Summary
O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.
Abstract
A neurogênese adulta é um processo dinâmico pelo qual as células-tronco neurais recém-ativadas (NSCS) na zona zona (SGZ) do giro dentado (DG) geram novos neurônios, que se integram em um circuito neural existente e contribuem para funções hipocampais específicas . É importante ressaltar que a neurogênese adulta é altamente suscetível a estímulos ambientais, o que permite a regulação dependente da atividade de várias funções cognitivas. Uma vasta gama de circuitos neurais de várias regiões do cérebro orquestrates estas funções cognitivas complexas. Portanto, é importante entender como os circuitos neurais específicos regulam a neurogênese adulta. Aqui, nós descrevemos um protocolo para manipular a atividade do circuito neural usando o receptor do desenhador ativado exclusivamente pela tecnologia das drogas do desenhador (dreadds) que regula NSCS e o progênie recém-nascido nos roedores. Este protocolo detalhado inclui a injeção Stereotaxic de partículas virais, a estimulação chemogenetic de circuitos neural específicos, a administração análoga do timidina, o processamento do tecido, a rotulagem da imunofluorescência, a imagem latente confocal, e a imagem latente análise de vários estágios de células precursoras neurais. Este protocolo fornece instruções detalhadas sobre técnicas da recuperação do antígeno usadas para visualizar NSCS e seus progênie e descreve uma maneira simples, contudo eficaz de modular circuitos do cérebro usando o N-óxido do Clozapine (CNO) ou CNO-que contem a água bebendo e Vírus que expressam DREADDs. A força deste protocolo reside na sua adaptabilidade para estudar uma gama diversificada de circuitos neurais que influenciam a neurogênese adulta derivada de NSCs.
Introduction
A neurogênese adulta é um processo biológico pelo qual novos neurônios nascem em um adulto e integrados nas redes neurais existentes1. Nos seres humanos, este processo ocorre no giro dentado (DG) do hipocampo, onde cerca de 1.400 novas células nascem a cada dia2. Estas células residem na parte interna da DG, que abriga um nicho neurogênico, denominado zona zona (SGZ). Aqui, células-tronco neurais adultas hipocampais (NSCs) passam por um processo complexo de desenvolvimento para se tornarem neurônios totalmente funcionais que contribuem para a regulação de funções cerebrais específicas, incluindo aprendizagem e memória, regulação do humor e resposta ao estresse3 ,4,5,6. Para influenciar comportamentos, os NSCs adultos são altamente regulados por vários estímulos externos de uma forma dependente da atividade, respondendo a uma variedade de pistas químicas locais e distais. Estas pistas químicas incluem neurotransmissores e Neuromoduladores e atuam em um circuito de maneira específica de várias regiões cerebrais. Importante, a convergência de circuito largo destes sinais químicos em NSCs permite o regulamento original e preciso da ativação, da diferenciação, e das decisões do Fate da pilha de haste.
Uma das maneiras mais eficazes de interrogar a regulação do circuito de NSCs adultos in vivo é através da análise de imunofluorescência de emparelhamento com manipulações de circuito largo. A análise da imunofluorescência de NSCs adultos é uma técnica comumente utilizada, onde os anticorpos contra marcadores moleculares específicos são usados para indicar o estágio de desenvolvimento de NSCs adultos. Estes marcadores incluem: Nestin como uma pilha radial do glia e um marcador neural adiantado do progenitor, Tbr2 como um marcador intermediário do progenitor, e DCX como um marcador do neuroblast e do neurônio imaturo7. Adicionalmente, através da administração de análogos da timidina como BrdU, Cidu, IDU e edu, as populações de células submetidas à fase S podem ser rotuladas individualmente e visualizadas8,9,10. Combinando essas duas abordagens, uma ampla gama de perguntas pode ser investigada, variando de como a proliferação é regulada em estágios específicos de desenvolvimento, a forma como várias pistas afetam a diferenciação de NSC e a neurogênese.
Existem várias opções para manipular eficazmente os circuitos neurais, incluindo a estimulação elétrica, optogenética e quimiogenética, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. A estimulação elétrica envolve uma cirurgia extensiva onde os elétrodos estão implantados a uma região específica do cérebro que sejam usadas mais tarde para transmitir sinais elétricos para modular uma região alvejada do cérebro. No entanto, esta abordagem carece de especificidade celular e de circuito. A optogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor ativado por luz que é estimulado por um laser emitido através de uma fibra óptica implantada, mas requer manipulações extensas, grande custo e cirurgias complexas11. A quimiogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor de designer ativado exclusivamente por drogas de grife ou DREADDs, que são subsequentemente ativados por um ligador específico e biologicamente inerte conhecido como N-óxido de clozapina (CNO)12 . A vantagem de utilizar DREADDs para manipular circuitos neurais locais que regulam NSCs adultos reside na facilidade e várias rotas de administração CNO. Isto permite uma aproximação menos demorada com manipulação animal reduzida, que é facilmente adaptável para estudos a longo prazo para modular circuitos neural.
A aproximação descrita neste protocolo é uma coleção detalhada de vários protocolos exigidos para interrogar com sucesso a regulação do circuito da neurogênese hippocampal adulta que combina técnicas da imunofluorescência e manipulações do circuito usando a quimiogenética. O método descrito no seguinte protocolo é apropriado para estimular ou inibir um ou vários circuitos simultaneamente in vivo para determinar sua função reguladora na neurogênese adulta. Essa abordagem é melhor usada se a pergunta não precisar de um alto grau de resolução temporal. As perguntas que exigem o controle temporal preciso da estimulação/inibição em uma determinada freqüência, podem melhor ser endereçadas usando o optogenetics13,14. A aproximação descrita aqui é adaptada facilmente para estudos a longo prazo com manipulação animal mínima especial onde o stress é uma preocupação principal.
