Summary
Целью данного протокола является описание подхода к анализу поведения взрослых нервных стволовых/протеже клеток в ответ на хемогенетические манипуляции определенной локальной нейронной цепи.
Abstract
Взрослый нейрогенез – это динамический процесс, при котором вновь активированные нервные стволовые клетки (Нск) в подгранулярной зоне (СГЗ) зубной извилины (ДГ) генерируют новые нейроны, которые интегрируются в существующую нейронную цепь и способствуют специфическим функциям гиппокампа . Важно отметить, что взрослый нейрогенез очень восприимчив к экологическим стимулам, что позволяет для активности-зависимых регуляции различных когнитивных функций. Широкий спектр нейронных цепей из различных областей мозга организует эти сложные когнитивные функции. Поэтому важно понять, как конкретные нейронные цепи регулируют нейргенез взрослых. Здесь мы описываем протокол для манипулирования нейронной цепной активности с помощью дизайнера рецептора исключительно активируется дизайнер наркотиков (DREADDs) технологии, которая регулирует NSCs и новорожденных потомства у грызунов. Этот всеобъемлющий протокол включает в себя стереотаксические инъекции вирусных частиц, хемогенетическую стимуляцию конкретных нейронных цепей, аналоговое администрирование тимидина, обработку тканей, маркировку иммунофлюоресценции, конфокальную визуализацию и визуализацию анализ различных стадий нейронных клеток-предшественников. Этот протокол содержит подробные инструкции по методам поиска антигена, используемым для визуализации NSCs и их потомства и описывает простой, но эффективный способ модулировать мозговые цепи с помощью клозапина N-оксида (CNO) или CNO-содержащей питьевой воды и DREADDs-выражающие вирусы. Сила этого протокола заключается в его адаптивности для изучения широкого спектра нейронных цепей, которые влияют на взрослых нейрогенеза, полученные из NSCs.
Introduction
Взрослый нейрогенез является биологическим процессом, с помощью которого новые нейроны рождаются во взрослом возрасте и интегрированы в существующие нейронные сети1. У людей этот процесс происходит в зубной извилине (DG) гиппокампа, где около 1400 новых клеток рождаются каждый день2. Эти клетки находятся во внутренней части ГД, которая таит в себе нейрогенную нишу, именуемую субгралярной зоной (СГЗ). Здесь гиппокампа взрослых нервных стволовых клеток (NSCs) проходят сложный процесс развития, чтобы стать полностью функциональными нейронами, которые способствуют регуляции конкретных функций мозга, в том числе обучения и памяти, регулирование настроения, и стресс ответ3 ,4,5,6. Чтобы влиять на поведение, взрослые НСК строго регулируются различными внешними стимулами в деятельности, зависимой от этого, реагируя на массив местных и дистальных химических сигналов. Эти химические сигналы включают нейротрансмиттеров и нейромодуляторов и действовать в цепи определенным образом из различных областей мозга. Важно отметить, что широкая конвергенция этих химических сигналов на НСК позволяет проводить уникальную и точную регуляцию активации стволовых клеток, дифференциацию и судьбу решений.
Одним из наиболее эффективных способов допроса регулирования схем взрослых NSCs in vivo является сопряжение иммунофлуоресценции анализа с цепью широкие манипуляции. Иммунофлуоресценция анализ взрослых НСК является широко используемым методом, где антитела против конкретных молекулярных маркеров используются для обозначения стадии развития взрослых НСК. Эти маркеры включают в себя: nestin как клетка радиальной глии и ранний нейронный маркер прародителя, Tbr2 как промежуточный маркер прародителя, и dcx как нейробласт и незрелый маркер нейронов7. Кроме того, путем введения тимидина аналогов, таких как BrdU, CidU, Idu, и Edu, популяции клеток, проходящие фазу S могут быть индивидуально помечены и визуализированы8,9,10. Объединив эти два подхода, широкий спектр вопросов может быть исследован, начиная от того, как распространение регулируется на конкретных стадиях развития, как различные сигналы влияют на дифференциацию НСК и нейрогенез.
Существует несколько вариантов эффективного управления нейронными схемами, включая электрическую стимуляцию, оптогенетику и хемогенетику, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Электрическая стимуляция включает в себя обширную операцию, где электроды имплантируются в конкретную область мозга, которые позже используются для передачи электрических сигналов для модулирования целевой области мозга. Однако, этот подход не хватает как клеточной и цепи специфики. Оптогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют свет активированный рецептор, который стимулируется лазером, испускаемым через имплантированное оптическое волокно, но требует обширных манипуляций, больших затрат и сложных операций11. Хемогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют дизайнерский рецептор, исключительно активированный дизайнерскими препаратами или DREADDs, которые впоследствии активируются специфическим и биологически инертным лигандом, известным как клозапин N-оксид (CNO)12 . Преимущество использования DREADDs для манипулирования локальными нейронными схемами, которые регулируют взрослые НСК, заключается в легкости и различных маршрутах управления CNO. Это позволяет менее трудоемкий подход с сокращением обработки животных, который легко адаптируется для долгосрочных исследований, чтобы модулировать нейронных цепей.
