Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en metod för att analysera beteendet hos vuxna neurala Stem/stamceller som svar på chemogenetisk manipulation av en specifik lokal neurala krets.
Abstract
Adult neurogenes är en dynamisk process genom vilken nyligen aktiverade neurala stamceller (NSCs) i subgranulat zon (SGZ) av dentate gyrus (DG) generera nya nervceller, som integreras i en befintlig neurala krets och bidra till specifika Hippocampus funktioner . Viktigt, vuxna neurogenes är mycket mottagliga för miljömässiga stimuli, som möjliggör aktivitetsberoende reglering av olika kognitiva funktioner. Ett brett spektrum av neurala kretsar från olika hjärnregioner iscengör dessa komplexa kognitiva funktioner. Det är därför viktigt att förstå hur specifika neurala kretsar reglera vuxna neurogenes. Här, vi beskriver ett protokoll för att manipulera neurala krets aktivitet med hjälp av designer receptor exklusivt aktiveras av designer drugs (DREADDs) teknik som reglerar NSCs och nyfödda avkomman i gnagare. Detta omfattande protokoll innehåller stereotaxic injektion av virala partiklar, chemogenetisk stimulering av specifika neurala kretsar, tymidin analog administration, vävnad bearbetning, immunofluorescensmärkning, konfokal avbildning, och Imaging analys av olika stadier av neurala prekursorceller. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner om antigen hämtnings tekniker som används för att visualisera NSCs och deras avkomma och beskriver ett enkelt men effektivt sätt att modulera hjärnkretsar med hjälp av klozapin N-oxid (CNO) eller CNO-innehållande dricksvatten och DREADDs-uttrycker virus. Styrkan i detta protokoll ligger i dess anpassningsförmåga att studera en mängd olika neurala kretsar som påverkar vuxna neurogenes härrör från NSCs.
Introduction
Adult neurogenes är en biologisk process genom vilken nya nervceller föds i en vuxen och integreras i de befintliga neurala nätverken1. Hos människor sker denna process i dentate gyrus (DG) i hippocampus, där omkring 1 400 nya celler föds varje dag2. Dessa celler bor i den inre delen av DG, som hamnar en neurogen nisch, kallas subgranulat zon (SGZ). Här, Hippocampus vuxna neurala stamceller (NSCs) genomgår en komplicerad utvecklingsprocess för att bli fullt fungerande nervceller som bidrar till regleringen av specifika hjärnfunktioner, inklusive inlärning och minne, humör reglering, och stress Response3 ,4,5,6. För att påverka beteenden regleras vuxna NSCs starkt av olika yttre stimuli på ett aktivitetsberoende sätt genom att reagera på en rad lokala och distala kemiska signaler. Dessa kemiska ledtrådar inkluderar signalsubstanser och Neuromodulatorer och agera i en krets specifikt sätt från olika hjärnregioner. Viktigt, krets bred konvergens av dessa kemiska ledtrådar på NSCs möjliggör unik och exakt reglering av stamcells aktivering, differentiering, och öde beslut.
Ett av de mest effektiva sätten att förhöra krets reglering av vuxna NSCs in vivo är genom att para ihop immunofluorescensanalys med krets wide manipulationer. Immunofluorescensanalys av vuxna NSCs är en vanligt utnyttjad teknik, där antikroppar mot specifika molekylära markörer används för att indikera utvecklingsstadiet av vuxna NSCs. Dessa markörer inkluderar: nestin som en radiell glia cell och tidig neurala progenitorceller markör, Tbr2 som en mellanliggande progenitorceller markör, och DCX som en neuroblast och omogen neuron markör7. Dessutom, genom att administrera tymidinanaloger såsom BrdU, cidu, IDU, och edu, kan cellpopulationer som genomgår S-fasen vara individuellt märkta och visualiserade8,9,10. Genom att kombinera dessa två metoder, ett brett spektrum av frågor kan undersökas allt från hur spridningen regleras vid specifika utvecklingsstadier, hur olika signaler påverkar NSC differentiering och neurogenes.
Flera alternativ finns för att effektivt manipulera neurala kretsar inklusive elektrisk stimulering, optogenetik, och chemogenetics, var och en med sina egna fördelar och nackdelar. Elektrisk stimulering innebär en omfattande kirurgi där elektroder implanteras till en specifik hjärnregion som senare används för att överföra elektriska signaler för att modulera en riktad hjärnregion. Men detta tillvägagångssätt saknar både cellulära och krets specificitet. Optogenetik innebär leverans av virala partiklar som kodar en ljus aktiverad receptor som stimuleras av en laser som avges genom en implanterad optisk fiber, men kräver omfattande manipulationer, stora kostnader, och komplexa operationer11. Chemogenetics innebär leverans av virala partiklar som kodar en designer receptor uteslutande aktiveras av designer droger eller DREADDs, som därefter aktiveras av en specifik och biologiskt inert ligand kallas klozapin N-oxid (CNO)12 . Fördelen med att använda DREADDs för att manipulera lokala neurala kretsar som reglerar vuxna NSCs ligger i lätthet och olika vägar CNO administration. Detta möjliggör en mindre tidskrävande metod med minskad djurhantering, vilket är lätt att anpassa för långtidsstudier för att modulera neurala kretsar.