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Protocol
Todos os procedimentos, incluindo os sujeitos animais, foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de North Carolina Chapel Hill.
1. injeção Stereotaxic de partículas virais
- Determine os circuitos neurais em questão. Isso determinará o vírus e a linha do mouse utilizadas para o procedimento a seguir.
Nota: Para este exemplo, as projeções Mossy contralaterais da pilha são estimuladas para analisar seus efeitos na neurogênese adulta. As partículas virais que codificam AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry são entregadas ao DG de camundongos15de 5ht2A-CRE. - Administre o Meloxicam (5 mgs/quilograma, subcutaneously) pelo menos 30 minutos pre-operatively para fornecer a analgesia Pre-emptive a um rato heterozygous masculino do 5ht2A-CRE 8 week-old.
- Anestesie o mouse usando uma mistura de oxigênio isoflurano 4% até que sua respiração diminui e o mouse está inconsciente usando uma câmara de isoflurano. Toe apertar o mouse para garantir que ele não é responsivo.
- Coloc o rato no stereotax em uma almofada de aquecimento animal pequena para a regulação térmica e aplique o lubrificante do olho a cada olho. Reduza o isoflurano para 1,5% uma vez que o animal está dentro do estereoimposto.
Nota: A colocação da barra da orelha durante este estágio é importante. Assegure que a cabeça esteja nivelada após a colocação da barra da orelha. Instruções mais detalhadas podem ser encontradas em Geiger et al.16. - Coloc o produto da remoção do cabelo na cabeça e deixe-o sentar-se para até 1 minuto máximo. Retire o cabelo limpando a cabeça com toalhetes de etanol. Se o cabelo não é completamente removido, repita este processo até o topo da cabeça é sem pêlos.
- Desinfete a área sem pêlos com uma solução de iodo-povidona pelo menos 3 vezes.
- Coloque a solução tópica de lidocaína na pele sem pêlos da cabeça e aguarde 1 min. Remova a lidocaína tópica da cabeça e faça uma pequena incisão na cabeça desde o início dos olhos até o início das orelhas cerca de 2 mm usando um bisturi cirúrgico.
Nota: Toe apertar o mouse para garantir que ele está completamente sedado antes de fazer quaisquer incisões. - Retrair o couro cabeludo e limpe o tecido conjuntivo na parte superior da cabeça usando cotonetes de algodão esterilizados até que a Bregma seja facilmente identificável.
- Localize a Bregma e ajuste a cabeça para que a Bregma e lambda estejam no mesmo plano colocando a broca em ambas as coordenadas e assegurando que elas se alinham. Além disso, alinhe o hemisfério esquerdo e direito colocando a broca à esquerda/direita de uma região entre a Bregma e a lambda.
Nota: Esta etapa é muito importante; a colocação da cabeça alinhada incorretamente interromperá coordenadas Stereotaxic. - Perfure as seguintes coordenadas de Bregma usando uma broca de 0,5 mm: eixo posterior anterior (AP)-2, 0 mm, eixo lateral medial (ML) + 1,50 mm. faça um furo de perfuração de 0,5 mm a 1 mm de diâmetro.
Nota: Modifique esta etapa com coordenadas específicas para o circuito em questão. Este exemplo segmenta um giro dentate unilateral que contem pilhas Mossy e determina seu efeito em pilhas de haste neural adultas no lado contralateral. - Faça a broca para a seringa de 5 μL e a agulha 26 − 33 G. Zero em Bregma e, em seguida, injetar nas seguintes coordenadas, colocando a agulha no orifício de perfuração no eixo posterior anterior-2, 0 mm, eixo lateral medial-1,50 mm, eixo ventral dorsal-2,3 mm.
- Infuse 500 nL do vírus adeno-associado (AAV) de um núcleo viral ou de uma fonte comercial ao hemisfério apropriado, em 50 − 100 nL/min usando uma bomba da infusão (tabela dos materiais). Aguarde pelo menos 5 min após a injecção antes de remover lentamente a agulha do cérebro.
Nota: Essas coordenadas podem exigir ajuste com base na idade e tamanho do mouse. Certos sorotipos virais têm diferentes padrões de difusão, é melhor realizar experimentos piloto para testar a propagação viral antes de um experimento completo. - Limpe o couro cabeludo e a pele ao redor da incisão usando solução salina, depois Sele a incisão usando adesivo tecidual (tabela de materiais) enquanto mantém a pele unida com uma pinça. Execute todos os procedimentos post-operative tais como a monitoração durante a recuperação em uma almofada de aquecimento até que o rato esteja ativo, aplicando o analgésico na ferida, e administrando analgésicos por dois dias.
Nota: Muitas experiências exigem o tempo de espera de 2 − 4 semanas após a infusão viral para a expressão viral apropriada.
2. administração de N-óxido de clozapina
- Prepare uma solução de CNO de ações dissolvendo 10 mg de CNO em 100 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) e vortexing.
Nota: Se a solução não se dissolver completamente, aumente o volume de DMSO, mas muito DMSO pode fazer a água amarga. Não exceda 0,1% DMSO na solução de água CNO ou mais de 200 μL de DMSO para uma solução de 200 mL. A solução conservada em estoque de CNO pode ser armazenada em-20 ° c por até duas semanas. - Adicionar 10 − 50 μL de 10 mg/100 μL de solução de CNO para cada 200 mL de água para uma concentração final de 1 − 5 mg/200 mL. Prepare a mistura de água CNO fresca todos os dias.