Подход, описанный в этом протоколе, представляет собой всеобъемлющий набор различных протоколов, необходимых для успешного допроса схемы регулирования взрослых гиппокампа нейрогенеза, который сочетает в себе как методы иммунофлюоресценции и схемы манипуляций с помощью хемогенетики. Метод, описанный в следующем протоколе, подходит для стимулирования или ингибирования одной или нескольких цепей одновременно in vivo, чтобы определить их регулирующую функцию на взрослых нейрогенеза. Этот подход лучше всего использовать, если вопрос не нуждается в высокой степени временного разрешения. Вопросы, требующие точного временного контроля стимуляции / ингибирования на определенной частоте, могут быть лучше решены с помощью оптогенетики13,14. Описанный здесь подход легко адаптируется для долгосрочных исследований с минимальным обращением с животными, особенно в тех случаях, когда стресс является серьезной проблемой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) в Университете Северной Каролины Чапел-Хилл.
1. Стереотаксическая инъекция вирусных частиц
- Определите нейронные цепи, о котором идет речь. Это определит вирус и линию мыши, используемую для следующей процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, контралатеральные мхомклетки проекции стимулируются для анализа его воздействия на взрослых нейрогенеза. Вирусные частицы, кодируя AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry поставляются в DG 5ht2A-Cre мышей15. - Администрирование мелоксикама (5 мг/кг, подкожно) по крайней мере 30 мин предварительно оперативно, чтобы обеспечить упреждающий анальгезии 8-недельного мужчины heterozygous 5ht2A-Cre мыши.
- Анестезия мыши с помощью 4% изофруран кислородной смеси, пока его дыхание замедляется и мышь без сознания с помощью изофрурановой камеры. Toe ущипнуть мышь, чтобы убедиться, что он не реагирует.
- Поместите мышь в стереотаксис на небольшой косяк для нагрева ния для тепловой регуляции и нанесите смазку для глаз к каждому глазу. Уменьшите изолюран до 1,5%, как только животное находится внутри стереотаксиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение ухо бар на этом этапе имеет важное значение. Убедитесь, что голова находится на уровне после размещения ушной прыжек. Более подробные инструкции можно найти в Гейгер и др.16. - Поместите продукт удаления волос на голову и дайте ему сидеть до 1 мин максимум. Удалите волосы, вытирая голову этанол салфетки. Если волосы не полностью удалены, повторите этот процесс, пока верхняя часть головы не будет волосатой.
- Дезинфицировать лысую область с повидон-йодраствор омейд решение по крайней мере 3 раза.
- Поместите актуальный раствор лидокаина на лысую кожу головы и ждите 1 мин. Снимите актуальный лидокаин с головы и сделайте небольшой разрез на голове от начала глаза до начала ушей около 2 мм с помощью хирургического скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Toe щепотку мыши, чтобы убедиться, что она полностью успокоительное, прежде чем делать какие-либо разрезы. - Уречку кожи головы и очистить соединительную ткань на верхней части головы с помощью стерилизованных ватных тампонов, пока bregma легко идентифицировать.
- Найдите bregma и отрегулируйте головку так, чтобы bregma и lambda оба на одной плоскости путем устанавливать сверло на обоих координатах и уверяя они выравнивают. Кроме того, выровнять левое и правое полушарие, поместив сверло влево / вправо области между bregma и lambda.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень важен; неправильно выровненое размещение головы нарушит стереотаксические координаты. - Просверлите следующие координаты брегмы с помощью 0,5-мм сверла бит: передняя задняя ось (AP) -2,00 мм, медиальная боковая ось (ML) 1,50 мм. Сделайте отверстие для бурения диаметром от 0,5 мм до 1 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измените этот шаг с координатами, специфичными для рассматриваемой схемы. Этот пример нацелен на одностороннюю зубную извилинку, содержащую мшистые клетки, и определяет их влияние на взрослые нервные стволовые клетки на контралатеральной стороне. - Переключите сверло на шприц 5 л и на иглу 26-33 G. Ноль в брегме, а затем вводят в следующих координатах, поместив иглу в отверстие для сверления на передней задней оси -2,00 мм, медиальной боковой оси -1,50 мм, рзавской вентральной оси -2,3 мм.
- Налейте 500 nL адено-ассоциированного вируса (AAV) из вирусного ядра или коммерческого источника в соответствующее полушарие, при 50-100 нл/мин с помощью инфузионного насоса (Таблица материалов). Подождите, по крайней мере 5 минут после инъекции, прежде чем медленно удалить иглу из мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти координаты могут потребовать корректировки в зависимости от возраста и размера мыши. Некоторые вирусные серотипы имеют различные модели диффузии, лучше всего выполнять экспериментальные эксперименты для тестирования вирусного распространения до полного эксперимента. - Очистите кожу головы и кожу вокруг разреза с помощью физраствора, затем уплотнение разреза с помощью клейки ткани (Таблица материалов) при проведении кожи вместе с пинцетом. Выполняйте все послеоперационные процедуры, такие как наблюдение во время восстановления на грелке до тех пор, пока мышь не активится, нанесение анальгетика на рану и введение обезболивающих в течение двух дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие эксперименты требуют 2-4 недели ожидания времени после вирусного вливания для надлежащего вирусного выражения.