Den metod som beskrivs i detta protokoll är en omfattande samling av olika protokoll som krävs för att framgångsrikt förhöra krets reglering av vuxna Hippocampus neurogenes som kombinerar både immunofluorescensteknik och krets manipulationer använda chemogenetics. Den metod som beskrivs i följande protokoll är lämplig för att stimulera eller hämma en eller flera kretsar samtidigt in vivo för att bestämma deras reglerande funktion på Adult neurogenes. Denna metod används bäst om frågan inte behöver en hög grad av tidsmässig upplösning. Frågor som kräver exakt temporala kontroll av stimulering/hämning vid en viss frekvens, kan bättre åtgärdas med optogenetik13,14. Den metod som beskrivs här är lätt anpassad för långtidsstudier med minimal djurhantering, särskilt där stress är ett stort problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of North Carolina Chapel Hill.
1. stereotaxic injektion av virala partiklar
- Bestämma neurala kretsar i fråga. Detta kommer att avgöra viruset och mus linjen utnyttjas för följande förfarande.
Anmärkning: För detta exempel, kontralaterala Mossy cell prognoser stimuleras att analysera dess effekter på vuxna neurogenes. Virala partiklar kodning AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry levereras till DG 5ht2A-CRE möss15. - Administrera meloxikam (5 mg/kg, subkutant) minst 30 min pre-operativt för att ge förebyggande analgesi till en 8-veckors gammal manlig heterozygot 5ht2A-CRE mus.
- Anesthetize musen med en 4% isofluran syre blandning tills dess andning saktar ner och musen är medvetslös med hjälp av en isofluran kammare. Tå nypa musen för att säkerställa att det inte är lyhörd.
- Placera musen i stereotax på en liten djur värmedyna för termisk reglering och tillämpa ögat smörjmedel till varje öga. Minska isofluran till 1,5% När djuret är inne i stereotax.
Anmärkning: Öron stång placering under detta skede är viktigt. Se till att huvudet är nivå efter örat bar placering. Mer detaljerade instruktioner finns i Geiger et al.16. - Placera hårborttagning produkt på huvudet och låt det sitta upp till 1 min max. Ta bort håret genom att torka huvudet med etanol våtservetter. Om håret inte är helt avlägsnas, upprepa denna process tills toppen av huvudet är hårlös.
- Desinficera det hårlösa området med en povidon-jod lösning minst 3 gånger.
- Placera aktuell lidokain lösning på hårlösa huden på huvudet och vänta i 1 min. ta bort aktuell lidokain från huvudet och göra ett litet snitt på huvudet från början av ögonen till början av öronen ca 2 mm med hjälp av en kirurgisk skalpell.
Anmärkning: Tå nypa musen för att se till att det är helt Sedated innan några snitt. - Dra tillbaka hårbotten och rengör bindväv på toppen av huvudet med hjälp av steriliserade bomullsvabb tills bregma är lätt att identifiera.
- Lokalisera bregma och justera huvudet så att bregma och lambda är båda på samma plan genom att placera borren på båda koordinaterna och säkerställa att de överensstämmer. Dessutom justera vänster och höger hjärnhalva genom att placera borra till vänster/höger i en region mellan bregma och lambda.
Anmärkning: Detta steg är mycket viktigt; felaktigt justerad huvud placering kommer att störa stereotaxic koordinater. - Borra på följande koordinater från bregma med hjälp av en 0,5 mm borr bit: främre bakre axel (AP)-2,00 mm, medial lateral axel (ML) + 1,50 mm. gör en 0,5 mm till 1 mm i diameter borrhål.
Anmärkning: Ändra det här steget med koordinater som är specifika för kretsen i fråga. Detta exempel riktar sig mot en ensidig dentate gyrus som innehåller Mossy celler och bestämmer deras effekt på vuxna neurala stamceller på kontralateral sidan. - Byt borr till 5 μL spruta och 26 − 33 G nål. Noll på bregma och sedan injicera vid följande koordinater genom att placera nålen i borrhålet vid främre bakre axeln-2,00 mm, medial lateral axel-1,50 mm, dorsala ventrala axel-2,3 mm.
- Ingjuta 500 nL av Adeno-Associated virus (AAV) från en viral kärna eller kommersiell källa till lämpligt halvklot, vid 50 − 100 nL/min med hjälp av en infusionspump (tabell över material). Vänta minst 5 min efter injektion innan långsamt ta bort nålen från hjärnan.
Anmärkning: Koordinaterna kan kräva justering baserat på musens ålder och storlek. Vissa virala serotyper har olika spridningsmönster, är det bäst att utföra pilotexperiment för att testa viral spridning innan ett komplett experiment. - Rengör hårbotten och huden runt snittet med hjälp av saltlösning, sedan täta snitt med hjälp av vävnadslim (tabell över material) samtidigt som du håller huden tillsammans med pincett. Utför alla postoperativa procedurer såsom övervakning under återhämtning på en värmedyna tills musen är aktiv, tillämpa smärtstillande på såret, och administrera smärtstillande medel för två dagar.
Anmärkning: Många experiment kräver 2 − 4 veckors väntetid efter viral infusion för korrekt viral uttryck.
2. administrering av klozapin N-oxid
- Bered en stock CNO lösning genom att lösa 10 mg CNO i 100 μL av dimetylsulfoxid (DMSO) och vortexing.
Anmärkning: Om lösningen inte löses upp helt, öka volymen av DMSO, men för mycket DMSO kan göra vattnet bitter. Överskrid inte 0,1% DMSO i CNO vattenlösning eller mer än 200 μL av DMSO för en 200 mL lösning. CNO-lagerlösningen kan förvaras vid-20 ° c i upp till två veckor. - Tillsätt 10 − 50 μL 10 mg/100 μL CNO-lagerlösning till varje 200 mL vatten för en slutlig koncentration på 1 − 5 mg/200 mL. Förbered CNO vatten blandningen färskt varje dag.
