Summary
この方法では胚の心臓組織は外科的 microdissected、解離、蛍光標識、そして宿主胚性組織に注入です。これは個人または組織レベル発達組織下異所性血行力学的条件、および/またはパラクリン/juxtacrine 環境の変化を研究するためのプラットフォームを提供します。
Abstract
発生生物学研究では一般的な挑戦を表す細胞系列決定影響の外因性アイソレータケージ対セル自律形成の相対的な影響の解釈。萌芽期の心これパラクリン/juxtacrine シグナリング キュー、転写制御因子の発現の地域差として特に難しいことし、血行力学的力のすべての心筋細胞の成熟に影響を与える知られています。発展途上の心筋細胞の分子および生体力学的微小環境を変更する簡易メソッドは、したがって、ローカル条件の影響細胞運命と機能を検討する強力な手法として機能します。これに対処するため、我々 は物理的に心臓や胚の周囲の組織に異所性の場所に若年性心筋細胞を移植する方法を最適化してきました。そのまま胚内の単一セルの解像度でどのようにアイソレータケージ条件影響心筋細胞運命遷移を調べることができます。ここでは、胚細胞様々 な心臓のサブドメインから分離された、解離、蛍光に分類でき高精度な宿主胚に microinjected プロトコルについて述べる。細胞を直接分析できますさまざまなイメージングおよび組織学的手法を使ってその場で。このプロトコルは、心など移動組織で極めて困難にすることができます従来の移植実験に強力な代替手段です。このメソッドの一般的なアウトラインは、ドナー組織およびホスト環境の多様性とその低コスト、使いやすさに合わせることができるもと速度は、発達的研究のさまざまな潜在的に有用なアプリケーション。
Introduction
心の発達研究はそのパターンの異なる細胞系譜と心の機能ドメインを識別遺伝子調節ネットワークの多くが生殖トランスジェニック モデル システムの登場から非常に恩恵を受けています。ただし、識別するこれらの遺伝子ネットワークと対話内微小環境条件への対応どのようにパラクリン/juxtacrine 信号と生物物理入力 (ストレッチ、歪み、血行の流れ) を含むことです。それは常に心臓バイオメカニクスのより高い順序組織組成1,2 に変更する、細胞表現型発生遺伝的摂動の直接の結果として、または適応の二次の結果としてかどうかを調べるは簡単でないなど、.
接木実験は、古典的な運命仕様の概念をアドレスに使用されている、コミットメント、誘導と能力3,4を表すいくつかの固有の課題を回避するために理想的なアプローチ中心部に細胞自律的に環境影響とを定義します。残念ながら、心臓の収縮にすると標準的な移植方法は難しくなります。組織の急速な動きはしばしば中心部に付着するから移植細胞を防止し、大規模な組織は、(通常は接木に必要な) 刺し傷頻繁心不全および胚性致死5,6,7に 。したがって、圧力ベースを開発した、組織移植の技術的なハードルを回避成長のひよこの中心に精度細胞移植へのマイクロインジェクション システムは前述8,9。この手法を使用すると、ドナー胚心筋細胞の個々 か小さいグループは広範なホストの準備とを使用して発生する大規模な組織の侮辱のための必要性を排除するホスト胚中心の地域の多様性に microinjected することができます。術の基本手技。これらの注入用マイクロインジェクション針の外径を持ちます ~ 標的組織に直接針を配置できることを意味する 30−40 μ m (すなわち、胚心筋壁を貫通することができます)、細胞が塊状で配信できます周囲の組織に与えるダメージを最小限。プロトコルを使用して様々 な同位体、異所性、isochoric、開発途上で古典的な実験発生学的パラダイムを直接調べる迅速、柔軟かつ低コストのアプローチを提供する heterochronic 操作を実行できます。4 chambered 中心。
下記プロトコルを我々 はラベル ドナー、マイクロインジェクション実験の成功のためリアルタイムで監視することができます携帯側の透過物蛍光色素と細胞といずれかを必要とせず記載する明らかな移植細胞の場所追加染色。ただし、このアプローチが短期的実験 (約 48 時間) に最適蛍光色素は細胞分裂によって失われることができます。代替アプローチは、長い用語実験に使用できます。
心臓開発のコンテキストでは、この手法を紹介して中を使いましたそれ大きな効果を細胞移植実験の中胚葉、頭や手足、体節に。よう下記の基本的なアプローチが非常に扱いやすいと様々 な臓器システムで使用できます。
Protocol
記載されているすべてのメソッドは、動物のケアのガイドラインのノースカロライナ大学チャペルヒル校に従います。
1. マイクロ インジェクション ピペットの準備