2. Клозапин N-оксид администрации
- Подготовьте стоковый раствор CNO путем растворения 10 мг CNO в 100 л диметилсулькоксида (DMSO) и вихря.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор не растворяется полностью, увеличьте объем ДМСО, но слишком много DMSO может сделать воду горькой. Не превышать 0,1% DMSO в водном растворе CNO или более 200 л DMSO для раствора 200 мл. Стоюсc CNO может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение двух недель. - Добавьте 10-50 л 10 мг/100 л CNO штепсила раствор омование воды для конечной концентрации 1'5 мг/200 мл. Приготовьте водную смесь CNO свежие каждый день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые группы дополнили до 1% сахарина в воде, чтобы замаскировать горечь, если мыши воздерживаются от питья. Исследованная схема показала иную реакцию, основанную на степени активации. В целом, 1 мг CNO/200 мл достаточно, чтобы стимулировать большинство схем17. - Поместите раствор CNO в фольгу, покрытый или защищенный от света, при введении мышам через две недели после восстановления после стереотаксической инъекции с шага 1.13 в течение 4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: CNO светочувствительный; уменьшить воздействие света в течение всего процесса. - Измеряйте и записывайте потребляемый водяной раствор CNO каждый день при подготовке свежего раствора CNO. В среднем, взрослая мышь потребляет около 4 мл смеси воды CNO. Кроме того, запись веса мыши ежедневно, чтобы убедиться, что они пьют.
- Убедитесь, что для каждого эксперимента используются надлежащие элементы управления. Включите как CNO, так и DREADD-контроль. Примером экспериментальной установки будет включать в себя: (1) автомобиль - автономный автомобиль-амфибия (AAV) с вирусным репортером не DREADD, (2) CNO и AAV с вирусным репортером не DREADD, и (3) CNO и AAV DREADD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все группы включают DMSO в решение. Контроль DMSO не включен, потому что животные получают менее 0,1% DMSO, который не был показан, чтобы иметь неблагоприятное воздействие на взрослых нервных стволовых клеток у мышей. Если есть опасения относительно использования DMSO в питьевой воде, добавьте дополнительный не DMSO и солевой контроль.
3. Тимидин Аналоговая маркировка
-
В день сбора тканей, через 4 дня после введения CNO, этикетка размножающихся клеток, выполняя серию тимидина аналога, 5-этинил-2'-deoxyuridine (Edu) интраперитонеальных инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует Edu. Тем не менее, Есть несколько аналогов тимидина, которые могут эффективно этикетки размножающихся популяций клеток, включая Brdu, Idu, и Cidu8.- Взвесить Edu и растворить в ветеринарном классе 0,9% раствора инъекции хлорида натрия при 4 мг/мл путем вихря и размещения на роторе в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тимидин аналоги токсичны и светочувствительны. Следите за листами данных о безопасности материалов (MSDS) при обработке и крышке решения от воздействия света с использованием алюминиевой фольги. - Вводя Edu интраперитоневически при 40 мг/кг или 0,1 мл/10 г массы тела 4 мг/мл Эду 4 раза каждые 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дозы выше 50 мг/кг достигают около уровня насыщения и не увеличивают количество помеченных размножающихся клеток значительно18. Очень важно, чтобы все мыши получают одинаковое количество инъекций Эду, так как неправильная маркировка может исказить результаты.
- Взвесить Edu и растворить в ветеринарном классе 0,9% раствора инъекции хлорида натрия при 4 мг/мл путем вихря и размещения на роторе в течение 15 мин.
4. Подготовка и обработка тканей
- Через два часа после последней инъекции Edu, анестезирует мышь с помощью изофрурановой камеры, пока дыхание значительно снижается и ног щепотку, чтобы убедиться, что она полностью успокоительное.
- Защищайте мышь на поверхность с помощью игл и сделайте небольшой разрез, обнажающий сердце. Вставьте 25 G иглу левой аорты и вырежьте правый желудочек для перфузии транскардиала с помощью раствора фосфатного солевого раствора (PBS) со скоростью потока 1,4 м/мин до тех пор, пока ткань печени не будет очищена.
- Переключите перфузийный раствор на 4% параформальдегид (PFA) и надоете около 15-20 мл, чтобы исправить ткани мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробные инструкции по процессу перфузии можно найти в Gage et al.19. Подземные толчки животных будут наблюдаться, когда сделано правильно. - Удалите голову с помощью больших ножниц, а затем выполнить ряд осторожных разрезов, чтобы освободить мозг от черепа. Храните ткани мозга при 4 градусах По области при 4% ПФА на ночь, чтобы продолжить фиксацию.
- Удалить ткани мозга из 4% PFA раствор и поместить в 10% сахарозы раствор в PBS криопротектора ткани в течение 24 ч при 4 C. Затем перенесите ткань в 30% раствор сахарозы PBS еще на 24 ч при 4 градусах Цельсия перед секцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг ткани будет тонуть в сахарозе, когда готовы для микротома секции. Ткань мозга может храниться в долгосрочной перспективе в 30% сахарозы. - Секция мозговой ткани коронально в 40 мкм разделов с помощью микротома. Соберите секции, начинающиеся в начале зубной извилины, около -1,20 мм от брегмы, и заканчивая пластиной, в комплекте с первым разделом, наиболее передней и последней секции является наиболее задней. Обратитесь к атласу мозга мыши, чтобы точно определить DG и начальные координаты сбора тканей.
- Последовательно хранить каждый раздел в ряды 6 в 48 хорошо пластины заполнены антифриз решение (Таблица 1).
| Решение для борьбы с антифризом | Этилен-гликоль 150 мл сахароза 150 г, заливка до 500 мл 0,1 МБ на 500 мл раствора |
| Цитрат Буфер | 9 мл лимонной кислоты запаса 41 мл трехнатриевого цитрата буфера 450 мл ddH2O |
| Кусок цитровой кислоты | 0,1 М Кислота 21 г/1 L ddH2O |
| Три натрия цитрат запасов | 0,1 М Три натрия цитрат 29,4 г/1 L ddH2O |
| Трис Бафферед Солин-Тритон (TBS-Тритон) | 0.05% 100-x Тритон в TBS |
| Пермякибационный буфер | 0.5% 100-x Тритон в TBS |
| Блокирование буфера | 0.33 мл осла сыворотки в 10 мл TBS-Тритон |
| Edu Реакция Решение | Сделайте решение CuSO4х5H2O, добавив 1 мг CuSO4Х5H2O в растворе 4 мл в размере 0,1 Мз РН 8,5. Затем добавьте 1:40 раствора Alexa488-azide 600 мкм и 10 мг/мл L-Naи аскорбата в раствор CuSO4х5H2O перед нанесением на ткани. |
Таблица 1: Решения, используемые для иммуногистохимии.
