl i målingen. p < 0,05 (n = 3 for kontrol, n = 5 for hM3D gruppen). Dette tal er blevet tilpasset fra Yeh et al.15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne protokol er at vurdere, hvordan manipulerende specifikke neurale kredsløb regulerer voksen hippocampus Neuro Genesis in vivo ved hjælp af en række Immunhistokemi teknikker. Assaying aktivitet afhængig regulering af voksne neurogenese medieret af specifikke neurale kredsløb er en værdifuld teknik med stort potentiale for ændringer for at studere en bred vifte af neurale kredsløb. Succesen med disse typer eksperimenter afhænger af flere faktorer, herunder nøjagtig viral levering, korrekt viral udvælgelse til den ønskede manipulation, korrekt levering af en thymidinanalog, dyre alder, immun farvning effektivitet, vellykket transcardial perfusioner, og objektiv kvantificering af billeder. For eksempel, unøjagtige viral levering kan forårsage off Target effekter, der resulterer i en fænotype uden forbindelse med det pågældende kredsløb. Desuden, lav kvalitet immunofluorescens teknikker kan skjule det sande antal af nuværende celler og derfor producere en fænotype, der ikke er biologisk relevant. En anden meget vigtig faktor til kontrol er musens alder, når der udføres eksperimenter, i betragtning af at voksne neurogenese er aldersafhængig22. Endelig er det vigtigt, at hver sektion er unbiasedly scoret. For at reducere bias, tage en metodisk tilgang og sikre, at den person, scoring er dygtige til at identificere de stadier af voksne NSC udvikling ved hjælp af morfologiske oplysninger. Derudover blinde både kontrol og behandling grupper og afsløre deres identiteter efter billed kvantifikationer. Som en yderligere foranstaltning til at reducere bias, to separate individer kan kvantificere det samme datasæt til at validere observerede resultater.
Der er flere begrænsninger forbundet med denne tilgang til studiet kredsløb aktivitet afhængige regulering af voksne NSCs og nyfødte afkom. Den første begrænsning er, at denne fremgangsmåde ikke giver oplysninger om de specifikke celletyper inden for et kredsløb, der formidler den samlede effekt på NSCs fra manipulation af kredsløbet i spørgsmålet. Det betyder, at selv om der kan være en fænotypisk effekt på voksne NSCs, kan effekten optræde gennem en eller flere mellemliggende celletyper. En effektiv måde at løse dette problem på er ved at parre disse studier med Elektrofysiologi for at fastgøre formidlerne. En yderligere begrænsning af denne protokol er behovet for at have enten en specifik CRE Mouse (5-HTR2A) linje eller en viral konstruktion (AAV5-camKII-hM3d-mcherry), der kan målrette det ønskede kredsløb. Hvis en effektiv celle specifikke CRE muse linje ikke er let tilgængelige for et spørgsmål af interesse, evnen til at studere dette kredsløb bliver stadig vanskeligere. Men, mange celletyper i hjernen har CRE specifikke muse linjer. En mindre begrænsning af denne protokol er relateret til CNO som en effektiv inert ligand. For nylig, undersøgelser viste, at CNO, det inaktive kemikalie, der anvendes til at aktivere DREADDs, metabolizes til clozapin, som kan forårsage adfærdsmæssige fænotyper23. En effektiv måde at tage fat på er imidlertid at inkludere passende kontrol i hvert eksperiment. Et eksempel på korrekt kontrol omfatter både en CNO-og DREADD-kontrol, hvor CNO administreres i kombination med en Control reporter-virus (AAV5-DIO-mCherry), og en saltvandsopløsning, hvor der ikke administreres CNO til en reporter-virus gruppe. Ved at medtage disse kontroller kan virkningerne af kun CNO isoleres. Alternativt, en sekundær inert ligand kendt som C21, er for nylig blevet påvist at have lignende effekt og potens uden påvist adfærdsmæssige virkninger24. Endelig er en endelig begrænsning af denne protokol bestemmende for den mængde CNO, som hvert dyr forbruger under forsøget. Forskellige dyr drikker CNO-holdige vand i varierende grad og kan derfor have en række virkninger på voksne neurogenese. Generelt en mus tendens til at drikke omkring 4 mL CNO vand i en 24 h periode. Dette betyder, at i koncentrationen af 1 mg/200 mL dyr får i alt 0,02 mg CNO pr. dag, hvilket er sammenligneligt med mængden af en enkelt CNO dosis injiceres intraperitonealt. Hvis rettidig koblet administration af CNO er et problem, kan Skift til intraperitoneale injektioner være et bedre alternativ.