Anmärkning: Vissa grupper har kompletterat upp till 1% sackamin i vattnet för att maskera bitterhet om möss avstår från att dricka. Den undersökta kretsen visade ett annat svar baserat på omfattningen av aktiveringen. I allmänhet är 1 mg CNO/200 mL tillräckligt för att stimulera de flesta kretsar17. - Placera CNO-lösningen i en folie täckt eller lätt skyddad behållare vid administrering till möss två veckor efter återhämtning från stereotaxic injektion från steg 1,13 under en period av 4 dagar.
Anmärkning: CNO är ljuskänsligt; minska exponeringen för ljus under hela processen. - Mät och registrera förbrukade CNO vattenlösning varje dag vid beredning färsk CNO lösning. I genomsnitt, en vuxen mus kommer att konsumera ca 4 mL CNO vatten blandning. Dessutom, rekord mus vikt dagligen för att se till att de dricker.
- Se till att lämpliga kontroller utnyttjas för varje experiment. Inkluderar både en CNO och DREADD kontroll. Ett exempel på en experimentell installation skulle omfatta: (1) fordon + autonoma amfibösa fordon (AAV) med viral reporter No DREADD, (2) CNO + AAV med viral reporter No DREADD, och (3) CNO + AAV DREADD.
Anmärkning: Alla grupper inkluderar DMSO i lösningen. DMSO kontroller ingår inte eftersom djuren får mindre än 0,1% DMSO, som inte har visat sig ha negativa effekter på vuxna neurala stamceller hos möss. Om det finns farhågor om DMSO användning i dricksvatten, tillsätt ytterligare ingen DMSO och saltlösning kontroll.
3. thymidine analog märkning
-
På vävnad samling dag, 4 dagar efter administrering CNO, etikett prolifererande celler genom att utföra en serie av tymidine analog, 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (edu) intraperitoneala injektioner.
Anmärkning: detta protokoll använder edu. Emellertid, det finns flera tymidine analoger som effektivt kan märka prolifererande cellpopulationer inklusive BrdU, IDU, och Cidu8.- Väga edu och lös i veterinärmedicinska grade 0,9% natriumkloridinjektion lösning på 4 mg/ml genom vortexa och placering på en rotor för 15 min.
Anmärkning: Thymidine analoger är giftiga och ljuskänsliga. Följ Materialsäkerhetsdatablad (MSDS) vid hantering och täcklösning från ljus exponering med aluminiumfolie. - Administrera edu intraperitonealt vid 40 mg/kg eller 0,1 mL/10 g kroppsvikt 4 mg/mL edu lösning 4 gånger varje 2 h.
Anmärkning: Doser över 50 mg/kg når nära mättnadsnivåer och kommer inte att öka mängden av märkta prolifererande celler signifikant18. Det är viktigt att alla möss får samma mängd edu injektioner eftersom felaktig märkning kan skeva resultat.
- Väga edu och lös i veterinärmedicinska grade 0,9% natriumkloridinjektion lösning på 4 mg/ml genom vortexa och placering på en rotor för 15 min.
4. beredning och bearbetning av vävnader
- Två timmar efter den sista edu injektionen, söva musen med hjälp av en isofluran kammare tills andningen reduceras avsevärt och tå nypa för att säkerställa att det är helt Sedated.
- Säkra musen till ytan med hjälp av nålar och göra ett litet snitt utsätta hjärtat. Sätt en 25 G nål till vänster aorta och skär höger kammare för transcardial perfusion med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösningen med en flödeshastighet av 1 − 4 mL/min tills levervävnad rensas.
- Byt per fusions lösning till 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och parfymera runt 15 − 20 mL för att fixera hjärnvävnad.
Anmärkning: Mer detaljerade anvisningar om per fusionsprocessen finns i Gage et al.19. Djurskakningar kommer att observeras när det görs på rätt sätt. - Ta bort huvudet med ett par stora saxar och sedan utföra en serie av försiktiga snitt för att befria hjärnan från skallen. Förvara hjärnvävnad vid 4 ° c i 4% PFA över natten för att fortsätta fixera.
- Ta bort hjärnvävnaden från 4% PFA lösning och placera i en 10% sackaroslösning i PBS till cryoprotect vävnad för 24 h vid 4 ° c. Överför sedan vävnaden till en 30% sackaros PBS-lösning i ytterligare 24 timmar vid 4 ° c innan snittning.
Anmärkning: Hjärnvävnad kommer att sjunka i sackaros när den är klar för mikrotomen snittning. Hjärnvävnad kan lagras på lång sikt i 30% sackaros. - Avsnitt hjärnvävnad Coralt i 40 μm sektioner med en mikrotom. Samla sektioner som börjar i början av dentate gyrus, ca-1,20 mm från bregma, och slutar efter plattan är komplett med den första delen är den mest främre och den sista sektionen är den mest bakre. Konsultera en mushjärna Atlas för att exakt identifiera DG och börja vävnad samling koordinater.
- Seriellt lagra varje avsnitt i rader av 6 i en 48 väl tallrik fylld med frostskyddsvätska lösning (tabell 1).
| Frostskyddsvätska lösning | Etylenglykol 150 mL + sackaros 150 g + fyllning till 500 mL 0,1 M PB för 500 mL lösning |
| Citratbuffert | 9 mL citronsyra lager + 41 mL Tri-natriumcitratbuffert + 450 mL ddH2O |
| Citronsyra lager | [0,1 M] Citronsyra 21 g/1 L ddH2O |
| Tri-natriumcitrat lager | [0,1 M] Tri-natriumcitrat 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris buffrad saltlösning-Triton (TBS-Triton) | 0,05% 100-x Triton i TBS |
| Permeabiliseringsbuffert | 0,5% 100-x Triton i TBS |
| Blockerande buffert | 0,33 mL Donkey serum i 10 mL TBS-Triton |
| Edu reaktions lösning | Gör en CuSO4· 5H2o lösning genom att tillsätta 1 mg CuSO4· 5H2o i 4 ml lösning av [0,1 M] Tris pH 8,5. Tillsätt sedan 1:40 av en 600 μm Alexa488-azid-lösning och 10 mg/ml L-na+ askorbat till CuSO4· 5H2O lösning innan applicering på vävnad. |
Tabell 1: lösningar som används för immunohistokemi.
