Summary
В этом методе эмбриональных тканей сердца являются хирургическим microdissected, отделить, дневно помечены и имплантируется в принимающей эмбриональных тканей. Это обеспечивает платформу для изучения отдельных тканей уровня развития Организации или внематочная гемодинамических условий, и/или изменены паракринными/juxtacrine сред.
Abstract
Интерпретация относительное влияние автономной патронирования клетки против внешняя microenvironmental влияние на определение линии клеток представляет собой общий вызов в биологии развития исследований. В самом зачаточном состоянии это может быть особенно трудно, как региональные различия в выражении транскрипционный анализ регуляторов, паракринными/juxtacrine сигнализации сигналы, и гемодинамических силы известны влиять cardiomyocyte созревания. Таким образом, упрощенный метод, чтобы изменить развивающихся cardiomyocyte молекулярной и биомеханических микроокружения послужит мощным инструментом для изучения местных условий влияние клеток судьба и функции. Для решения этой проблемы, мы оптимизировали способ физически трансплантировать несовершеннолетних кардиомиоцитов в внематочная места в сердце или окружающих эмбриональных тканей. Это позволяет нам рассматривать как microenvironmental влияние условий cardiomyocyte судьба переходы в одну ячейку резолюции в рамках нетронутыми эмбриона. Здесь мы описываем протокол, в котором эмбриональных миоцитах может быть изолирован от целого ряда сердечных суб-доменов, отделить, дневно помечены и microinjected в принимающей эмбрионов с высокой точностью. Клетки могут затем быть непосредственно проанализированы на месте, с использованием различных методов обработки изображений и гистологические. Этот протокол является мощной альтернативой традиционным прививочных экспериментов, которые могут быть чрезмерно сложной в движущейся ткани, такие как сердце. В общих чертах этот метод также может быть адаптирована к различных средах размещения и тканей донора и его простота использования, низкая стоимость, и скорость делают его потенциально полезное приложение для целого ряда исследований в области развития.
Introduction
Сердца развития исследований чрезвычайно выиграли от появления микрофлорой трансгенные модели систем, которые определили многие из генных сетей регулирования, что шаблон различных клеточных линий и функциональные домены в самом сердце. Однако определение как эти генных сетей взаимодействовать с и реагировать на microenvironmental условиях, включая паракринными/juxtacrine сигналов и биофизических входы (стрейч, штамм, гемодинамики потока), может быть сложным. Таким образом это не всегда легко определить ли клеточном фенотипу возникает как прямое следствие генетического возмущений или побочным результатом адаптации к изменениям в сердечной биомеханики или выше порядок ткани состав1,2 .
Прививка экспериментов, которые классически были использованы для адрес понятия судьбы спецификации, приверженности, индукция и компетенции3,4, будет представлять идеальный подход для обхода некоторых из проблем, присущих определение в самом сердце клетки автономной против влияния окружающей среды. К сожалению сердечных сокращений затрудняют стандартные прививочных подходы. Быстрое движение ткани часто предотвращает привитые клетки от присоединения к сердцу и большие ткани проколов (обычно требуется для прививки) часто приводят к сердечной недостаточности и эмбриональных летальность5,6,7. Таким образом мы разработали на основе давления, микроинъекции системы для точности сотовой имплантации в развивающихся куриных сердце, обойти технические препятствия трансплантации тканей описанные ранее8,9. Используя эту технику, отдельных лиц или небольших групп сердечной клетки изолированы от эмбриона донора может быть microinjected в различных регионах хост эмбриональных сердца, устраняя необходимость подготовки обширные хост и большой ткани оскорбления, которые возникают с использованием стандартные методы прививочных. Микроинъекции иглы, используемые для этих исследований имплантации имеют наружный диаметр ~ 30−40 мкм, что означает, что иглы могут быть размещены непосредственно в ткани-мишени (то есть, могут проникать эмбриональных миокарда стены) и клетки могут поставляться централизовано с минимальное повреждение окружающих тканей. Протокол может использоваться для выполнения различных изотопов, heterotopic, Изохорный и heterochronic манипуляций, обеспечивая быстрое, гибкое и лоу кост подход непосредственно изучить классических экспериментальных эмбрионального парадигмы в развивающихся 4-сердце.