- マイクロ ピペットの引き手を使用してガラス管を引き出します。いくつかの注射のため不純物の構造に欠けている非常にシャープな表面を提供するので針に斜角はお勧めします。これを行うには、ポーランドの 15−20 分の 45 ° の角度で面取りホイールに引っ張られた針の終了を実行します。
注: を引っ張るための正確な設定が使用されている引き手に基づいて異なります。ベベルの最終の内径は、20−40 μ m の間でなければなりません。 - シリコーン ガラスキャピラリの内部および外部の表面をコートします。まず針し内面塗装、各ピペットに backload 反応のエージェント ソリューションの外部の表面をコートする反応剤で針を浸しなさい。
注: コーティング ガラス管の注入実験の前に 24 時間を行う必要があります。シリコーンとガラス管をコーティング ガラスに化学的に不活性な表面を提供します。毛細血管が残っている場合、未処理細胞懸濁液の後の手順で生成されたガラスに付着、針を差し込みます。したがって、コーティングは必要とメソッドの成功に不可欠です。
注意: 反応のエージェントは、ヘプタンと 1, 7-ジクロロ-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (材料表) の既製市販の混合物です。非常に可燃性、急性毒性です。常に適切な PPE ヒューム フードの中で処理します。- Backload 針、ロード ~ マイクロインジェクション ピペット チップ (材料表) に反応剤の 5−10 μ L。マイクロ射出成形の先端をキャピラリー引っ張られたガラスのワイド端で配置し、(ガラス針の先端) に近い可能な限りダウン限り先端の位置します。針で気泡を最小限に抑えるため読み込みピペットをゆっくりと除去しながら反応剤を取り出します。
- 10 分間ガラス針で反応剤を残す新しい読み込みピペットで吸引によって削除し、針は発煙のフードで一晩乾燥を許可します。
- 実験の朝は 1.2 のステップの手順に従って脱イオン水でガラス管をすすいで 3−4 h 間乾かします。
2. 溶液の調製
- 4.2 mL ダルベッコ変法イーグル培地とハムの栄養混合物 F12 (DMEM/F12) 750 μ L の胎仔ウシ血清 (FBS) とペニシリン/ストレプトマイシンの 50 μ L を補うことでソリューションを中和トリプシンの 5 mL を準備します。使用するまで 37 ° C で保存します。
- 準備 5 μ M にハンクの 995 μ (ジメチルスルホキシド [DMSO]テーブルの材料) で色素をラベル付け 1 mM 在庫の 5 μ L 分注による色素溶液をラベリング平衡塩類溶液 (HBSS)。1 分と使用までの 37 ° C でストアの渦。
- 62 ml 分子生物学グレード水・ ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) x 10 の 8 mL 32 %pfa 原液 10 mL を組み合わせることにより新しいパラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。最終濃度は 4% PFA 1 x DPBS で。
3. 宿主胚の作製
- 38 ° C までハンバーガーとハミルトン (HH) ステージ 1910加湿のインキュベーターで水平方向に肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。
注: 選択操作の段階は柔軟性があり、それぞれの個々 の実験の目的に全く依存しています。 - 「フラット」鉗子を使用して小さなパンクにする卵の赤道に沿って卵の殻末のスコア > 直径 1 mm。穴を通して接続されている 10 mL 注射器、18 G 針を挿入し、アルブミンの ~ 5 mL を削除します。
注: この解剖学的位置は卵の中の「空気電池」の外部にある、アルブミンが漏れ一度穿刺が行われるを防ぎます。以降の手順で潜在的な損傷を防ぐため、卵の殻から胚を「ドロップ」とは、この手順をお勧めします。 - 卵の殻の上に透明テープを適用します。鉗子とスコアし、湾曲した腱のはさみを使って ~2.5 cm ウィンドウをカットします。
- 検査しハンバーガーとハミルトン10によって確立された基準に基づく胚のステージし、透明テープでステップ 3.2 から穿刺をシールします。
注: ここでは、HH 19 段階の胚は使用される尾芽に拡張する 37−40 の体節があります。卵 (ステップ 3.3) の上部にあるウィンドウを開いた後、まで穿刺を密封しないべきであります。 - 添付 1 mL 注射器 32 G の針を用いて胚の下にインドのインク/HBSS 混合物 (1:5) の ~ 200 μ L を注入します。