Nota: Alguns grupos suplementaram até 1% de sacina na água para mascarar a amargura se os camundongos se abstenção de beber. O circuito investigado mostrou uma resposta diferente com base na extensão da ativação. Em geral, 1 mg de CNO/200 mL é suficiente para estimular a maioria dos circuitos17. - Coloc a solução de CNO em um recipiente coberto ou claro protegido da folha ao administrar aos ratos duas semanas após a recuperação da injeção Stereotaxic da etapa 1,13 durante um período de 4 dias.
Nota: CNO é sensível à luz; reduzir a exposição à luz durante todo o processo. - Meça e registre a solução de água CNO consumida todos os dias ao preparar uma solução de CNO fresca. Em média, um rato adulto consumirá cerca de 4 mL de mistura de água CNO. Além disso, registre o peso do mouse diariamente para garantir que eles estão bebendo.
- Assegure-se de que os controles apropriados sejam utilizados para cada experimento. Inclua um controle CNO e DREADD. Um exemplo de uma instalação experimental incluiria: (1) veículo + veículo anfíbio autônomo (AAV) com o repórter viral nenhum DREADD, (2) CNO + AAV com repórter viral nenhum DREADD, e (3) CNO + AAV DREADD.
Nota: Todos os grupos incluem DMSO na solução. Os controles DMSO não estão incluídos porque os animais estão recebendo menos de 0,1% DMSO, que não demonstrou ter efeitos adversos em células-tronco neurais adultas em camundongos. Se há umas preocupações a respeito do uso do DMSO na água bebendo, adicione um adicional nenhum DMSO e controle fisiológico.
3. thymidine rotulagem analógica
-
No dia da coleção do tecido, 4 dias após ter administrado CNO, pilhas proliferating da etiqueta realizando uma série de injeções intraperitoneal do Analog de timidina, 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (edu).
Nota: este protocolo utiliza edu. No entanto, existem vários análogos da timidina que podem eficientemente rotular populações de células proliferantes, incluindo BrdU, IDU e Cidu8.- Pesar edu e dissolver em veterinário grau 0,9% solução de injeção de cloreto de sódio em 4 mg/mL por vortexing e colocação em um rotor por 15 min.
Nota: Os análogos da timidina são tóxicos e sensíveis à luz. Siga as fichas de dados de segurança do material (MSDS) ao manusear e cobrir a solução da exposição à luz usando folha de alumínio. - Administrar edu intraperitonealmente a 40 mg/kg ou 0,1 mL/10 g de peso corporal da solução de 4 mg/mL edu 4 vezes a cada 2 h.
Nota: Doses acima de 50 mg/kg atingem níveis de saturação próximos e não aumentarão significativamente a quantidade de células proliferantes rotuladas18. É crucial que todos os ratos recebam a mesma quantidade de injeções de edu, uma vez que a rotulagem inadequada pode distorcer os resultados.
- Pesar edu e dissolver em veterinário grau 0,9% solução de injeção de cloreto de sódio em 4 mg/mL por vortexing e colocação em um rotor por 15 min.
4. preparação e processamento de tecidos
- Duas horas após a última injeção de edu, anestesiar o mouse usando uma câmara de isoflurano até que a respiração é significativamente reduzida e pinça do dedo do pé para garantir que ele está completamente sedado.
- Fixe o rato à superfície usando agulhas e faça uma pequena incisão expondo o coração. Insira uma agulha de 25 G na aorta esquerda e corte o ventrículo direito para perfusão perfusão com solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma vazão de 1 − 4 ml/min até que o tecido hepático esteja limpo.
- Mude a solução de perfusão para paraformaldeído a 4% (PFA) e perfuse em torno de 15 − 20 mL para fixar o tecido cerebral.
Nota: Instruções mais detalhadas sobre o processo de perfusão podem ser encontradas em Gage et al.19. Os tremores animais serão observados quando feito corretamente. - Retire a cabeça usando um par de tesoura grande e, em seguida, realizar uma série de incisões cuidadosas para libertar o cérebro do crânio. Armazene o tecido cerebral a 4 ° c em 4% de PFA durante a noite para continuar a fixação.
- Remova o tecido cerebral da solução de PFA de 4% e coloque em uma solução de sacarose a 10% em PBS para crioproteger o tecido por 24 h a 4 ° c. Em seguida, transfira o tecido para uma solução de PBS a 30% de sacarose por mais 24 h a 4 ° c antes do corte.
Nota: O tecido cerebral irá afundar em sacarose quando estiver pronto para o corte de micrótomo. O tecido cerebral pode ser armazenado a longo prazo em 30% de sacarose. - Seção de tecido cerebral coronariamente em 40 μm seções usando um micrótomo. Colete seções começando no início do giro dentate, cerca de-1,20 mm de Bregma, e terminando depois que a placa está completa com a primeira seção sendo a mais anterior e a última seção sendo a mais posterior. Consulte um Atlas do cérebro do rato para identificar com precisão a DG e iniciar as coordenadas de recolha de tecidos.