В протоколе, изложенные ниже, мы обозначаем доноров клеток с ячейки permeant Флюоресцентная краска, которая позволяет в режиме реального времени наблюдать за успех эксперимента микроинъекции и расположение прижившимися клетки, чтобы быть документально без необходимости для любого дополнительного пятнать. Следует, однако, отметить, что такой подход лучше всего подходит для краткосрочных экспериментов (около 48 ч) как Флюоресцентная краска может быть потеряны через деление клеток. Альтернативные подходы могут использоваться для долгосрочной перспективе экспериментов.
Хотя мы представляем эту технику в контексте развития сердца, мы использовали его для большой эффект для клеток экспериментов имплантации в мезодермы, головы, конечностей и сегменты. Таким образом основной подход, описанный ниже весьма шансов справиться с возникающими и может использоваться в различных органов и систем.
Protocol
Все методы, описанные соблюдать руководящие принципы ухода за животными в Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл.
1. Подготовка микро инъекции пипетки
- Вытяните стеклянных капилляров с помощью микропипеткой съемник. Для некоторых инъекции игла фаски рекомендуется как она обеспечивает чрезвычайно острые поверхности лишено структурных примесей. Для этого, польский конце вытащил иголку на колесо фаски под углом 45 ° для 15−20 минут.
Примечание: Точные настройки для буксировки будет меняться в зависимости от съемник используется. Последний внутренний диаметр скоса должна быть между 20−40 мкм. - Герб внутренних и внешних поверхностей стеклянный капилляр с силиконом. Сначала опустите иглы в siliconizing агент для покрытия внешней поверхности иглы, а затем валидатор siliconizing агент решения в каждом микропипеткой для покрытия внутренней поверхности.
Примечание: Покрытие стеклянных капилляров должно быть сделано 24 ч до имплантации эксперимент. Покрытие стекла капилляров с силиконовой обеспечивает химически инертный поверхности стекла. Если остаются капилляров необработанной, суспензию клеток, образующихся в последующих шагах будет придерживаться стекла и вставьте иглу. Таким образом покрытие является необходимым и жизненно важным для успеха метода.
Предупреждение: Siliconizing агент является смесью коммерчески доступных готовых гептана и 1,7-дихлор-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Таблица материалов). Это чрезвычайно легковоспламеняющиеся и острой токсичностью. Всегда обращаться с надлежащей СИЗ внутри зонта.- На тыльной стороне иглы, нагрузка ~ 5−10 мкл siliconizing агента в кончика пипетки микро инъекции (Таблица материалов). Место кончике микро инъекции в широкий конец вытащил стекла капилляров и Расположите наконечник как далеко вниз как можно скорее (недалеко от кончик иглы стекла). Удаляя медленно загрузки дозаторов для того, чтобы свести к минимуму пузырьков воздуха в иглу извлечь siliconizing агент.
- Оставить siliconizing агента в стеклянных иглу за 10 мин, удалить, аспирационных с новой загрузки дозаторов и позволяют иглы высохнуть на ночь в зонта.
- Утром эксперимента, промойте деионизованной воды после процедуры на шаге 1.2 стеклянные капилляры и дайте высохнуть на 3−4 h.
2. Приготовление растворов
- Подготовьте 5 мл трипсина, нейтрализуя решение путем дополнения 4.2 мл Дульбекко изменение орла средних и ветчиной в питательной смеси F12 (DMEM/F12) с 750 мкл плода Bovine сыворотки (ФБС) и 50 мкл пенициллина/стрептомицина. Хранить при 37 ° C до использования.
- Подготовить 5 мкм, маркировки раствор красителя, дозирования 5 мкл акций 1 мм, маркировки краситель (в диметилсульфоксида [ДМСО], Таблица материалов) в 995 мкл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS). Вихрь за 1 мин и хранить при 37 ° C до использования.
- Подготовьте свежие параформальдегида (PFA) путем объединения 10 мл 32% PFA Стоковый раствор с 62 мл воды молекулярной биологии класса и 8 мл 10 x Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS). Конечная концентрация составляет 4% ПФА в 1 x DPBS.