Fordelen ved at bruge denne protokol er graden af specificitet opnås, når moduere voksne neurogenese. Tidligere Neuro Genesis undersøgelser har udnyttet systemisk administreret farmakologisk agonist eller antagonist til at moduere kredsløbskomponenter. Disse ikke-specifikke manipulationer kan producere fænotypiske forskelle, men giver lidt indsigt om mekanismer, der er involveret i voksne neurale stamceller forordning. Derudover, denne protokol kan nemt ændres til at undersøge forskellige kredsløb bred effekt på voksne neurogenese. For eksempel, ved at skifte til en hæmmende DREADD, eller ved at målrette en eller flere hjerneregioner på én gang, kan man stille en række spørgsmål for at forstå kredsløb specifik regulering af voksne Neurogenesis. En anden fordel ved at bruge denne protokol over tidligere tilgange er, at brugen af et nestin antistof eliminerer transgene animalsk avl af fluorescently kodede neurale stamceller journalister såsom nestin: GFP, øge effektiviteten og reducere tiden pr eksperiment8. Desuden begrænser denne teknik gnaver håndtering ved administration af CNO, hvilket mindsker stress i gnavere under eksperimenter. Det er vigtigt at afbøde stress, når man studerer stress-følsomme processer. Endelig er denne fremgangsmåde let kan ændres til at omfatte en adfærdsmæssig analyse, for eksempel, hvis man var interesseret i at spørge, om den kontralaterale Mossy celle kredsløb, der modulerer NSCs også spiller en rolle i rumlig læring eller stress modstandsdygtighed.
De vigtigste tekniske vanskeligheder, når du bruger denne fremgangsmåde er nøjagtig viral levering. At blive en dygtig gnaver kirurg tager praksis og kan tage betydelig fejlfinding. Det er derfor tilrådeligt at udføre en række pilotforsøg for at teste viral titer, mærkning effektivitet, og viral spredning. Vi har konstateret, at visse serotyper har forskellige spredningsmønstre, og at AAV2-serotypen spredes mindre end AAV5 eller AAV8. Derudover er det bedst at have en betroet viral emballage udbyder for hver af disse eksperimenter. Ved at udføre pilot operationer, kan mange af disse bekymringer løses, og man kan spare tid. Det anbefales også, at en test forskellige CNO koncentrationer til at stimulere eller hæmme de ønskede kredsløb. Generelt vil 1 mg/kg i tilstrækkelig grad aktivere testede kredsløb, men visse celletyper kan kræve mere eller mindre CNO. Det er vigtigt at bemærke, at dosis af CNO administration kan differentielt påvirke visse kredsløb specifikt når man ser på noget som Mossy celler15.
Alternative anvendelser af denne protokol omfatter samtidige adfærdsmæssige test, graduering af alternative kredsløb, og yderligere analyse af neurogenese funktioner. For at udføre adfærdsmæssige tests, kan man følge den beskrevne protokol og efter administration af CNO, udføre en bestemt adfærdsmæssige opgave, såsom en roman location assay, eller en rumlig navigation opgave. Fordelen ved denne tilgang er, at et enkelt eksperiment ville give både adfærdsmæssige og kredsløb specifikke oplysninger, der kan føre til en kredsløb specifik adfærdsmæssige fænotype. At moduere alternative kredsløb, kan man bruge en kombination af forskellige CRE linjer og virale vektorer. For eksempel, hvis man var interesseret i at forstå, hvordan inhiberende dopaminerge neuroner fra ventrale tegmentale område (VTA) eller VTA modulerer voksne Neurogenesis, man kunne bruge en tyrosin hydroxylase CRE muse linje og injicere en CRE afhængige hM4D (inhiberende) DREADD virus i til VTA at bestemme dopaminerge specifik regulering af voksne Neurogenesis. Mulighederne for at målrette mod alternative hjerneområder ved hjælp af denne tilgang er enorme og kan strategisk bruges til at forhale overbevisende neurale kredsløb. Endelig, denne fremgangsmåde gør det muligt for en at undersøge yderligere stadier af voksne Neurogenesis. Hvis for eksempel man ønskede at forstå, hvordan stimulerende Mossy celler påvirker arborization eller dendritiske længde af umodne neuroner, man ville følge en lignende protokol, men udføre alternative analyser såsom sholl analyse.
Sammenfattende, denne protokol giver en detaljeret trin-for-trin proces til analyse kredsløb aktivitet afhængige regulering af voksne NSCs og Neuro Genesis via DREADD teknologi. Styrken af denne protokol ligger i dens evne til at blive let modificeret til at løse en bred vifte af spørgsmål vedrørende kredsløb specifikke voksne neurale stamceller regulering. Med udviklingen af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser (crispr) teknologi, er det nu lettere at generere celle specifikke CRE muse linjer til at parre med sofistikerede virale konstruktioner til at løse stadig mere komplekse spørgsmål at udvide anvendelsen af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
L.J.Q. blev støttet af National Institute of Mental Health af National Institutes of Health under Diversity supplement R01MH111773 samt en T32 uddannelse Grant T32NS007431-20. Dette projekt blev støttet af tilskud tildelt J.S. fra NIH (MH111773, AG058160 og NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