注: インドのインクは、胚と下に卵黄と視覚的なコントラストを提供します。中立または市販の赤シアンの蛍光蛋白質 (CFP) など代替染料またはコントラストを改善するために青い蛍光タンパク質 (BFP) 蛍光フィルタ セットを使用ことができます。 - 胚ディスク上に滴下 HBSS の 1 mL を追加し、ウィンドウ シェル パラフィン フィルムをシールします。注射の準備ができるまで、加湿のインキュベーターに卵を配置します。
4. ドナー組織の分離
- ステージ HH 19 (または必要な段階) までの 38 ° C で加湿のインキュベーターでドナー肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。
- 卵から胚を取り出し、室温 (RT) で滅菌 HBSS を含む 100 mm × 15 mm のペトリ皿に置きます。
- まず胚から胚心臓全体を分離し、心の底から心房を分離することによってステレオの解剖顕微鏡の下で microspatula、腱はさみ鉗子を使用してそれぞれの胚から、心房ドナー組織を外科的 microdissect。氷上 HBSS の 1 mL を含む滅菌 1.5 mL 遠心チューブにプール。
- すべてのドナー組織が収集されると、組織の固定角度遠心機で 4 ° C で 5 分間 1000 × gで遠心分離によってペレットします。
5 ドナー組織のトリプシンの消化力
- Prewarmed 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します、300 rpm での振動熱ブロックで 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。また、サンプルの定期的な撹拌で水浴を使用します。
- 残りの任意の組織を分割し、ステップ 4.4 のようにペレットを上下に分解酵素液をピペットします。
- ソリューションとステップ 4.4 のように遠心分離機を中和トリプシンの 1 mL にペレットを再懸濁します。
- 赤蛍光色素溶液を標識の 400 μ L で細胞を再懸濁します、ヒート ブロックの 20 分の 37 ° C で孵化させなさい。また、水浴を使用します。
- ラベリングの反応が完了すると、ステップ 4.4 のように細胞をペレットし、HBSS (手順 1 と 3 の間に変えることができる洗浄の数) 1 mL で洗います。
- ~ 50,000 細胞/μ L、一般的に総細胞収量によって 5−10 μ L 作業量の結果の濃度のラベルが付いた、小球形にされた細胞を再懸濁します。
注: ~ 50,000 細胞/μ L 以下の細胞濃度は貧しい注入効率につながります。
6. 体内注入
- 手順手順 1.2 にシリコーン扱われたガラス毛細管ピペットに細胞懸濁液を backload。圧マイクロインジェクター装置にピペットをマウントします。
- 加湿インキュベーターから宿主胚を取り外し、解剖顕微鏡蛍光ステレオの下に卵ホルダーに入れます。
- 滅菌微細鉗子による卵黄膜を開き、心膜に小切開 (長さ ~0.5−1.0 mm) を加えます。注入の対象地域によって追加操作/郭清は必要かもしれない。
- ガラスシリンジ マイクロインジェクション針の先端を貫通標的組織に移動します。
- 圧力細胞を注入し、蛍光ラベルを使用し、移植細胞が必要な組織に存在します。典型的な注射用 0.5 未満の単一パルスを適用圧力の 100-400 ヘクト パスカルに至る期間で s。
注: パルス長および絶対圧注入する細胞の数によって異なりますが、個々 のニーズに合わせて変更することができます。 - マイクロインジェクター装置を撤回し、圧力を注射した後、ホルダーから卵を削除します。
- 圧力細胞を注入し、蛍光ラベルを使用し、移植細胞が必要な組織に存在します。典型的な注射用 0.5 未満の単一パルスを適用圧力の 100-400 ヘクト パスカルに至る期間で s。
- 胚に暖かい HBSS の 1 mL を滴下追加、透明梱包用テープを使用して卵をシール、24 h のポスト注入の 38 ° C で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
7. 単離と解析
- Microspatula 4.3, 手順と同様に、腱はさみ鉗子を使用して RT HBSS の宿主胚を特定し、4 %pfa は、穏やかな揺動 4 ° C で一晩で解決。
- 穏やかなロッキング常温 HBSS で胚 3 x 5 分を洗って、HBSS でさらに下流解析 (顕微鏡観察、免疫組織化学の現場の交配等) のための 4 ° C に保存します。
Representative Results