3. Подготовка принимающей эмбрионов
- Инкубируйте плодородные куриные яйца в горизонтальной ориентации в увлажненные инкубатор 38 ° C до гамбургеров и Гамильтон (HH) этап 1910.
Примечание: Этап, выбрали для манипуляции является гибкой и полностью зависит от цели каждого индивидуального эксперимента. - Оценка «плоского» конец яичной скорлупы вдоль экватора яйцо с помощью угловой щипцы сделать небольшой прокол > 1 мм в диаметре. Вставьте иглу 18 G с прилагаемой 10 мл шприц через прокол и удалить ~ 5 мл альбумина.
Примечание: Это анатомическое расположение является внешним по отношению к «воздушные ячейки» внутри яйца и предотвращает утечки после пункции альбумина. Этот шаг рекомендуется как он «падает» эмбриона от яичной скорлупы, предотвращая потенциальный ущерб в последующих шагах. - Применить прозрачную ленту к верхней части скорлупы яиц. Оценка угловой пинцетом и прорубил окно ~2.5 см ножницами изогнутые тенотомия.
- Инспектировать и стадии эмбриона, основанные на критериях, установленных гамбургер и Гамильтон10 и герметизации проколов на шаге 3.2 с прозрачной лентой.
Примечание: Здесь, этап HH 19 эмбрионов используются, которые имеют 37−40 сегменты в зародыше хвост. Прокол не должны быть закрыты до, после открытия окна в верхней части яйцо (шаг 3.3). - Придать ~ 200 мкл чернил Индии/HBSS смесь (1:5) под эмбрионов, с помощью иглы 32 G с прилагаемой 1 мл шприц.
Примечание: чернила Индии обеспечивает визуальный контраст между зародышем и желток под. Альтернативные краски как нейтрального красного или коммерчески доступных голубой флуоресцентный белок (СЛП) или наборы фильтров флуоресценции синий флуоресцентный белок (БПС) может использоваться для улучшения контрастности. - Добавьте 1 mL HBSS каплям на эмбриональных диск и уплотнение оконных снаряды с парафином фильм. Поместите яйца обратно в увлажненные инкубаторе до готовности для инъекций.
4. изоляция донорской ткани
- Инкубируйте доноров плодородные куриные яйца в увлажненные инкубатора в 38 ° C до стадии HH 19 (или нужный этап).
- Удаление эмбриона из яйца и место в чашке Петри 100 мм х 15 мм, содержащие стерильные HBSS при комнатной температуре (RT).
- Хирургическим microdissect предсердий доноров ткани от каждого эмбриона сначала изоляции всей эмбриональных сердце из эмбриона и затем изолируя предсердий сердца с помощью щипцов, тенотомия ножницы и microspatula под стерео, рассекает микроскопом. Бассейн в стерильных 1,5 мл microcentrifuge тубы с 1 мл раствора HBSS на льду.
- После того, как были собраны все донорской ткани, окатышей ткани центрифугированием на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C в фиксированный угол microcentrifuge.
5. Пищеварение трипсина доноров ткани
- Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл подогретую трипсина 0,05%-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C 15 мин в блоке пожимая тепла в 300 об/мин. Кроме того используете на водяной бане с периодическим перемешиванием образца.
- Пипетка пищеварение решение вверх и вниз, чтобы разрушить любые оставшиеся ткани и Пелле как в шаге 4.4.
- Ресуспензируйте гранулы в 1 мл трипсина, нейтрализации раствора и центрифуги как в шаге 4.4.
- Ресуспензируйте клетки в 400 мкл красный люминесцентные маркировки раствор красителя и инкубировать при 37 ° C 20 мин в блоке тепла. Кроме того используете на водяной бане.
- По окончании обозначая реакции Пелле клетки как в шаге 4.4 и мыть с 1 мл раствора HBSS (количество мыть шаги может изменяться от 1 до 3).
- Ресуспензируйте Приклеенные этикетку, гранулированных клетки в концентрации ~ 50 000 клеток/мкл, что обычно приводит к 5−10 мкл рабочего объема в зависимости от урожайности ячейке.