5. Иммуногистохимия
- Базовый плавающий протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: При окрашивании гнездина пропустите раздел 5.1 и перейдите в раздел 5.2. Основной плавающий протокол для Tbr2 или doublecortin (DCX) только без тимидина аналогового edu окрашивания.- Передача секций от раствора антифриза к раствору Tris-buffered saline (TBS) в серийном порядке в 48 скважинной пластине.
- Вымойте разделы дважды в TBS-тритон (0,05% TBS-тритон, таблица 1) в течение 5 минут, аспирируя решение каждый раз во время тряски или на рокер на низких скоростях.
- Пермяки разделы с использованием буфера пермяки (0,5% TBS-тритон, таблица 1) для 20'30 мин при встряхивании на низких скоростях.
- Сделайте блокирующий буфер, добавив 0,33 л сыворотки осла до 10 мл TBS-тритона. Сделать свежее и использовать в течение 3 дней.
- Аспирный буфер permeabilization и инкубировать разделы в блокируя буфере на 30 мин до 1 ч при комнатной температуре (RT).
- Сделать первичное решение антитела в блокировании буфера и добавить к каждому хорошо. 500 л/ну достаточно для того, чтобы все участки ткани были полностью погружены в воду. Инкубировать ночь на RT на рокер или шейкер.
- Аспирный раствор и промыть секции в TBS-тритон 3x в течение 10 минут каждый, чтобы удалить следы первичных антител.
- Инкубировать в фторфоре спрягать вторичные антитела против первичных антител, подготовленных в блокировании буферного раствора в течение 2 ч на RT на рокер.
- Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый в TBS-тритон, а затем инкубировать разделы в 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) раствор (300 мкм раствор в 1:100) разбавленного в PBS в течение 15 мин.
- Вымойте разделы 3x в PBS и смонтировать секции поддержания последовательного порядка от передней до задней на положительно заряженном слайде. Пусть ткани высохнут на RT, пока влага заметно исчезли, как правило, около 2'5 мин, прежде чем coverslipping с монтажом средств массовой информации.
- Извлечение антигена
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел требуется только для nestin. Если окрашивание гнездина, выполните этот раздел до тимидина аналогового окрашивания (раздел 5.3). Перейти на Tbr2 или DCX окрашивания с Edu.- Поместите секции тканей в PBS и установите 5-8 секций на положительно заряженном слайде, поддерживающем серийный порядок от передней до задней. Пусть секции тканей высохнут на RT, чтобы полностью придерживаться слайдов, что занимает около 2-5 мин. Ткань должна быть заметно отсутствует влаги.
- Подготовка цитрат буфера (Таблица 1) в контейнере, как правило, 1000 л пипетки отзыв поле.
- Нагрейте буфер цитрата в микроволновой печи (1000 Вт) в течение 5 мин до кипения раствора. В то время как решение нагревается, поместите установленные секции в 20-слайдное стеклянное держатель слайда. После 5 минут, осторожно поместите держатель слайда с разделами в коробку пипетки.
- Установите микроволновую печь мощность юаней до 50% и варить время в течение 7 мин. Запустите таймер в течение 7 минут и смотреть микроволновой печи. В течение этих 7 минут, остановить микроволновую печь, когда раствор начинает кипеть и продолжить микроволновую печь после кипения останавливается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага состоит в том, чтобы держать температуру воды прямо под температурой кипения в течение 7 мин. Остановка после таймер иссякнут, даже если время приготовления на микроволновой печи не закончилось. Более подробные инструкции можно найти в Hussaini и др.20. - Выньте теплую коробку с цитратом буфера и ткани слайды и поместите его в ведро со льдом, чтобы охладить. Обложка, чтобы предотвратить попадание льда или других материалов в раствор. Подождите около 30 минут или до тех пор, пока решение прохладно на ощупь.
- Приступить к тимидин аналоговый этап окрашивания 5.3.2 при использовании аналога тимидина.
- Тимидин аналоговое окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните здесь, если окрашивание Edu и Tbr2 или Edu и DCX.- Поместите секции тканей в PBS и установите 5-8 секций на положительно заряженном слайде, поддерживающем серийный порядок от передней до задней и той же ориентации. Пусть ткани разделы высохнуть, чтобы полностью придерживаться слайдов, а затем нарисовать границу с помощью гидрофобной ручкой или PAP перо.
- Пермяки с буфером пермяки (0,5% TBS-triton) на 20–30 мин. Затем мыть разделы 2x с помощью TBS-тритон в течение 5 минут каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пермябилизация способствует проникновению внутриклеточного антитела. Время пермяки может быть скорректировано в зависимости от толщины ткани и эффективности антител. Кроме того, можно увеличить концентрацию моющего средства для увеличения пермяки потенции. Тем не менее, следует позаботиться, чтобы не пронизать слишком долго, так как хрупкость тканей увеличивается с длительным временем permeabilization. - Подготовка решения реакции Edu в соответствии с таблицей 1. Окончательная концентрация Alexa488-azide составляет 15 мкм в 1 мл реакционного раствора Edu.
