Summary
Dans cette méthode, les tissus cardiaques embryonnaires sont chirurgicalement microdissected, dissocié, fluorescent étiquetés et implanté dans les tissus embryonnaires de l’hôte. Ceci fournit une plate-forme pour l’étude de l’organisation du développement niveau individuel ou de tissus dans des conditions hémodynamiques ectopiques, et/ou altération paracrine/juxtacrine environnements.
Abstract
Interpréter l’impact relatif de structuration autonome cellule contre extrinsèque microenvironmental influence sur la détermination de lignée cellulaire représente un défi général dans la recherche en biologie du développement. Dans le coeur embryonnaire, cela peut être particulièrement difficile puisque les différences régionales dans l’expression des régulateurs transcriptionnels, signaux de signalisation paracrine/juxtacrine, et force hémodynamique sont tous connus pour influencer la maturation cardiomyocyte. Une méthode simplifiée pour modifier microenvironnement de moléculaire et biomécaniques du cardiomyocyte un pays en développement, servirait donc une technique puissante pour examiner comment local conditions influence sort de la cellule et la fonction. Pour y remédier, nous avons optimisé une méthode physiquement transplantation cardiomyocytes juvéniles dans lieux ectopique dans le coeur ou les tissus embryonnaires environnants. Cela nous permet d’examiner comment micro-environnementales conditions influence cardiomyocyte sort transitions à résolution de cellule unique au sein de l’embryon intact. Nous décrivons ici un protocole dans lequel myocytes embryonnaires peut être isolés à partir d’une variété de sous-domaines cardiaques, dissociées, fluorescent étiquetés et ont été micro dans des embryons de hôte avec une grande précision. Cellules peuvent ensuite être analysées directement in situ en utilisant une variété de techniques d’imagerie et histologiques. Ce protocole est une puissante alternative à l’expérimentation greffage traditionnelle qui peut être extrêmement difficile dans un tissu mobile tels que le cœur. Le schéma général de cette méthode peut s’adapter à une variété de tissus de donneurs et environnements hôtes et sa facilité d’utilisation, faible coût, et vitesse rendent une application potentiellement utile pour une variété d’études sur le développement.
Introduction
Recherche de développement cardiaque a profité énormément de l’avènement des systèmes de modèles transgéniques de lignée germinale qui ont identifié plusieurs des réseaux de régulation génique que modèle cellulaires différentes lignées et des domaines fonctionnels au cœur. Toutefois, déterminer comment ces réseaux de gènes interagissent avec et répond aux conditions micro-environnementales, y compris les signaux paracrines/juxtacrine et intrants biophysiques (stretch, souche, flux hémodynamique), peut être difficile. Par conséquent, il n’est pas toujours facile de déterminer si un phénotype cellulaire se pose comme une conséquence directe d’une perturbation génétique ou comme un résultat secondaire d’une adaptation aux modifications cardiaques biomécanique ou plus élevés ordre papier composition1,2 .
Greffage des expériences qui ont été classiquement utilisés aux concepts d’adresse de la spécification du destin, engagement, induction et compétence3,4, représenterait une approche idéale pour contourner certaines des difficultés inhérentes à définition de cellule autonome contre l’influence de l’environnement au coeur. Malheureusement, les contractions cardiaques compliquent des procédures types de greffage. Un mouvement rapide du tissu empêche souvent les cellules greffées d’adhérer au cœur et tissu grand perforations (normalement requis pour les greffes) conduisent souvent à une insuffisance cardiaque et de létalité embryonnaire5,6,7. Par conséquent, nous avons développé un basées sur la pression, système de micro-injection pour l’implantation de cellulaire de précision dans le cœur de poussin en voie de développement, contourner les obstacles techniques de greffe de tissus décrits précédemment8,9. En utilisant cette technique, individuels ou petits groupes de cellules cardiaques isolées à partir d’un embryon de donneur peuvent être micro dans diverses régions d’un cœur embryonnaire hôte, éliminant le besoin de préparation hôte étendu et les insultes de grands tissus qui se posent à l’aide techniques de greffage standards. Les aiguilles de microinjection utilisées pour ces études d’implantation ont un diamètre extérieur de ~ 30−40 µm, ce qui signifie que l’aiguille peut être placé directement dans le tissu cible (c'est-à-dire, pénètrent dans la paroi du myocarde embryonnaire) et cellules peuvent être circonscrits livrés avec un minimum de dommages aux tissus environnants. Le protocole peut être utilisé pour exécuter une variété d’isochore isotopique, transplantation et des manipulations hétérochronique, offrant une approche rapide, flexible et peu coûteux pour examiner directement classiques paradigmes embryologiques expérimentales dans les pays en développement cœur à quatre cavités.
Dans le protocole décrit ci-dessous, nous étiquetons donneur de cellules avec un colorant fluorescent perméants cellulaire qui permet de surveiller en temps réel pour le succès d’une expérience de microinjection et la localisation des cellules implantées à figurer sans la nécessité d’une plus la coloration. Toutefois, il convient de noter que cette approche est idéale pour des expériences de courte durée (environ 48 h) car le colorant fluorescent peut être perdu par division cellulaire. Approches alternatives peuvent être utilisés pour des expériences de durée plus longues.