Примечание: Концентрации клеток ниже ~ 50 000 клеток/мкл может привести к плохой инъекции эффективности.
6. в vivo инъекций
- Валидатор банкнот BackLoad суспензию клеток в Силиконовой обработанного стекла капиллярные пипетки после процедур, описанных в шаге 1.2. Смонтируйте пипеткой в аппарате microinjector давления.
- Снять хост эмбрионов увлажненные инкубатора и место в яйцо держатель под люминесцентные стерео, рассекает микроскопом.
- Открыть vitelline мембраны, с использованием стерильных тонкой щипцами и сделать небольшой надрез (~0.5−1.0 мм в длину) в перикарда. Дополнительные манипуляции/диссекции может быть необходимо в зависимости от целевого региона для инъекций.
- Позиция microinjector, таким образом, чтобы кончик иглы микроинъекции проникает в ткани-мишени.
- Давление вставки ячейки и использовать флуоресцентные метки, чтобы определить, что имплантированные клетки присутствуют в желаемой ткани. Для типичных инъекции, применять единый импульсов меньше, чем 0,5 s в срок, начиная от 100-400 hectopascals давления.
Примечание: Длительность импульса и абсолютное давление будет варьироваться в зависимости от количество клеток для инъекций и могут быть изменены с учетом индивидуальных потребностей. - Убрать аппарат microinjector и удалите яйцо из держателя после инъекции давление.
- Давление вставки ячейки и использовать флуоресцентные метки, чтобы определить, что имплантированные клетки присутствуют в желаемой ткани. Для типичных инъекции, применять единый импульсов меньше, чем 0,5 s в срок, начиная от 100-400 hectopascals давления.
- Добавьте 1 mL теплого HBSS каплям на эмбрион, печать с использованием прозрачной упаковочной ленты яйца и инкубировать в увлажненные инкубатора в 38 ° C для имплантации пост 24 h.
7. изоляция и анализ
- Изолировать хост эмбрионов в HBSS RT, используя пинцет, тенотомия ножницы и microspatula похоже на шаг 4.3 и исправить в 4%, PFA на ночь при 4 ° C с плавное покачивание.
- Промыть плавное покачивание эмбрионы 3 x 5 мин, в HBSS на RT и хранить в HBSS на 4 ° C для дальнейшего течению анализа (микроскопия, иммуногистохимия, гибридизации in situ и т.д.).
Representative Results
После 24 ч инкубации, сердце и объемного ткани узла эмбрионы были изолированы, сфотографировали (рис. 1A) и обработаны для immunofluorescent анализа. В этом примере миоцитах предсердий доноров были microinjected в proepicardium же поставил хоста эмбриона. Эмбриона хост был затем витражи с маркером мышц (MF20 зеленый) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; синий). Вводили клетки (красный) являются четко видны (рис. 1Б). Возможные корректировки для рассмотрения, если клетки не видны включают: донорской ткани более переваривается (клетки будет не в состоянии приложить), маркировки раствор красителя был слишком разреженных, клетки были чрезмерно промывают, или несколько клеточных делений привели к потере метки.
Чтобы подтвердить, что вводили клетки в этом примере были миокарда, мы оптически секционного этот эмбрион с помощью конфокального микроскопа (C-Eрис. 1). Только позитивные клетки MF20 в proepicardium (PE) являются флуоресцентные красный позитивные клетки, которые были имплантированы централизовано.