5. immunohistokemi
- Grundläggande flytande protokoll
Anmärkning: Om färgning nestin, hoppa över avsnitt 5,1 och fortsätt till avsnitt 5,2. Det grundläggande flytande protokollet är för Tbr2 eller visning (DCX) endast utan tymidine analog edu färgning.- Överför sektioner från frostskydds lösningen till Tris-buffrad saltlösning (TBS) i seriell ordning i en 48-brunn.
- Tvätta sektioner två gånger i TBS-Triton (0,05% TBS-Triton, tabell 1) i 5 minuter genom att aspirera lösningen varje gång medan du skakar eller på en rocker i långsamma hastigheter.
- Permeabilize sektioner med depolarisering buffert (0,5% TBS-Triton, tabell 1) för 20 − 30 min medan skaka i långsamma hastigheter.
- Gör blockeringsbufferten genom att tillsätta 0,33 μL av Donkey serum till 10 mL TBS-Triton. Gör färskt och Använd inom 3 dagar.
- Aspirate depolarisering buffert och inkubera sektioner i blockerande buffert för 30 min till 1 h vid rumstemperatur (RT).
- Gör den primära antikropp lösningen i blockerande buffert och Lägg till varje brunn. 500 μL/brunn räcker för att alla vävnads sektioner ska vara helt nersänkta. Inkubera över natten vid RT på en rocker eller shaker.
- Aspirera lösning och skölj sektioner i TBS-Triton 3x för 10 min vardera för att ta bort spår av primär antikropp.
- Inkubera i fluorophore konjugerad sekundär antikropp mot primära antikroppar som bereds i blockeringsbuffert för 2 h vid RT på en rocker.
- Tvätta sektioner 3x för 5 min vardera i TBS-Triton och sedan Inkubera sektioner i 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) lösning (300 μM lösning på 1:100) utspädd i PBS för 15 min.
- Tvätta avsnitt 3x i PBS och montera sektioner underhålla seriell ordning från Anterior till posteriort på en positivt laddad bild. Låt vävnaden torka vid RT tills fukt är synligt borta, vanligtvis ca 2 − 5 min, innan täckglasappliceringen med monteringsmaterial.
- Antigen hämtning
Anmärkning: Detta avsnitt krävs endast för nestin. Om färgning nestin, utför detta avsnitt före Tymidinanalog färgning (avsnitt 5,3). Hoppa över för Tbr2 eller DCX färgning med edu.- Placera vävnad sektioner i PBS och montera 5 − 8 sektioner på en positivt laddad bild bibehålla seriell ordning från Anterior till posteriort. Låt vävnads sektionerna torka på RT för att helt hålla sig till diabilder, som tar ca 2 − 5 min. vävnad bör vara synligt frånvarande av fukt.
- Bered citratbuffert (tabell 1) i en behållare, vanligtvis en 1 000 μl pipett spets låda.
- Värmecitrat buffert i en mikrovågsugn (1 000 W) i 5 min tills lösningen kokar. Medan lösningen värms upp, placera monterade sektioner i en 20-Slide glas dia bilds hållare. Efter 5 minuter ska du försiktigt placera bildhållaren med sektioner i pipettboxen.
- Ställ in mikrovågsugnen makt till 50% och koka tid för 7 min. Starta en timer i 7 min och titta på mikrovågsugnen. Under dessa 7 minuter, stoppa mikrovågsugnen när lösningen börjar koka och fortsätta mikrovågsugnen efter kokande stopp.
Anmärkning: Målet med detta steg är att hålla vattentemperaturen precis under den kokande temperaturen för 7 min. stanna efter timern tar även om tillagningstiden på mikrovågsugnen inte är klar. Mer detaljerade instruktioner finns i Hussaini et al.20. - Ta ut den varma rutan med citratbuffert och vävnads diabilder och placera den i en ishink för att kyla. Förhindra att is eller andra material kommer in i lösningen. Vänta i ca 30 min eller tills lösningen är coolt att röra.
- Fortsätt till tymidin analog färgning steg 5.3.2 om du använder tymidin analog.
- Thymidine analog färgning
Anmärkning: Börja här om färgning edu och Tbr2 eller edu och DCX.- Placera vävnad sektioner i PBS och montera 5 − 8 sektioner på en positivt laddad bild bibehålla seriell ordning från Anterior till posteriort och samma orientering. Låt vävnads sektionerna torka helt och hållet och dra sedan en gräns med en hydrofoba penna eller en PAP-penna.
- Permeabilize delar upp med depolarisering buffert (0,5% TBS-Triton) för 20 − 30 minuter. Tvätta sedan avsnitten 2x med TBS-Triton för 5 min vardera.
Anmärkning: Permeabilisering aids intracellulär antikropp penetration. Permeabiliseringstiden kan justeras beroende på vävnadstjocklek och antikropps effektivitet. Alternativt kan man öka rengöringsmedels koncentrationen för att öka permeabiliseringsstyrkan. Emellertid, försiktighet bör iakttas för att inte permeabilize för länge sedan vävnad skörhet ökar med långvarig depolarisering tid. - Förbered edu reaktions lösning enligt tabell 1. Den slutliga koncentrationen av Alexa488-azid är 15 μM i 1 mL edu reaktions lösning.