- Armazene serialmente cada seção em fileiras de 6 em uma placa 48 bem preenchida com solução anticongelante (tabela 1).
| Solução anticongelante | Etileno-glicol 150 mL + sacarose 150 g + enchimento a 500 mL 0,1 M PB para a solução de 500 mL |
| Tampão do citrato | 9 mL de stock de ácido cítrico + 41 mL de tampão citrato Tri-sódico + 450 mL de ddH2O |
| Estoque de ácido cítrico | [0,1 M] Ácido cítrico 21 g/1 L ddH2O |
| Estoque de citrato de Tri-sódio | [0,1 M] Tri-citrato de sódio 29,4 g/1 L ddH2O |
| Solução tampão salina Tris-Triton (TBS-Triton) | 0, 5% 100-x Triton em TBS |
| Amortecedor de permeabilização | 0,5% 100-x Triton em TBS |
| Bloqueio de buffer | 0,33 mL de soro de burro em 10 mL de TBS-Triton |
| Solução de reação edu | Faça uma solução CuSO4· 5h2o adicionando 1 mg de CuSO4· 5h2o em 4 ml solução de [0,1 M] Tris pH 8,5. Em seguida, adicione 1:40 de uma solução de 600 μM Alexa488-azida e 10 mg/mL de L-na+ ascorbato à solução CuSO4· 5h2O antes de aplicar ao tecido. |
Tabela 1: soluções utilizadas para a imuno-histoquímica.
5. imunoistoquímica
- Protocolo flutuante básico
Nota: Se manchar Nestin, pule a seção 5,1 e prossiga para a seção 5,2. O protocolo de flutuação básico é para Tbr2 ou doublecortin (DCX) somente sem coloração análoga de edu do timidina.- Transfira seções da solução do anticongelante a salina Tris-tamponada (TBS) na ordem de série em uma placa do poço 48.
- Lave as secções duas vezes em TBS-Triton (0, 5% TBS-Triton, tabela 1) durante 5 min aspirando a solução de cada vez enquanto agitando ou num balancim a velocidades lentas.
- Seções permeabilize utilizando tampão de permeabilização (0,5% TBS-Triton, tabela 1) por 20 − 30 min enquanto agitando em velocidades lentas.
- Faça o tampão de bloqueio adicionando 0,33 μL de soro de burro a 10 mL de TBS-Triton. Fazer fresco e usar dentro de três dias.
- Aspirar tampão de permeabilização e incubar secções em tampão de bloqueio durante 30 min a 1 h à temperatura ambiente (RT).
- Faça a solução preliminar do anticorpo em obstruir o amortecedor e adicionar a cada poço. 500 μL/poço é suficiente para que todas as secções de tecido sejam completamente submersas. Incubar durante a noite em RT em um rocker ou Shaker.
- Aspirar solução e enxaguar secções em TBS-Triton 3x por 10 min cada para remover vestígios de anticorpo primário.
- Incubar no anticorpo secundário conjugado fluoróforo contra anticorpos primários preparados na solução tampão de bloqueio por 2 h em RT em um rocker.
- Lave as secções 3x durante 5 min cada em TBS-Triton e, em seguida, incubar secções em 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solução (300 μM solução em 1:100) diluído em PBS durante 15 min.
- Lave as secções 3x em PBS e secções de montagem que mantêm a ordem de série do anterior ao posterior numa corrediça carregada positivamente. Deixe o tecido secar na RT até que a umidade seja visivelmente desmontada, geralmente cerca de 2 − 5 min, antes da cobertura com suportes de montagem.
- Recuperação do antígeno
Nota: Esta seção é exigida para Nestin somente. Se estiver a manchar a nestina, efectue esta secção antes da coloração analógica da timidina (secção 5,3). Pule para a coloração Tbr2 ou DCX com edu.- Coloc seções do tecido em PBS e monte 5 − 8 seções em uma corrediça positivamente carregada que mantêm a ordem de série do anterior ao posterior. Deixe as seções do tecido secar em RT para aderir completamente aos slides, que leva cerca de 2 − 5 min. o tecido deve estar visivelmente ausente de umidade.
- Prepare o tampão do citrato (tabela 1) em um recipiente, geralmente uma caixa da ponta da pipeta 1.000 μl.
- Tampão do citrato térmico em forno microondas (1.000 W) por 5 min até que a solução esteja fervendo. Quando a solução estiver aquecendo, coloc seções montadas em um suporte de corrediça de vidro de 20 deslizador. Após 5 min, coloque cuidadosamente o porta-lâmina com secções na caixa de pipeta.
- Definir o poder do forno de microondas para 50% e tempo de cozimento para 7 min. Inicie um temporizador por 7 min e observe o microondas. Durante estes 7 minutos, pare o microondas quando a solução começa a ferver e continuar o microondas após a ebulição pára.
Nota: O objetivo desta etapa é manter a temperatura da água logo abaixo da temperatura de ebulição por 7 min. parar depois que o temporizador se esgote mesmo que o tempo de cozimento no microondas não tenha terminado. Instruções mais detalhadas podem ser encontradas em Hussantos et al.20. - Tirar a caixa quente com tampão de citrato e slides de tecido e colocá-lo em um balde de gelo para esfriar. Cubra para impedir que o gelo ou outros materiais entrem na solução. Aguarde cerca de 30 min ou até que a solução é legal para tocar.
- Prossiga para a coloração analógica timmidina etapa 5.3.2 se estiver usando o análogo da timidina.
- Coloração analógica de timidina
Nota: Comece aqui se manchar edu e Tbr2 ou edu e DCX.- Coloc seções do tecido em PBS e monte 5 − 8 seções em uma corrediça positivamente carregada que mantêm a ordem de série do anterior ao posterior e à mesma orientação. Deixe as seções do tecido secar para aderir completamente aos slides e, em seguida, desenhe uma borda usando uma caneta hidrofóbica ou caneta PAP.
- Seções permeabilizadas com tampão de permeabilização (0,5% TBS-Triton) por 20 − 30 min. Em seguida, lave as secções 2x utilizando TBS-Triton durante 5 min cada.