Рисунок 1 : Представитель изображения эмбрионов изолированные 24 часа пост инъекций. (A) малое увеличение brightfield изображение области ствола эмбриона куриных E3.5 (HH этап 19). (B) Merged изображения показаны вводили клетки (красный), кардиомиоцитов (зеленый) и DAPI. Клетки были изолированы от предсердий и microinjected в proepicardium. (C) конфокальная томография высокого увеличения показаны помечены клетки в ядро proepicardium. (D) высокое увеличение конфокальная томография подтверждающие КТ красной меткой клетки являются кардиомиоцитов. (E) трехмерной (3D) реконструкция вводили клетки из панелей, D и E. В, предсердиями; УДК, отток тракта; PE, proepicardium; VT, желудочка; MF20, миозин 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Возможность определения как microenvironmental условий воздействия сердечной клетки судьба спецификации и линии стабилизации имеет основополагающее значение для создания компрессионных понимание врожденный порок сердца, а также относительно разработки эффективных протоколов для правильного созревание стволовых клеток или соматической клетки перепрограммирования основе кардиомиоцитов. Протокол изложенные выше дает следователей, возможность непосредственно анализа развития сердечных клеток под изменены в естественных условиях условий, позволяя для процессов автономной созревания клеток должны быть отделены от паракринными/juxtacrine и/или гемодинамики подсказки. В сочетании с высоким разрешением изображения, генетический анализ и физиологических анализов, этот метод может служить мощным дополнением к существующим transgenic моделей.
Форма технического стоять точка, протокола, представленные здесь зависит от эффективной изоляции, маркировки и точные имплантации в принимающей эмбриональных тканей донора клеток сердца. Использование системы микроинъекции значительно СПИДа в ориентации клеток донора и позволяет для успешной имплантации без необходимости создания сайта большой приживления в ткани узла. Некоторые оперативных навыков, необходимых для выполнения этот метод, однако, как снижение жизнеспособности может привести, если тщательно инъекционной иглы не помещается в ткани-мишени (вызывая разрыв сердца или местных сосудистую). Для изоляции и маркировки шаги следует также уход и мысли. Над перевариванию доноры ткани может привести к плохой имплантации эффективности, и переходные маркировки методы можно ограничить время окно, над которым доноров клеток могут быть отслежены (как деление клеток можно разбавить этикетке).
Этот метод является весьма изменяемым и может быть адаптирована для различных целей. Например доноров клетки от широкий спектр тканей и этапов может быть изолирован (хотя требуется оптимизация ферментативного пищеварения) и аналогичным образом быть введены в различных тканях хост на различных этапах развития. Аналогично обозначая подход может быть изменен отслеживать клетки на различных временных окон, включая использование флуоресцентных неорганических полупроводниковых нанокристаллов больше временной маркировки и имплантации перепелиные клетки или клетки от Грин флуоресцентный белок трансгенных (GFP +) донорских эмбрионов11 для permeant нанесения этикеток.
Хотя в настоящее время мы используем этот метод для исследования птичьего имплантации, мы считаем, что он может использоваться для большого круга химерных исследований в будущем. Например генетически измененных сердечной клетки от трансгенных организмов могут изолированные и microinjected в птичий сердце с помощью весьма аналогичный протокол. Кроме того клетки делятся на кардиомиоцитов из стебли клетки или через соматические клетки перепрограммирования подходы могут microinjected в эмбриональных сердце, чтобы оценить их интеграции в ткани и/или созревания под в-vivo биомеханических условий.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грант R00HL122360 от национальных институтов здравоохранения, национальной сердца, легких и крови института (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
- Guo, Y. X., Pu, W. T. Genetic Mosaics for Greater Precision in Cardiovascular Research. Circulation Research. 123, 27-29 (2018).
- Guo, Y. X., et al. Analysis of Cardiac Myocyte Maturation Using CASAAV, a Platform for Rapid Dissection of Cardiac Myocyte Gene Function In Vivo. Circulation Research. 120 (12), 1874-1888 (2017).
- Rugh, R. Experimental embryology; techniques and procedures. 3rd edition. , Burgess Pub. Co. (1962).
- Slack, J. M. W. Essential developmental biology. 3rd edition. , Wiley. (2013).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murray, C. E. Survival, integration, and differentation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Rojas, S. V., et al. Transplantation of purified iPSC-derived cardiomyocytes in myocardial infarction. PLOS ONE. 12, 0173222 (2017).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte Grafting for Cardiac Repair: Graft Cell Death and Anti-Death Strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Bressan, M., Liu, G., Mikawa, T. Early mesodermal cues assign avian cardiac pacemaker fate potential in a tertiary heart field. Science. 340 (6133), 744-748 (2013).
- Bressan, M., et al. Reciprocal myocardial-endocardial interactions pattern the delay in atrioventricular junction conduction. Development. 141 (21), 4149-4157 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