- Inkubera sektioner i edu reaktions lösning i 30 min till 1 h och tvätta sedan 3x i TBS-Triton i 5 min vardera. Täck diabilder i aluminiumfolie för att skydda mot ljus efter detta steg. Kontrollera i detta skede om edu reaktionen fungerar med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop. Edu-märkta celler fluorescerar i ett epifluorescensmikroskopi-Mikroskop.
- Monterat protokoll för vävnads sektion
- Blockera vävnads sektioner monterade på en bild från steg 5.3.4 med blockerande buffert som höjs i samma djur som den sekundära antikroppen, t. ex., Donkey serum, för 30 min till 1 h och sedan tvätta 2x i TBS-Triton för 5 min vardera.
- Förbered primär antikropp (dvs., kyckling anti-nestin) lösning under blockerande steg genom att blanda primära antikroppar i blockerande buffertlösning vid 1:200. 250 μL per Slide är tillräckligt för att säkerställa att vävnaden är helt nedsänkt i lösningen.
- Inkubera vävnads sektioner i en primär antikropps lösning över natten vid RT efter blockering tvättar. Ändra detta steg beroende på den primära antikroppen som används.
Anmärkning: Om antikroppar har hög bakgrund eller icke-specifik bindning, kan inkuberingen vid 4 ° c i stället för RT förbättra resultaten. Antikroppar med dålig vävnads inträngning kan lämnas till Inkubera i 2 dagar vid behov. - Inkubera vävnads sektionerna 3x i TBS-Triton i 5 minuter för att avlägsna överflödig primär antikropp. Inkubera sedan vävnad sektioner i fluoroforkonjugerade sekundära antikroppar (dvs., Alexa 647 anti-kyckling vid 1:200) beredd i blockerande buffertlösning för 2 h vid RT.
- Inkubera vävnads sektionerna 3x i TBS-Triton i 5 minuter för att avlägsna överflödig sekundär antikropp och applicera 300 μM DAPI-lösning på 1:100 i PBS i 15 minuter vid RT.
- Inkubera vävnad avsnitt 3x i PBS för 5 min för att ta bort överskott DAPI och ta bort PAP Pen cirkeln från runt vävnad med hjälp av en bomullstuss eller en delikat uppgift torka. Låt sektionerna torka och applicera sedan monteringsmaterial och täckslip. Låt monteringsmaterialet torka före Imaging slides.
6. Bildinsamling
- Blinda experimentella grupper från kontrollgrupper genom att täcka bildetiketter och bild på samma sida av DG med hjälp av ett konfokala Mikroskop (tabell över material) med 40x olja förstoring optisk lins på 1 μm steg storlek eller en 20x 2x zoom på 1 μm.
Anmärkning: Den 40x Oil förstoring kommer att ge ökad upplösning men ta längre tid än 20x 2x zoom. - Ställ objektiv objektiv till 40x och klicka sedan på lokalisera fliken i det övre vänstra hörnet i konfokalmikroskopi programvara (tabell över material) och Ställ in önskad DG avsnitt i mitten av synfältet.
- Leta upp DG, växla till fliken förvärv i det övre vänstra hörnet och kontrollera följande rutor: Z-stack, Tile-Scan, och position.
- Ställ in kanalinställningar mellan 600 − 750 Gain, 1% − 15% laserintensitet och 1 − 10 offset. Överskrid inte 20% laserintensitet för någon av kanalerna. Se till att inga pixlar är övermättade när du ställer in förstärkning och intensitet.
Anmärkning: Dessa intervall kommer att variera beroende på effektiviteten av den utrustning som används och färgning effektivitet. - Ställ in brickorna till 7 horisontellt med 3 vertikalt i fönstret kakel skanning och tryck på Skanna översiktsbild med samma inställningar som de som för närvarande används. Använd till exempel 7 horisontellt med 3 vertikala och 20x mål med 2x zoom.
- Se till att DG är helt inom den förväntade bilden efter översikts skanning. Om inte, justera vyn av DG tills det är helt i översiktsbilden eftersom detta är en representativ bild som man kommer att få.
- Ställ in bild djupet genom att bläddra genom olika Z-staplar med hjälp av den fina fokuseringsratten. Se till att hela generaldirektoratet ligger inom start-och slutpunkterna. Om du antar en steg storlek på 1 μm bör varje bild vara ungefär 40 steg.
- Ställ in skanningshastigheten på 9 med dubbelriktad skanning och ingen medelvärdes ökning i fönstret förvärvs läge. Lägg sedan till position i positionsfönstret.
Anmärkning: Upprepa steg 6.3 − 6.8 för att avbilda flera insättningsgarantisystemet på en gång. Genom att öka skanningshastigheten sänks bildkvaliteten, men den totala avbildnings tiden minskar. Om bildkvaliteten är för låg minskar du skanningshastigheten eller ökar medelvärdes ökningen. - Klicka på Starta experiment knappen när du är klar. Scan 5 avsnitt av DG per mus längs främre till bakre axeln. Till exempel, om det vänstra generaldirektoratet är avbildat för avsnitt ett, bild nästa mest posteriora vänster DG för avsnitt två.
- Sy separata bilder tillsammans för att bilda en komplett bild av dentate gyrus med hjälp av stygn funktionen under fliken process i konfokalmikroskopi programvara. Alternativt kan du använda FIJI (ImageJ) för att sy bilder tillsammans för att bilda en komplett dentate gyrus.