Nota: Permeabilização auxilia a penetração de anticorpos intracelulares. O tempo da permeabilização pode ser ajustado dependendo da espessura do tecido e da eficiência do anticorpo. Alternativamente, pode-se aumentar a concentração de detergente para aumentar a potência de permeabilização. No entanto, deve-se tomar cuidado para não permeabilizar por muito tempo, já que a fragilidade tecidual aumenta com o tempo de permeabilização prolongada. - Prepare a solução de reação de edu de acordo com a tabela 1. A concentração final de Alexa488-azida é de 15 μM em 1 mL de solução de reação de edu.
- Incubar secções na solução de reacção edu durante 30 min a 1 h e depois lave 3x em TBS-Triton durante 5 min cada. Cubra corrediças na folha de alumínio para proteger da luz após esta etapa. Nesta fase, verifique se a reação edu funciona usando um microscópio fluorescente. Edu rotulado células vai fluorescência um microscópio de epifluorescência.
- Protocolo de seção de tecido montado
- Seções do tecido do bloco montadas em uma corrediça da etapa 5.3.4 usando o amortecedor de obstrução levantado nos mesmos animais que o anticorpo secundário, por exemplo, o soro do asno, para 30 minutos a 1 h e para lavar então 2x em TBS-Triton por 5 minutos cada um.
- Prepare o anticorpo preliminar (isto é, a solução da galinha anti-Nestin) durante a etapa de obstrução misturando anticorpos preliminares em obstruir a solução do amortecedor em 1:200. 250 μL por lâmina é suficiente para garantir que o tecido está completamente submerso em solução.
- Incubar seções de tecido em uma solução de anticorpo primário durante a noite em RT após o bloqueio de lavas. Modifique este passo, dependendo do anticorpo primário utilizado.
Nota: Se os anticorpos tiverem um fundo elevado ou uma ligação não específica, a incubação a 4 ° c em vez de RT pode melhorar os resultados. Anticorpos com má penetração tecidual podem ser deixados para incubar por 2 dias, se necessário. - Incubar as secções de tecido 3x em TBS-Triton durante 5 min para remover o excesso de anticorpos primários. Em seguida, incubar as secções de tecido em anticorpos secundários conjugados com fluoróforo (ou seja, Alexa 647 anti-frango a 1:200) preparados para bloquear solução tampão durante 2 h em RT.
- Incubar seções de tecido 3x em TBS-Triton por 5 min para remover o excesso de anticorpo secundário e aplicar 300 μM DAPI solução em 1:100 em PBS por 15 min em RT.
- Incubar seções de tecido 3x em PBS por 5 min para remover o excesso de DAPI e remover o círculo de PAP Pen de cerca de tecido usando um cotonete de algodão ou uma tarefa delicada limpe. Deixe as seções secar e aplique a mídia de montagem e o deslizamento de cobertura. Deixe a mídia de montagem secar antes de slides de imagem.
6. coleção de imagens
- Grupos experimentais cegos de grupos de controle cobrindo rótulos de slides e imagem do mesmo lado da DG usando um microscópio confocal (tabela de materiais) com lente óptica de ampliação de óleo de 40x a 1 μm de tamanho de passo ou um zoom de 20x 2x a 1 μm.
Nota: A ampliação do óleo 40x dará maior resolução, mas levará mais tempo do que o zoom de 20x 2x. - Definir lente objetiva para 40x e, em seguida, clique na guia locate no canto superior esquerdo do software confocal (tabela de materiais) e definir a seção DG desejada no meio do campo de visão.
- Localize a DG, alterne para a guia aquisição no canto superior esquerdo e marque as seguintes caixas: Z-Stack, Tile-Scane Position.
- Ajuste ajustes do canal entre o ganho 600 − 750, a intensidade do laser de 1% − 15%, e o offset 1 − 10. Não exceda a intensidade do laser de 20% para alguns dos canais. Assegure-se de que nenhum pixel esteja saturado ao definir o ganho e a intensidade.
Nota: Estas escalas variarão dependendo da eficiência do equipamento utilizado e da eficiência de coloração. - Ajuste as telhas a 7 horizontais por 3 verticais na janela da varredura da telha e pressione a imagem da vista geral da varredura usando as mesmas configurações que essas que estão sendo usadas atualmente. Por exemplo, use 7 horizontal por 3 vertical e o objetivo 20x com zoom 2x.
- Assegure-se de que o DG esteja completamente dentro da imagem esperada após a varredura da vista geral. Se não, ajuste a vista do DG até que esteja completamente na imagem da vista geral desde que esta é uma imagem representativa que uma estará obtendo.
- Definir profundidade de imagem por rolagem através de diferentes Z-Stacks usando o botão de foco fino. Assegure-se de que toda a DG esteja dentro dos pontos inicial e final. Supondo que um tamanho de etapa de 1 μm, cada imagem deve ser aproximadamente 40 etapas.
- Defina a velocidade de digitalização para 9 com digitalização bidirecional e sem média na janela do modo de aquisição. Em seguida, adicione a posição na janela de posição.
Nota: Repita os passos 6.3 − 6.8 para a imagem de vários DGs de uma só vez. Aumentar a velocidade de digitalização diminui a qualidade da imagem, mas reduz o tempo geral de imagens. Se a qualidade da imagem for muito baixa, reduza a velocidade de digitalização ou aumente a média. - Clique em Iniciar experimento botão quando estiver pronto. Digitalizar 5 secções de DG por rato ao longo do eixo anterior ao posterior. Por exemplo, se a DG esquerda é imaged para a seção um, imagem a próxima mais posterior esquerda DG para a seção dois.
- Costurar imagens separadas para formar uma imagem completa do giro dentado usando o recurso de ponto a guia de processo no software confocal. Alternativamente, use FIJI (ImageJ) para costurar imagens juntas para formar um giro dentate completo.