- Инкубировать разделы в растворе реакции Edu в течение 30 мин до 1 ч, а затем мыть 3x в TBS-тритон в течение 5 мин каждый. Обложка слайды в алюминиевой фольге, чтобы защитить от света после этого шага. На этом этапе проверить, если реакция Edu работает с помощью флуоресцентного микроскопа. Эду помеченные клетки будут флуоресцировать под эпифлюоресцентным микроскопом.
- Протокол секции коней
- Блок ткани разделы установлены на слайде от шага 5.3.4 с помощью блокирующего буфера, поднятые в тех же животных, как вторичное антитело, например, осла сыворотки, в течение 30 мин до 1 ч, а затем мыть 2x в TBS-тритон в течение 5 минут каждый.
- Подготовка первичного антитела (т.е. курица анти-нестхин) раствор во время блокирования шаг путем смешивания первичных антител в блокировании буферного раствора в 1:200. 250 л на слайд достаточно, чтобы гарантировать, что ткань полностью погружена в раствор.
- Инкубировать участки тканей в первичном растворе антитела в одночасье на RT после блокирования смещения. Измените этот шаг в зависимости от используемого первичного антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если антитела имеют высокий фон или неспецифические связывания, инкубации при 4 градусах цельсия вместо RT могут улучшить результаты. Антитела с плохим проникновением тканей можно оставить для инкубации в течение 2 дней, если это необходимо. - Инкубировать ткани разделов 3x в TBS-тритон в течение 5 минут, чтобы удалить избыток первичных антител. Затем инкубировать секции тканей в фторфоре конъюгированных вторичных антител (т.е. Alexa 647 анти-курица в 1:200), подготовленных в блокирующем буферном растворе для 2 ч на RT.
- Инкубировать ткани разделов 3x в TBS-тритон в течение 5 минут, чтобы удалить избыток вторичных антител и применять 300 мкм DAPI раствор в 1:100 в PBS в течение 15 мин на RT.
- Инкубировать ткани разделов 3x в PBS в течение 5 минут, чтобы удалить избыток DAPI и удалить круг пап пера вокруг ткани с помощью ватного тампона или деликатной задачи протрите. Пусть разделы высохнуть, а затем применить монтаж амносов и покрытия скольжения. Пусть монтаж носителя сухой до изображения слайдов.
6. Коллекция изображений
- Слепые экспериментальные группы из контрольных групп, покрывая слайд-метки и изображение той же стороне DG с помощью конфокального микроскопа(Таблица материалов) с 40x маслом увеличения оптического объектива на 1 мкм размер шага или 20x 2x зум на 1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение масла 40x даст увеличенное разрешение но примет более длиной чем зум 20x 2x. - Установите объектив объективного объектива в 40x, а затем нажмите на вкладку найти в верхнем левом углу в confocal программного обеспечения (Таблицаматериалов) и установить желаемый раздел DG в середине поля зрения.
- Найдите DG, переключитесь на вкладку приобретения в верхнем левом углу, и проверьте следующие коробки: й-стек, плитка-сканирование, и положение.
- Установите настройки канала между приростом от 600 до 750, интенсивностью лазера от 1%до 15% и смещением от 1до 100. Не превышать 20% интенсивности лазера для любого из каналов. Убедитесь, что при настройке прироста и интенсивности пикселей пиксели не перенасыщены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти диапазоны будут варьироваться в зависимости от эффективности оборудования, использованного и эффективности окрашивания. - Установите плитки до 7 горизонтальных на 3 вертикальных в окне сканирования плитки и нажмите сканирование обзор изображения с использованием тех же параметров, как те, которые в настоящее время используются. Например, используйте 7 горизонтальных по 3 вертикальные и 20x цель с 2x зум.
- Убедитесь, что DG полностью находится в пределах ожидаемого изображения после сканирования обзора. Если нет, отрегулируйте представление DG до тех пор пока оно полностью не в изображении обзора в виду того что это репрезентивное изображение которое одно будет получать.
- Установите глубину изображения, прокручивая различные стеки с помощью тонкой ручки фокусировки. Убедитесь, что весь DG находится в пределах начальной и конечных точек. Предполагая размер шага 1 мкм, каждое изображение должно быть примерно 40 шагов.
- Установите скорость сканирования до 9 с двунаправленным сканированием и не усреднение в окне режима приобретения. Затем добавьте положение в окне положения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 6.3'6.8 для изображения нескольких DG одновременно. Увеличение скорости сканирования снижает качество изображения, но сокращает общее время изображения. Если качество изображения слишком низкое, уменьшите скорость сканирования или увеличьте усреднение. - Нажмите кнопку запуска эксперимента, когда это будет готово. Сканирование 5 разделов DG на мышь вдоль передней части задней оси. Например, если левая DG изображена для раздела 1, изображение следующего наиболее заднего слева DG для раздела 2.
- Сшивайте отдельные изображения вместе, чтобы сформировать полное изображение зубной извилины с помощью функции стежка под вкладкой процесса в конфокальном программном обеспечении. Кроме того, используйте FIJI (ImageJ), чтобы сшить изображения вместе, чтобы сформировать полную зубную извилине.
- Сохранить сшитые изображения для количественной оценки.