ホストの 24 h のインキュベーション、心臓とサラウンドの組織後胚は分離した、撮影 (図 1A)、および免疫蛍光分析の処理します。この例ではドナー心房筋細胞は同じような段階的なホストの proepicardium に microinjected された胚。宿主胚は、筋マーカー (MF20 緑) と 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 青)、染まりました。挿入されたセル (赤) がはっきりと見える (図 1B) です。セルが表示されていないかどうかを考慮する調整があります: ドナー組織は消化された以上 (細胞ことはできませんを付ける)、色素溶液をラベル付けがあまりにも希薄、細胞が過剰に洗浄またはラベルの損失をもたらした複数の細胞分裂。
この例では注入された細胞が心筋を確認するには、光共焦点顕微鏡 (図 1C E) を使用してこの胚を断面しました。Proepicardium (PE) 内で唯一 MF20 陽性細胞が蛍光の赤陽性細胞移植された塊状です。
図 1: 胚の代表画像分離 24 時間ポスト噴射。(A) 低倍率明視野画像 E3.5 (HH ステージ 19) ニワトリのトランク部。(B) 注入マージされた画像表示セル (赤)、心筋 (緑)、および DAPI。セルは心房から隔離され、proepicardium に microinjected。(C) 高倍率顕微鏡を用いたイメージングを示す標識、proepicardium のコアの細胞です。(D) 高倍率顕微鏡を用いたイメージング心筋細胞が CT の赤いラベルのセルを確認します。(E) パネルDとEから注入された細胞の三次元 (3 D) 再建。で、アトリア。OFT、流出路;PE、proepicardium;Vt、心室;MF20 は、ミオシン 4。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
どのようにアイソレータケージ条件影響心筋細胞運命仕様と系統安定化を定義する機能です基本を適切なのため効率的なプロトコルの開発と同様に先天性の心疾患の理解は圧縮を作成します。幹細胞や体細胞の reprograming ベースの心筋細胞の成熟。プロトコルは上記を与える直接の下で心筋細胞の開発を試金する能力変更セル自律成熟プロセス パラクリン/juxtacrine および/または血行力学的手がかりから分離することを可能にする生体内での条件の調査官。高分解能イメージング、遺伝学的解析および生理学的アッセイと組み合わせると、この手法は既存トランスジェニック モデルに強力な補完として使用できます。
技術的な観点は、ここで提示されたプロトコルは効率的な分離、ラベル付け、およびホスト萌芽期ティッシュへのドナー心臓の細胞の正確な注入に依存しています。マイクロインジェクション システムの使用は大きくエイズのドナー細胞のターゲット、ホスト組織で大規模な生着サイトを作成することがなくインプラントの成功できます。ただし、この手法を実行するいくつかの運用スキルが必要 (心臓やローカル血管の破裂を引き起こす) 標的臓器で注射針は慎重に配置されていない場合、削減可能性が発生します。ケアと思ったは、分離とラベリング手順を与えられる必要があります。ドナーの消化に組織貧しい注入効率をもたらし、一時的なラベリング技術を (細胞分裂は、ラベルを薄めることができる) をドナー細胞は追跡できる時間帯を制限できます。
この技術は、高度変更、さまざまな目的に適応することができます。たとえば、ドナー細胞組織とステージの広い範囲から分離できます (ただし、酵素の消化力の最適化が必要です) でき、同様には、開発のさまざまな段階で宿主組織の様々 なに注入されます。同様に、ラベルをつける方法はもはや一時的な分類のため蛍光灯の無機半導体ナノ結晶の使用とウズラ細胞またはグリーンからのセルの注入を含む別の時間ウィンドウにわたって細胞を追跡する変更できます。蛍光タンパク質遺伝子 (GFP) ドナー胚11側の透過物の分類のため。
我々 は現在鳥注入研究このテクニックを使用していることに使えるかもしれないキメラ研究の広い範囲のため、将来的に我々 は感じる。たとえば、遺伝子組み換え生物から遺伝子組み換えの心筋細胞を分離、非常に類似したプロトコルを使用して鳥の心に microinjected でした。心筋細胞に分化した細胞の細胞を生じるか、または細胞のアプローチを reprograming 経由では、胚の心臓組織や生体力学的体内で成熟への統合を評価するために microinjected 可能性がありますさらに、条件。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所、国立心臓、肺および血の協会 (NHLBI) から R00HL122360 の助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
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