- Salvar imagens costuradas para quantificação.
7. análise de imagem
- Abra cada imagem de cada seção de giro dentado usando FIJI como uma projeção máxima e como uma imagem composta com os canais mesclados em cores distintas para visualizar facilmente a colocalização.
- Meça a área da DG para cada seção da imagem de projeção máxima usando a ferramenta de seleção de polígono (terceira caixa da esquerda) e registre para cada seção de cada mouse. Esta será a área da DG utilizada para calcular a densidade.
- Registre o número de células em DG a partir da imagem composta que têm Colocalizando anticorpo primário (ou seja, Nestin) e a timidina analógica edu, usando o contador de células de plug-in FIJI encontrado plugins | analisar | contador de células | contador de células. Além disso, registre o número total de células positivas de edu positivas e Nestin com um processo radial.
Nota: No caso da nestina, é muito importante prestar atenção à morfologia. Se quantificar células-tronco neurais, assegure-se de que somente as células com um processo radial sejam quantificadas. Ao quantificar seções de giro dentate, aplique os mesmos critérios a todos, especial ao Visualizar pilhas fora de um plano focal. Se as células não estiverem dentro do plano focal, não as conte. Por favor, veja West et al.21 para obter instruções mais detalhadas sobre a quantificação estereológica. - Insira contagens de células em um software de planilha para compilar todas as partes de dados para análise posteriormente.
- Calcule a densidade de células colocalizadas para cada seção dividindo o número total de células colocalizadas pelo volume total de cada seção em cada animal. Por exemplo, obter a densidade de células-tronco dividindo a soma das células Nestin +/edu + em um animal pela soma do volume de DG em um animal. Calcule o volume de cada seção multiplicando a área com incrementos de passo Z total assumindo que cada etapa é 1 μm.
Nota: Neste protocolo, as etapas totais devem ser próximas a 40, desde que o tecido é seccionado em 40 μm. Assegure-se de que cada animal seja um ponto de dados desde que o objetivo desta aproximação é estimar a quantidade total de pilhas colocalizadas em um hemisfério de um hipocampo. - Realize cálculos adicionais necessários para a pergunta que um está tentando endereçar. Neste exemplo, calcule o número total de células proliferantes, população de células-tronco totais e porcentagem de células-tronco proliferantes após estimular células Mossy contralaterais.
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Representative Results
Seguindo os procedimentos experimentais descritos acima (Figura 1a,B), pudemos determinar os efeitos de estimular projeções de células Mossy contralaterais no nicho neurogênico dentro do hipocampo. Usando um CRE-dependente GQ-acoplado estimulando o vírus de DREADD emparelhado com uma pilha Mossy que etiqueta 5-HT2A CRE-linha, nós pudemos ativar seletivamente projeções excitatórias das pilhas Mossy na DG contralateral e determinamos que a pilha Mossy forte estimulação promoveu a quiescência das células-tronco (Figura 1C). Verificou-se a entrega viral precisa antes da análise do tecido (Figura 2a, B). Adicionalmente, nós verific a ativação de pilhas Mossy através dos experimentos immunohistochemistry de c-fos (dados não mostrados). No caso de injeção viral inadequada, exclua o animal de uma análise mais aprofundada. Uma injeção inadequada é aquela que não consegue direcionar as coordenadas desejadas, tem a maior parte da expressão fora da região desejada, ou tem pouca ou nenhuma entrega viral. Para este experimento, as células Mossy no hilo da DG foram o alvo pretendido, e se as injeções estavam fora do hilo, eles foram excluídos. Usando um Analog do timidina, o edu, e a recuperação do antígeno para a mancha do Nestin esboçado nas seções 5,2 e 5,3, nós pudemos etiquetar com sucesso pilhas de haste neural proliferating (Figura 3a). Adicionalmente, omitindo a etapa da recuperação do antígeno, seção 5,2, nós pudemos etiquetar o progenitor neural positivo e o neuroblast de Tbr2, e o neuroblast positivo de DCX e os neurônios imaturos (Figura 3a). Demonstramos um exemplo da área quantificada e utilizada para calcular a densidade e fornecer um exemplo de tecido montado em um slide (Figura 3B e figura 4a). Além disso, os experimentos bem-sucedidos e subpar são fornecidos como referências para abordagens experimentais (Figura 4B). Por fim, existem várias quantificações diferentes que podem ser obtidas a partir de um experimento bem-sucedido (Figura 5a-D)15. As quantificações incluem a densidade de células-tronco neurais proliferantes (Nestin +/edu +/volume), a porcentagem de células-tronco neurais proliferantes (Nestin +/edu +/Nestin total), células proliferantes totais (edu +/volume) e pool de células-tronco totais (Nestin +/volume ). Em cima da estimulação contralateral de pilhas mossy, uma diminuição na proliferação neural da pilha de haste foi observada. As quantificações similares podem ser obtidas para o progenitor neural e os neurônios imaturos usando o anticorpo apropriado.