- Spara sydda bilder för kvantifiering.
7. bildanalys
- Öppna varje bild av varje dentate gyrus avsnitt med FIJI som både en maximal projektion och som en sammansatt bild med kanalerna slås samman i distinkta färger för att enkelt visualisera colocalization.
- Mätområdet för DG för varje sektion av den maximala projektionsbilden med hjälp av polygonverktyget (tredje rutan från vänster) och spela in för varje sektion av varje mus. Detta kommer att vara det område av GD som används för att beräkna densiteten.
- Registrera antalet celler i DG från den sammansatta bilden som har colocalizing primär antikropp (i.e., nestin) och tymidin analog edu, genom att använda Fiji plugin cell Counter finns under plugins | analysera | cell räknaren |cell räknaren. Dessutom registrera det totala antalet edu positiva och nestin positiva celler med en radiell process.
Anmärkning: När det gäller nestin, är det mycket viktigt att uppmärksamma morfologi. Om kvantifiera neurala stamceller, se till att endast celler med en radiell process kvantifieras. När kvantifiera dentate gyrus sektioner, tillämpa samma kriterier för alla, särskilt när visualisera celler utanför ett fokalplan. Om cellerna inte är inom fokalplanet ska du inte räkna dem. Se West et al.21 för mer detaljerade anvisningar om stereologisk kvantifiering. - Ange antal celler i ett kalkylbladsprogram för att kompilera alla data delar för analys senare.
- Beräkna densiteten för colokaliserade celler för varje avsnitt genom att dividera det totala antalet colokaliserade celler med den totala volymen för varje sektion i varje djur. Till exempel få stamcells täthet genom att dividera summan av nestin +/edu + celler i ett djur med summan av DG volym i ett djur. Beräkna volymen för varje avsnitt genom att multiplicera området med totalt antal Z-steg om du antar att varje steg är 1 μm.
Anmärkning: I detta protokoll bör de totala stegen vara nära 40, eftersom vävnaden är sektionerad till 40 μm. se till att varje djur är en datapunkt eftersom målet med denna metod är att uppskatta den totala mängden av colokaliserade celler i en halvklot av en hippocampus. - Utför ytterligare nödvändiga beräkningar för den fråga man försöker ta itu med. I detta exempel, beräkna det totala antalet prolifererande celler, total stamcells population, och procent av prolifererande stamceller efter stimulerande kontralaterala Mossy celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de experimentella procedurer som beskrivs ovan (figur 1a,B), kunde vi bestämma effekterna av stimulerande kontralaterala Mossy cell prognoser på den neurogena nisch inom hippocampus. Genom att utnyttja en CRE-beroende GQ-kopplade stimulerande DREADD-virus i kombination med en Mossy cell märkning 5-HT2A CRE-Line, kunde vi selektivt aktivera excitatoriska prognoser från Mossy celler på den kontralaterala DG och fastställt att starka Mossy cell stimulering främjade stamcells-quiescens (figur 1c). Vi kontrollerade korrekt viral leverans före analysen av vävnad (figur 2A, B). Dessutom kontrollerade vi aktiveringen av Mossy-celler via c-FOS immunohistokemiska experiment (data visas inte). När det gäller felaktig viral injektion, utesluta djur från ytterligare analys. En felaktig injektion är en som misslyckas med att rikta de önskade koordinaterna, har det mesta av uttrycket utanför den önskade regionen, eller har liten eller ingen viral leverans. För detta experiment, Mossy celler i hilus av generaldirektoratet var det avsedda målet, och om injektioner var utanför hilus, de var uteslutna. Genom att använda en tymidin analog, edu, och antigen hämtning för nestin färgning beskrivs i avsnitten 5,2 och 5,3, kunde vi framgångsrikt märka prolifererande neurala stamceller (figur 3a). Dessutom, genom att utelämna antigen Hämta steg, avsnitt 5,2, kunde vi märka Tbr2 positiva neurala progenitorceller och neuroblast, och DCX positiva neuroblast och omogna nervceller (figur 3a). Vi visar ett exempel på det område som kvantifierats och används för att beräkna densiteten och ge ett exempel på monterad vävnad på en bild (figur 3B och figur 4a). Dessutom tillhandahålls både lyckade och sub-par-experiment som referenser för experimentella metoder (figur 4b). Slutligen finns det flera olika kvantifieringar som kan erhållas från ett lyckat experiment (figur 5a-D)15. Kvantifieringarna inkluderar tätheten av prolifererande neurala stamceller (Nestin +/edu +/Volume), procent av prolifererande neurala stamceller (Nestin +/edu +/total nestin), totala prolifererande celler (edu +/volym) och total stamcellspool (Nestin +/Volume ). Vid kontralaterala stimulering av en Mossy celler, observerades en minskning av neural stamcellsproliferation. Liknande kvantifieringar kan erhållas för neurala stamceller och omogna nervceller med hjälp av lämplig antikropp.