7. Анализ изображений
- Откройте каждое изображение каждого раздела зубной извилины, используя FIJI как максимальную проекцию и как композитное изображение с каналами, слитыми в различные цвета, чтобы легко визуализировать колокализацию.
- Измерьте область DG для каждого раздела максимального проекционного изображения с помощью инструмента выбора полигона (третья коробка слева) и запишите для каждого раздела каждой мыши. Это будет область ГД, используемая для расчета плотности.
- Запись количества клеток в DG из композитного изображения, которые coлокализации первичных антител (т.е. nestin) и тимидин аналог Edu, с помощью счетчика плагина FIJI ячейки найти под плагинами проанализировать счетчик ячеек и счетчик клеток. Кроме того, запишите общее количество положительных и гнездовых положительных клеток с радиальным процессом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае с гнездом очень важно обратить внимание на морфологию. Если количественно нервных стволовых клеток, убедитесь, что только клетки с радиальным процессом количественно. При количественной оценке зубных секций извилины, применять те же критерии для всех, особенно при визуализации клеток за пределами фокусной плоскости. Если клетки не находятся в фокусной плоскости, не подсчитывайте их. Более подробные инструкции по стериологической количественной оценке у западных и др.21. - Введите количество ячеек в программном обеспечении электронной таблицы для компиляции всех фрагментов данных для анализа позже.
- Рассчитайте плотность colocalized клеток для каждого раздела, разделив общее количество colocalized клеток на общий объем для каждого раздела в каждом животном. Например, получить плотность стволовых клеток путем деления суммы клеток nestin/edu в одном животном на сумму объема DG в одном животном. Рассчитайте объем каждого раздела, умножая область общими шагом приращения, предполагая, что каждый шаг составляет 1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, общее количество шагов должно быть близко к 40, так как ткань разделена на 40 мкм. Убедитесь, что каждое животное является точкой данных, поскольку цель этого подхода заключается в оценке общего количества colocalized клеток в одном полушарии гиппокампа. - Выполните дополнительные необходимые расчеты для вопроса, который один пытается решить. В этом примере вычислите общее количество размножающихся клеток, общую популяцию стволовых клеток и процент ы пролиферации стволовых клеток после стимуляции контралатеральных мшистых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После экспериментальных процедур, описанных выше(Рисунок 1A,B), мы смогли определить эффекты стимулирования контралатеральных мшистых клеток проекции на нейрогенной нише в гиппокампе. Используя Cre-зависимый Gq-coupled стимулирующий вирус DREADD в паре с мшистой клеточной маркировкой 5-HT2A Cre-line, мы смогли выборочно активировать возбуждающие проекции из мшистых клеток на контралатеральный DG и определили, что сильные мшистые клетки стимуляция способствовала quiescence стволовых клеток(рисунок 1C). Мы проверили точную вирусную доставку перед анализом тканей(рисунок 2A, B). Кроме того, мы проверили активацию мшистых клеток с помощью c-fos иммуногистохимии экспериментов (данные не показаны). В случае неправильной вирусной инъекции, исключить животное из дальнейшего анализа. Неправильная инъекция является тот, который не в состоянии ориентироваться на желаемые координаты, имеет большую часть выражения за пределами желаемого региона, или практически не вирусных доставки. Для этого эксперимента, мшистые клетки в hilus DG были намеченной целью, и если инъекции были вне hilus, то они были исключены. С помощью аналога тимидина, Edu, и антигена поиска для гнезда окрашивания, изложенные в разделах 5.2 и 5.3, мы смогли успешно этикетки размножающихся нервных стволовых клеток (Рисунок 3A). Кроме того, опустив шаг поиска антигена, раздел 5.2, мы смогли обозначить Tbr2 положительный нейропрайтор и нейробласт, и DCX положительный нейробласт и незрелые нейроны (Рисунок 3A). Мы демонстрируем пример области количественно и используется для расчета плотности и предоставить пример установленной ткани на слайде(Рисунок 3B и рисунок 4A). Кроме того, как успешные, так и непаритетные эксперименты предоставляются в качестве справочных примеров для экспериментальных подходов(рисунок 4B). Наконец, Есть несколько различных количественных показаний, которые могут быть получены из успешного эксперимента(Рисунок 5A-D)15. Количественные показатели включают плотность пролиферирующих нервных стволовых клеток (Nestin/Edu/volume), процент пролиферирующих нервных стволовых клеток (Nestin/Edu/total nestin), общий пролиферирующие клетки (Edu/volume) и общий пул стволовых клеток (Nestin/volume ). При контрлатеральной стимуляции мшистых клеток наблюдалось снижение пролиферации нервных стволовых клеток. Аналогичные количественные оценки могут быть получены для нейронных прародителей и незрелых нейронов с помощью соответствующих антител.