Figura 1: abordagem experimental para regulação do circuito de ensaio de células-tronco neurais adultas. (A) esquemático representando as diferentes etapas descritas no protocolo. (B) cronograma de abordagem experimental utilizada para estimular células Mossy em roedores. (C) esquema de injeção visando células Mossy contralaterais para estimulação. (D) esquema da linhagem de desenvolvimento de células-tronco neurais adultas na zona zona (SGZ), camada de células do grânulo (GCL) e camada molecular (ml) com anticorpos correspondentes utilizados em diferentes estágios de desenvolvimento. Os estágios de desenvolvimento diferentes incluem as pilhas de haste neural radiais quiescentes ou ativadas (NSC), os progenitores neural (NP), o neuroblast (NB), as pilhas de grânulo imaturas (GC), e o GC maduro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: demonstração da entrega viral efetiva. (A) imagens de imunofluorescência da entrega viral exata. As partículas virais expressam uma etiqueta fluorescente de mCherry que alvo pilhas Mossy no hilus (região encaixotada branca). DAPI rótulos núcleos de células. O lado da imagem da entrega viral exata demonstra projeções Mossy claras da fibra do lado contralateral da injeção. (B) imagens de imunofluorescência de injeções virais fora do alvo. Note que neste caso as fibras Mossy contralaterais são ausentes no lado da imagem. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de células-tronco neurais proliferantes e progêulas. (A) imagens immunohistochemistry do edu análogo de timidina que colocalizing com os marcadores específicos do estágio da pilha Nestin (pilhas de haste neural e progenitors), Tbr2 (pilhas de haste neural, progenitors neural), e DCX (neuroblast, neurônios imaturos) indicados por pontas de seta brancas. Barra de escala = 10 μm. (B) medida representativa da área dentro do giro dentado usado para calcular a densidade. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: demonstração da preparação da imunofluorescência. (A) esquemático demonstrando separação estereológica de secções de tecido montadas do eixo anterior ao posterior. A caixa vermelha denota o lado imaged. (B) demonstração de experimentos de imunofluorescência de sucesso e de sub-par para marcadores de linhagem neuronal. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: a ativação contralateral de células Mossy diminui a proliferação de células-tronco neurais. (A) as quantificações immunohistochemistry de Nestin +/edu + as pilhas no giro dentate demonstram uma diminuição na proliferação após A estimulação de pilhas Mossy contralaterais. (B) diminuição da porcentagem de células-tronco neurais proliferantes no grupo com células Mossy contralateral ativadas. (C) não houve alteração significativa na densidade de células-tronco neurais em ambos os grupos. (D) não houve alteração nos níveis globais de células proliferantes no giro dentado. Os valores representam médias ± erro padrão de medição. p < 0, 5 (n = 3 para controle, n = 5 para o grupo hM3D). Este número foi adaptado de Yeh et al.15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo deste protocolo é avaliar como manipular circuitos neurais específicos regula a neurogênese hipocampal adulta in vivo usando uma série de técnicas immunohistochemistry. O Regulamento dependente da atividade de assaying da neurogênese adulta mediada por circuitos neurais específicos é uma técnica valiosa com grande potencial para que as modificações estudem uma escala diversa de circuitos neural. O sucesso destes tipos de experimentos depende de vários fatores, incluindo a entrega viral exata, a seleção viral adequada para a manipulação desejada, a entrega adequada de uma timidina analógica, idade animal, eficiência de imunocoloração, sucesso perfusões perfusão, e quantificação imparcial de imagens. Por exemplo, a entrega viral imprecisa pode causar efeitos fora do alvo que resultam em um fenótipo não relacionado ao circuito em questão. Adicionalmente, as técnicas da imunofluorescência da baixa qualidade podem esconder o número verdadeiro de pilhas atuais e conseqüentemente produzir um phenotype que não seja biologicamente relevante. Outro fator muito importante para o controle é a idade dos camundongos ao realizar experimentos, Considerando que a neurogênese adulta é dependente da idade22. Por último, é importante que cada seção é marcada sem biasamente. Para reduzir a polarização, tome uma aproximação metódica e assegure-se de que a pessoa que Marc seja proficiente em identificar as etapas do desenvolvimento adulto de NSC usando a informação morfológica. Adicionalmente, os grupos cegos do controle e do tratamento e revelam suas identidades após quantificações da imagem. Como medida adicional para reduzir o viés, dois indivíduos separados podem quantificar o mesmo conjunto de dados para validar os resultados observados.
Existem várias limitações associadas a esta abordagem para estudar a regulação dependente da atividade do circuito de NSCs adultos e Progênese neonatal. A primeira limitação é que esta aproximação não fornece a informação sobre os tipos específicos da pilha dentro de um circuito que mediar o efeito total em NSCS de manipular o circuito na pergunta. Isto significa que, embora possa haver um efeito fenotípico em NSCs adultos, o efeito pode estar agindo através de um ou vários tipos de células intermediárias. Uma maneira eficiente de abordar essa preocupação é emparelhar esses estudos com eletrofisiologia para fixar os intermediários. Uma limitação adicional deste protocolo é a necessidade de ter uma linha específica do rato do CRE (5-HTR2A) ou uma construção viral (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) que possa alvejar o circuito desejado. Se uma célula efetiva de linha de mouse CRE específica não está prontamente disponível para uma questão de interesse, a capacidade de estudar este circuito torna-se cada vez mais difícil. Entretanto, muitos tipos da pilha no cérebro têm linhas específicas do rato de CRE. Uma limitação menor deste protocolo é relacionada a CNO como um ligand inerte eficaz. Recentemente, estudos demonstraram que o CNO, o produto químico inerte usado para ativar DREADDs, metaboliza a clozapina, o que pode causar fenótipos comportamentais23. No entanto, uma maneira eficiente de abordar é incluir controles adequados em cada experimento. Um exemplo de controles apropriados inclui um controle de CNO e de DREADD, onde o CNO é administrado em combinação com um vírus do repórter do controle (AAV5-DIO-mCherry), e um controle fisiológico somente onde nenhum CNO está administrado a um grupo do vírus do repórter. Ao incluir esses controles, os efeitos de apenas CNO podem ser isolados. Alternativamente, um ligante inerte secundário conhecido como C21, foi demonstrado recentemente para ter a eficácia e a potência similares sem efeitos comportáveis demonstrados24. Por fim, uma limitação final deste protocolo é controlar a quantidade de CNO que cada animal consome durante o experimento. Diferentes animais bebem água contendo CNO em graus variados e podem, portanto, ter uma gama de efeitos sobre a neurogênese adulta. Em geral, um rato tende a beber cerca de 4 mL de água CNO num período de 24 horas. Isto significa que, na concentração de 1 mg/200 mL, os animais recebem um total de 0, 2 mg de CNO por dia, o que é comparável à quantidade de uma dose única de CNO injectada intraperitonealmente. Se a administração acoplada oportuna de CNO é uma preocupação, comutar às injeções intraperitoneal pode ser uma alternativa melhor.