Figur 1: experimentellt förhållningssätt till analys krets reglering av vuxna neurala stamceller. (A) schematiska som representerar de olika steg som anges i protokollet. B) tidslinje för experimentell metod som används för att stimulera Mossy-celler i gnagare. (C) injektion Schematisk inriktning kontralaterala Mossy celler för stimulering. (D) Schematisk utveckling härstamning av vuxna neurala stamceller i subgranulat zon (SGZ), granule cell Layer (GCL), och molekylära skikt (ml) med motsvarande antikroppar som används vid olika utvecklingsstadier. De olika utvecklingsstadier omfattar antingen quiescent eller aktiveras radiella neurala stamceller (NSC), neurala progenitorer (NP), neuroblast (NB), omogna granule celler (GC), och mogna GC. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: demonstration av effektiv viral leverans. A) immunofluorescensutbilder av korrekt viral leverans. Viral partiklar uttrycker en mCherry fluorescerande etikett som riktar Mossy celler i hilus (vit boxed region). DAPI etiketter cellkärnor. Bildsidan av exakt viral leverans visar tydliga Mossy fiber prognoser från kontralaterala injektion sidan. B) immunofluorescensutbilder av virus injektioner som inte är av mål. Observera att i detta fall kontralaterala Mossy fibrer är frånvarande i bildsidan. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av prolifererande neurala stamceller och avkomma. (A) immunohistokemi bilder av tymidin analog edu colocalizing med specifika cell Stadium markörer nestin (neurala stamceller och progenitorer), Tbr2 (neurala stamceller, neurala progenitorer), och DCX (neuroblast, omogen nervceller) som anges av vita pilspetsar. Skalstapel = 10 μm.Brepresentativ mätning av området inom dentate gyrus som används för att beräkna densiteten. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: demonstration av immunofluorescensberedning. (A) schematiskt demonstrerande stereologisk separation av monterade vävnads sektioner från främre till bakre axel. Röd ruta betecknar sidan avbildad. B) demonstration av lyckade och sub-par immunofluorescenstest för neuronala härstamning markörer. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kontralateral aktivering av Mossy-celler minskar neurala stamcellsproliferation. (A) immunohistokemiska kvantifieringar av nestin +/edu +-celler i dentate-gyrus uppvisar en minskning av spridningen efter stimulering av kontralaterala Mossy-celler. (B) minskning i procent av prolifererande neurala stamceller i gruppen med aktiverad kontralateral Mossy celler. (C) det fanns ingen signifikant förändring i neurala stamcells täthet i någon grupp. (D) det fanns ingen förändring av de totala nivåerna av prolifererande celler i dentate gyrus. Värden betecknar medelvärden ± standardfel i mätningen. p < 0,05 (n = 3 för kontroll, n = 5 för hM3D gruppen). Denna siffra har anpassats från Yeh et al.15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med detta protokoll är att bedöma hur manipulera specifika neurala kretsar reglerar vuxna Hippocampus neurogenes in vivo med hjälp av en serie av immunohistokemi tekniker. Assaying aktivitet beroende reglering av vuxna neurogenes medieras av specifika neurala kretsar är en värdefull teknik med stor potential för ändringar att studera ett varierat utbud av neurala kretsar. Framgången för dessa typer av experiment beror på flera faktorer, inklusive korrekt viral leverans, ordentlig viral val för önskad manipulation, korrekt leverans av en tymidin analog, djur ålder, immunofärgning effektivitet, framgångsrik transcardial perfusions, och opartisk kvantifiering av bilder. Till exempel kan felaktig viral leverans orsaka av mål effekter som resulterar i en fenotyp som inte är kopplad till kretsen i fråga. Dessutom kan immunofluorescensteknik med låg kvalitet dölja det sanna antalet nuvarande celler och därför producera en fenotyp som inte är biologiskt relevant. En annan mycket viktig faktor att kontrollera är åldern på möss när de utför experiment, med tanke på att vuxna neurogenes är ålder beroende22. Slutligen är det viktigt att varje avsnitt är och poängsätts. För att minska bias, ta ett metodiskt förhållningssätt och se till att personen scoring är skicklig på att identifiera de stadier av vuxna NSC utveckling med hjälp av morfologisk information. Dessutom blinda både kontroll och behandling grupper och avslöja deras identiteter efter bild kvantifieringar. Som en ytterligare åtgärd för att minska bias kan två separata personer kvantifiera samma datauppsättning för att validera observerade resultat.
Det finns flera begränsningar i samband med denna metod för att studera krets aktivitet beroende reglering av vuxna NSCs och nyfödda avkomman. Den första begränsningen är att denna metod inte ger information om de specifika celltyper inom en krets som förmedlar den totala effekten på NSCs från att manipulera kretsen i fråga. Detta innebär att även om det kan finnas en fenotypisk effekt på vuxna NSCs, kan effekten handla genom en eller flera mellanliggande celltyper. Ett effektivt sätt att ta itu med denna oro är att para ihop dessa studier med elektrofysiologi för att fästa ner intermediärerna. En ytterligare begränsning av detta protokoll är behovet av att ha antingen en specifik CRE mus (5-HTR2A) linje eller en viral konstruera (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) som kan rikta den önskade kretsen. Om en effektiv cellspecifik CRE-muslinje inte är lätt tillgänglig för en fråga av intresse, blir förmågan att studera denna krets allt svårare. Emellertid, många celltyper i hjärnan har CRE specifika mus linjer. En mindre begränsning av detta protokoll är relaterat till CNO som en effektiv inert ligand. Nyligen visade studier att CNO, den inert kemikalie som används för att aktivera dreadds, metaboliserar till klozapin, vilket kan orsaka beteendemässiga fenotyper23. Ett effektivt sätt att adressera är dock att inkludera lämpliga kontroller i varje experiment. Ett exempel på lämpliga kontroller omfattar både en CNO och DREADD kontroll, där CNO administreras i kombination med en kontroll reporter virus (AAV5-DIO-mCherry), och en saltlösning endast kontroll där ingen CNO administreras till en reporter virus grupp. Genom att inkludera dessa kontroller kan effekterna av endast CNO isoleras. Alternativt, en sekundär inert ligand känd som C21, har nyligen visat sig ha liknande effekt och styrka utan påvisade beteendemässiga effekter24. Slutligen, en slutlig begränsning av detta protokoll är att kontrollera mängden CNO att varje djur konsumerar under experimentet. Olika djur dricker CNO-innehållande vatten i varierande grad och kan därför ha en rad effekter på vuxna neurogenes. I allmänhet, en mus tenderar att dricka ca 4 mL CNO vatten i en 24 h period. Detta innebär att i koncentrationen av 1 mg/200 mL djuren får totalt 0,02 mg CNO per dag som är jämförbar med mängden av en enda CNO dos injiceras intraperitonealt. Om lämplig kopplad administration av CNO är ett problem, kan byte till intraperitoneala injektioner vara ett bättre alternativ.