Рисунок 1: Экспериментальный подход к регуляции схемы асссе взрослых нервных стволовых клеток. (A) Схема, представляющая различные шаги, изложенные в протоколе. (B) Хронология экспериментального подхода, используемого для стимулирования мшистых клеток у грызунов. (C) Инъекция схематичный ориентации контралатеральных мшистых клеток для стимуляции. (D) Схема развития линии взрослых нервных стволовых клеток в субгралярной зоне (СГЗ), гранулированный слой клеток (GCL), и молекулярный слой (ML) с соответствующими антителами, используемыми на различных стадиях развития. Различные стадии развития включают в себя либо тихие или активированные радиальные нервные стволовые клетки (NSC), нервные прародители (NP), нейробласт (NB), незрелые клетки гранулы (GC), и зрелые GC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Демонстрация эффективной вирусной доставки. (A) Иммунофлуоресценция изображения точной вирусной доставки. Вирусные частицы выражают флуоресцентную этикетку mCherry, которая нацелена на замшелые клетки в хилусе (белой области). DAPI маркирует ядра клеток. Изображение стороны точной вирусной доставки демонстрирует четкие мшистые проекции волокна от контралатеральной стороны инъекций. (B) Иммунофлуоресценция изображения от целевых вирусных инъекций. Обратите внимание, что в этом случае контралатеральные мшистые волокна отсутствуют в стороне изображения. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ размножающихся нервных стволовых клеток и потомства. (A) Иммуногистохимия изображения тимидина аналог Эду colocalizing с конкретными маркерами стадии клеток nestin (нейронные стволовые клетки и прародители), Tbr2 (нервные стволовые клетки, нервные прародители), и DCX (нейробласт, незрелые нейроны) указано белые наконечники стрел. Шкала бар No 10 мкм. (B) Представитель измерения области в зубной извилине, используемой для расчета плотности. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Демонстрация иммунофлуоресценции. (A) Схема, демонстрирующая стерологическое разделение смонтированных секций тканей от передней к задней оси. Красная коробка обозначает боковую изображение. (B) Демонстрация успешных и суб-пар иммунофлуоресценции экспериментов для нейронных маркеров линии. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Контрлатеральная активация мшистых клеток уменьшает пролиферацию нервных стволовых клеток. (A) Иммуногистохимия количественной оценки клеток Nestin/Edu' в зубной извилине демонстрируют снижение пролиферации после стимуляции контралатеральных мшет клеток. (B) Снижение процента пролиферации нервных стволовых клеток в группе с активированными контралатеральными мшетными клетками. (C) Не было никаких значительных изменений в плотности нервных стволовых клеток в любой группе. (D) Не было никаких изменений в общих уровнях размножающихся клеток в зубной извилине. Значения представляют собой означает стандартную погрешность измерения. р Злт; 0,05 (n no 3 для управления, n no 5 для группы hM3D). Эта цифра была адаптирована из Yeh et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель этого протокола заключается в оценке того, как манипулирование конкретными нейронными схемами регулирует гиппокампа нейрогенеза в виво с помощью ряда методов иммуногистохимии. Анализ активности зависимой регуляции взрослого нейрогенеза, опосредоченного конкретными нейронными схемами, является ценным методом с большим потенциалом для модификаций для изучения широкого спектра нейронных цепей. Успех этих типов экспериментов зависит от нескольких факторов, включая точную вирусную доставку, правильный вирусный отбор для желаемых манипуляций, надлежащую доставку аналога тимидина, возраст животных, иммуностойкость эффективности, успешный транскардиальные перфузии, и объективная количественная количественная оценка изображений. Например, неточная вирусная доставка может вызвать целевые эффекты, которые приводят к фенотипу, не связанному с рассматриваемой схемой. Кроме того, методы иммунофлуоресценции низкого качества могут скрыть истинное количество присутствующих клеток и, следовательно, выпустить фенотип, который не является биологически актуальным. Другим очень важным фактором для контроля является возраст мышей при проведении экспериментов, учитывая, что взрослый нейрогенез зависит от возраста22. Наконец, важно, чтобы каждый раздел был объективно забит. Чтобы уменьшить предвзятость, принять методический подход и убедиться, что человек забил является опытным при определении этапов развития взрослых НСК с использованием морфологической информации. Кроме того, слепые как контроль и лечение групп и выявить их идентичности после изображения количественной оценки. В качестве дополнительной меры по снижению предвзятости два отдельных человека могут количественно оценить один и тот же набор данных для проверки наблюдаемых результатов.
Есть несколько ограничений, связанных с этим подходом к изучению цепи деятельности зависимых регулирования взрослых НСК и новорожденных потомства. Первое ограничение заключается в том, что этот подход не предоставляет информацию о конкретных типах клеток в цепи, которая посреднику общего влияния на NSCs от манипулирования схемой в вопросе. Это означает, что, хотя может быть фенотипическое воздействие на взрослых NSCs, эффект может действовать через один или несколько промежуточных типов клеток. Эффективный способ решения этой проблемы заключается в сопряжении этих исследований с электрофизиологией, чтобы приколоть посредников. Дополнительным ограничением этого протокола является необходимость иметь либо конкретную линию Cre mouse (5-HTR2A), либо вирусную конструкцию (AAV5-camKII-hM3d-mcherry), которая может быть нацелена на нужную схему. Если эффективная линия мыши Cre, связанная с ячейкой, не доступна для интересующегося вопроса, способность изучать эту схему становится все более сложной. Тем не менее, многие типы клеток в мозге имеют Cre конкретных линий мыши. Меньшее ограничение этого протокола связано с CNO как эффективным инертным лигандой. Недавно исследования показали, что CNO, инертное химическое вещество, используемое для активации DREADDs, усваивается в клозапин, который может вызвать поведенческие фенотипы23. Тем не менее, эффективный способ решения заключается в том, чтобы включить надлежащий контроль в каждом эксперименте. Пример надлежащего контроля включает в себя как CNO и DREADD управления, где CNO вводится в сочетании с вирусом диспетчера управления (AAV5-DIO-mCherry), и солен только контроль, когда не CNO вводят в группу репортера вируса. Включая эти элементы управления, последствия только CNO могут быть изолированы. Кроме того, вторичный инертный лиганд, известный как C21, недавно был продемонстрирован, чтобы иметь аналогичную эффективность и потенцию без продемонстрировали поведенческие эффекты24. Наконец, окончательное ограничение этого протокола контролирует количество CNO, что каждое животное потребляет в ходе эксперимента. Различные животные пьют CNO-содержащую воду в различной степени и, следовательно, может иметь целый ряд эффектов на взрослых нейрогенеза. В целом, мышь, как правило, пьют около 4 мл воды CNO в период 24 ч. Это означает, что при концентрации 1 мг/200 мл животные получают в общей сложности 0,02 мг CNO в день, что сопоставимо с количеством одной дозы CNO, вводимой интраперитонеально. Если своевременное совместное введение CNO является проблемой, переход на интраперитонеальные инъекции может быть лучшей альтернативой.