A vantagem de usar este protocolo é o grau de especificidade alcançado quando modulando a neurogênese adulta. Estudos de neurogênese passados utilizaram agonistas farmacológicos ou antagonistas sistemicamente administrados para modular os componentes do circuito. Estas manipulações não específicas podem produzir diferenças fenotípicas mas fornecem pouca introspecção sobre os mecanismos envolvidos no Regulamento neural adulto da pilha de haste. Adicionalmente, este protocolo pode facilmente ser modificado para investigar vários efeitos largos do circuito na neurogênese adulta. Por exemplo, ao mudar para um DREADD inibitório, ou ao direcionar uma ou várias regiões cerebrais de uma só vez, pode-se pedir uma série de perguntas para entender a regulação específica do circuito da neurogênese adulta. Uma outra vantagem de usar este protocolo sobre aproximações precedentes é que, o uso de um anticorpo do Nestin elimina a criação animal transgênicas de repórteres neurais cDNAs codificados da pilha de haste tais como Nestin: GFP, aumentando a eficiência e reduzindo o tempo por experimento8. Além disso, essa técnica limita a manipulação de roedores ao administrar o CNO, o que reduz o estresse dos roedores durante experimentos. É importante atenuar o stress ao estudar processos sensíveis ao stress. Por fim, esta abordagem é facilmente modificável para incluir um ensaio comportamental, por exemplo, se um estava interessado em perguntar se o circuito de células Mossy contralateral que modula as NSCs também desempenha um papel na aprendizagem espacial ou resistência ao stress.
A dificuldade técnica principal ao usar esta aproximação é entrega viral exata. Tornar-se um cirurgião de roedores proficiente toma a prática e pode tomar a Troubleshooting significativo. É conseqüentemente aconselhável executar uma série de experimentos piloto para testar o Titer viral, a eficiência de rotulagem, e a propagação viral. Nós descobrimos que determinados sorotipos têm padrões de espalhamento diferentes e que o sorotipo AAV2 espalha menos do que AAV5 ou AAV8. Além disso, é melhor ter um provedor de embalagens virais confiáveis para cada um desses experimentos. Realizando cirurgias piloto, muitas destas preocupações podem ser abordadas e pode-se economizar tempo. Recomenda-se também que um teste diferentes concentrações de CNO para estimular ou inibir os circuitos desejados. Em geral, 1 mg/kg ativará suficientemente os circuitos testados, mas certos tipos de células podem necessitar de mais ou menos CNO. É importante notar que a dose de administração de CNO pode afetar diferencialmente certos circuitos especificamente quando se olha para algo como células Mossy15.
As aplicações alternativas deste protocolo incluem o teste comportamental simultâneo, a modulação de circuitos alternativos, e a análise adicional de características da neurogênese. Para realizar testes comportamentais, pode-se seguir o protocolo descrito e, após a administração do CNO, realizar uma tarefa comportamental específica, como um novo ensaio de localização, ou uma tarefa de navegação espacial. O benefício desta aproximação é que um único experimento produziria a informação comportamental e específica do circuito que poderia conduzir a um phenotype comportamental específico do circuito. Para modular circuitos alternativos, um pode usar uma combinação de linhas diferentes de CRE e de vetores virais. Por exemplo, se um estava interessado em compreender como inibir neurônios dopaminérgicos da área tegmental ventral (VTA) ou VTA modula a neurogênese adulta, uma poderia usar uma linha do rato do hidroxilase do tirosina e injetar um CRE dependente hM4D (inibitório) Vírus de dreadd dentro ao VTA para determinar a regulação específica dopaminérgicos da neurogênese adulta. As possibilidades de direcionar regiões cerebrais alternativas usando essa abordagem são vastas e podem ser usadas estrategicamente para interrogar circuitos neurais convincentes. Por fim, essa abordagem permite investigar estágios adicionais da neurogênese adulta. Se por exemplo um quisesse compreender como as pilhas Mossy de estimulação afetam o arborização ou o comprimento dendríticas de neurônios imaturos, um seguiria um protocolo similar mas executaria a análise alternativa tal como a análise do Sholl.
Em resumo, este protocolo fornece um processo detalhado passo a passo para a regulação dependente da atividade do circuito de ensaio de NSCs adultos e neurogênese através da tecnologia DREADD. A força deste protocolo reside em sua capacidade de ser facilmente modificada para abordar uma vasta gama de perguntas sobre o circuito específico adulto célula de tronco neural regulação. Com o avanço da tecnologia de repetições palindromicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), agora é mais fácil gerar linhas de mouse específicas da célula CRE para emparelhar com construções virais sofisticadas para abordar questões cada vez mais complexas ampliando a aplicabilidade deste protocolo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
L.J.Q. foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde mental dos institutos nacionais de saúde o suplemento de diversidade R01MH111773, bem como uma subvenção de formação T32 T32NS007431-20. Este projeto foi apoiado das concessões concedidas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160, e NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
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