Fördelen med att använda detta protokoll är graden av specificitet uppnås vid modulerande vuxna neurogenes. Tidigare neurogenes studier har utnyttjat systemiskt administrerat farmakologisk agonist eller antagonist för att modulera kretskomponenter. Dessa icke-specifika manipulationer kan ge fenotypiska skillnader men ger liten insikt om mekanismer som är involverade i vuxna neurala stamcells reglering. Dessutom, detta protokoll kan enkelt ändras för att undersöka olika krets breda effekter på vuxna neurogenes. Till exempel, genom att byta till en hämmande DREADD, eller genom att rikta en eller flera hjärnregioner på en gång, kan man ställa en rad frågor för att förstå krets specifik reglering av vuxna neurogenes. En annan fördel med att använda detta protokoll över tidigare tillvägagångssätt är att användningen av en nestin antikropp eliminerar transgena djuruppfödning av fluorescerande kodade neurala stamcells reportrar såsom nestin: GFP, öka effektiviteten och minska tiden per experiment8. Dessutom begränsar denna teknik gnagare hantering vid administrering av CNO, vilket minskar gnagare stress under experiment. Det är viktigt att lindra stress när man studerar stresskänsliga processer. Slutligen är detta tillvägagångssätt lätt kan ändras till att omfatta en beteendemässig analys, till exempel, om man var intresserad av att fråga om kontralaterala Mossy cell krets som modulerar NSCs också spelar en roll i rumslig inlärning eller stress resiliens.
Den viktigaste tekniska svårigheten när du använder denna metod är korrekt viral leverans. Att bli en skicklig gnagare kirurg tar övning och kan ta betydande felsökning. Det är därför tillrådligt att utföra en serie försöks experiment för att testa viral titer, märkning effektivitet, och viral spridning. Vi har funnit att vissa serotyper har olika spridningsmönster och att AAV2-serotypen sprider sig mindre än AAV5 eller AAV8. Dessutom är det bäst att ha en betrodd viral paketering leverantör för vart och ett av dessa experiment. Genom att utföra pilot operationer kan många av dessa bekymmer åtgärdas och man kan spara tid. Det rekommenderas också att man testar olika CNO-koncentrationer för att stimulera eller hämma de önskade kretsarna. I allmänhet, 1 mg/kg kommer att tillräckligt aktivera testade kretsar, men vissa celltyper kan kräva mer eller mindre CNO. Det är viktigt att notera att dosen av CNO administration kan differentially påverka vissa kretsar specifikt när man tittar på något som Mossy celler15.
Alternativa tillämpningar av detta protokoll inkluderar samtidig beteendemässig testning, modulering av alternativa kretsar, och ytterligare analys av neurogenes funktioner. För att utföra beteendemässiga tester, kan man följa det protokoll som beskrivs och efter administrering CNO, utföra en viss beteendemässiga uppgift, såsom en ny plats assay, eller en spatial navigerings uppgift. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att ett enda experiment skulle ge både beteendemässiga och krets specifik information som kan leda till en krets specifika beteendemässiga fenotyp. För att modulera alternativa kretsar, kan man använda en kombination av olika CRE linjer och virala vektorer. Till exempel, om man var intresserad av att förstå hur hämmande dopaminerga neuroner från den ventrala tegmental Area området (VTA) eller VTA modulerar vuxna neurogenes, man kan använda en tyrosin hydroxylas CRE mus linjen och injicera en CRE beroende hM4D (hämmande) DREADD virus in till VTA att bestämma dopaminerga specifik reglering av vuxna neurogenes. Möjligheterna att inrikta sig på alternativa hjärnregioner med den här metoden är stora och kan användas strategiskt för att förhöra övertygande neurala kretsar. Slutligen, detta tillvägagångssätt tillåter en att undersöka ytterligare stadier av vuxna neurogenes. Om man till exempel ville förstå hur stimulerande Mossy-celler påverkar arborization eller dendritiska längden på omogna nervceller, skulle man följa ett liknande protokoll men utföra alternativ analys som Sholl-analys.
Sammanfattnings, detta protokoll ger en detaljerad steg-för-steg-process för att assay krets aktivitet beroende reglering av vuxna NSCs och neurogenes via DREADD Technology. Styrkan i detta protokoll ligger i dess förmåga att lätt modifieras för att ta itu med ett brett spektrum av frågor om krets specifika vuxna neurala stamcells reglering. Med avancemang av den grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom upprepar (CRISPR) teknik, är det nu lättare att generera cellspecifika CRE mus linjer för att para ihop med sofistikerade viral konstruktioner för att ta itu med alltmer komplexa frågor utvidga tillämpligheten av detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
L.J.Q. stöddes av National Institute of Mental Health i National Institutes of Health under mångfalds tillägg R01MH111773 samt ett T32 utbildningsbidrag T32NS007431-20. Detta projekt stöddes från bidrag som tilldelades JS från NIH (MH111773, AG058160, och NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