Преимуществом использования этого протокола является степень специфичности, достигнутая при модуляции взрослого нейрогенеза. Прошлые исследования нейрогенеза использовали системно управляемый фармакологический агонист или антагонист для модулирования компонентов цепи. Эти неспецифические манипуляции могут привести к фенотипическим различиям, но дают мало информации о механизмах, участвующих в регуляции стволовых клеток взрослых. Кроме того, этот протокол может быть легко изменен для исследования различных схем широкое воздействие на взрослых нейрогенеза. Например, переключившись на ингибирующее DREADD, или нацелившись на один или несколько областей мозга одновременно, можно задать множество вопросов, чтобы понять схему специфической регуляции взрослого нейрогенеза. Еще одним преимуществом использования этого протокола по сравнению с предыдущими подходами является то, что использование антитела гнездина устраняет трансгенное разведение животных флуоресцентно закодированных нейронных стволовых клеток репортеров, таких как nestin:GFP, повышение эффективности и сокращение времени на эксперимент8. Кроме того, этот метод ограничивает обработку грызунов при применении CNO, что снижает стресс грызунов во время экспериментов. Важно смягчать стресс при изучении чувствительных к стрессу процессов. Наконец, этот подход легко изменить, чтобы включить поведенческий тест, например, если один был заинтересован в вопросе, если контралатеральный мшистых клеточной цепи, которая модулирует NSCs также играет роль в пространственном обучении или стрессустойчивости.
Основной технической сложностью при использовании этого подхода является точная вирусная доставка. Стать опытным хирургом грызунов занимает практику и может принять значительные устранения неполадок. Поэтому целесообразно выполнить серию экспериментальных экспериментов для тестирования вирусного титра, эффективности маркировки и вирусного распространения. Мы обнаружили, что некоторые серотипы имеют различные модели распространения и что серотип AAV2 распространяется меньше, чем AAV5 или AAV8. Кроме того, лучше иметь надежного поставщика вирусной упаковки для каждого из этих экспериментов. Выполняя пилотные операции, многие из этих проблем могут быть решены, и можно сэкономить время. Также рекомендуется, чтобы один тест различных концентраций CNO, чтобы стимулировать или ингибировать желаемые схемы. В целом, 1 мг/кг достаточно активирует проверенные схемы, но некоторые типы клеток могут потребовать более или менее CNO. Важно отметить, что доза введения CNO может дифференарно влиять на определенные схемы, особенно при взгляде на что-то вроде мшистых клеток15.
Альтернативные применения этого протокола включают одновременное поведенческое тестирование, модуляцию альтернативных схем и дополнительный анализ функций нейрогенеза. Для выполнения поведенческого тестирования можно следовать описанному протоколу и после введения CNO выполнить определенную поведенческую задачу, такую как анализ местоположения романа или задачу пространственной навигации. Преимущество этого подхода заключается в том, что один эксперимент даст как поведенческую, так и цепную конкретную информацию, которая может привести к контуру специфического поведенческого фенотипа. Для модулирования альтернативных схем можно использовать комбинацию различных линий Cre и вирусных векторов. Например, если бы кто-то был заинтересован в понимании того, как ингибирование дофаминергических нейронов из брюшной тегментальной области (VTA) или VTA модулирует взрослый нейрогенез, можно было бы использовать тирозин гидроксилазы Cre мыши линии и вводить Cre зависимых hM4D (ингибитор) DREADD вирус в VTA для определения дофаминергической специфической регуляции взрослых нейрогенеза. Возможности для целевой альтернативных областей мозга, используя этот подход огромны и могут быть стратегически использованы для допроса убедительных нейронных цепей. Наконец, такой подход позволяет исследовать дополнительные стадии взрослого нейрогенеза. Если, например, хотел понять, как стимулирование мшистых клеток влияет на беседку или дендритную длину незрелых нейронов, можно было бы следовать аналогичному протоколу, но выполнять альтернативный анализ, такие как анализ шхола.
Таким образом, этот протокол обеспечивает подробный пошаговой процесс для проверки цепи деятельности зависимых регулирования взрослых NSCs и нейрогенеза с помощью технологии DREADD. Сила этого протокола заключается в его способности быть легко изменены для решения широкого круга вопросов, касающихся цепи конкретных взрослых нейронных стволовых клеток регулирования. С продвижением кластерных регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) технологии, в настоящее время легче генерировать клетки конкретных Cre мыши линий в паре с сложными вирусных конструкций для решения все более сложные вопросы расширение применимости этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Л.Д.З. была поддержана Национальным институтом психического здоровья Национальных институтов здравоохранения в соответствии с дополнением к разнообразию R01MH111773, а также грантом T32 на обучение T32NS007431-20. Этот проект был поддержан из грантов, присужденных J.S. от NIH (MH111773, AG058160 и NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Roth, B. L.
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