Alors que nous vous présentons cette technique dans le contexte du développement cardiaque, nous avons utilisé il à bon escient pour des expériences d’implantation de cellules dans le mésoderme, tête, membres et une poule. Ainsi, l’approche de base décrite ci-dessous est très souple et peut être utilisé dans une variété de systèmes d’organes.
Protocol
Toutes les méthodes décrites se conformer aux directives de protection des animaux de The University of North Carolina à Chapel Hill.
1. préparation des pipettes de micro-injection
- Tirez des capillaires en verre à l’aide d’un extracteur d’une micropipette. Pour quelques injections, aiguille biseautage est recommandé car il offre une surface extrêmement tranchant dépourvu d’impuretés structurelles. Pour ce faire, polir l’extrémité d’une aiguille a tiré sur une roue Taillante selon un angle de 45° pour 15−20 min.
Remarque : Les paramètres exacts pour tirer variera selon l’extracteur utilisé. Le diamètre intérieur final du biseau doit être entre 20−40 µm. - Enduire les surfaces internes et externes du verre capillaire avec du silicone. Tout d’abord tremper les aiguilles dans l’agent siliconizing pour enduire la surface externe de l’aiguille, puis charger par l’arrière la solution d’agent siliconizing dans chaque micropipette pour enduire la surface intérieure.
NOTE : Revêtement des capillaires verre devrait faire 24h avant l’expérience de l’implantation. Les capillaires en verre avec du silicone de revêtement offre une surface chimiquement inerte sur le verre. Si les capillaires sont laissés non traitée, la suspension cellulaire générée dans les étapes ultérieures sera adhèrent au verre et branchez l’aiguille. Revêtement est donc nécessaire et essentielle à la réussite de la méthode.
Attention : L’agent siliconizing est un mélange commercialement disponible prêtes à l’emploi d’heptane et 1, 7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Table des matières). Il est extrêmement inflammable et très toxique. Toujours manipuler avec les EPI approprié à l’intérieur d’une hotte aspirante.- Introduire l’aiguille, en direction de charge ~ 5−10 µL de l’agent siliconizing dans un micro injection de pipette (Table des matières). Placer l’embout de la micro-injection dans l’extrémité la plus large du verre tiré capillaire et positionner la pointe aussi loin vers le bas que possible (à proximité de la pointe de l’aiguille de verre). L’agent siliconizing d’éjection tout en retirant lentement la pipette de chargement afin de minimiser les bulles d’air dans l’aiguille.
- Laisser l’agent siliconizing dans l’aiguille de verre pendant 10 min, retirez en aspirant avec une nouvelle pipette de chargement et laissez aiguilles sécher toute la nuit sous une hotte.
- Le matin de l’expérience, rincer les capillaires en verre avec de l’eau désionisée, suivant la procédure à l’étape 1.2 et laisser pour sécher pendant 3−4 h.
2. préparation des solutions
- Préparation de 5 mL de trypsine neutralisant la solution en la complétant 4,2 mL de milieu de Eagle modifié de Dulbecco et mélange nutritif Ham F12 (DMEM/F12), avec 750 µL de sérum bovin fœtal (FBS) et 50 µL de pénicilline/streptomycine. Conserver à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Préparer 5 µM étiquetant solution teintée par pipetage 5 µL de stock 1 mM marquage colorant (dans le diméthylsulfoxyde [DMSO], Table des matières) en 995 µL de Hank équilibré de solution saline (HBSS). Vortexer pendant 1 min et magasin à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Préparer la paraformaldéhyde frais (PFA) en combinant 10 mL de solution mère de PFA de 32 % avec 62 mL d’eau de qualité de la biologie moléculaire et 8 mL de 10 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD). La concentration finale est de 4 % PFA dans 1 x DPBS.
3. préparation d’embryons de l’hôte
- Incuber des oeufs de poulet fertile dans une orientation horizontale dans un incubateur humidifié à 38 ° C jusqu’au Hamburger et Hamilton (HH) étape 1910.
Remarque : La scène choisie pour la manipulation est flexible et entièrement dépendant des objectifs de chaque expérience individuelle. - Marquer la fin de « plate » de la coquille d’oeuf le long de l’Équateur de l’oeuf à l’aide de pinces angulaires à faire une petite perforation > 1 mm de diamètre. Insérer une aiguille 18 G avec seringue jointe 10 mL par le biais de la ponction et retirer environ 5 mL d’albumine.
Remarque : Cette localisation anatomique est externe à la « cellule d’air » à l’intérieur de le œuf et empêche la fuite une fois la ponction faite albumine. Cette étape est recommandée car elle « tombe » de l’embryon de la coquille d’oeuf, prévenant les dommages potentiels dans les étapes ultérieures. - Appliquer du ruban adhésif transparent vers le haut de la coquille d’oeuf. Marquer avec une pince coudée et découper une fenêtre de ~2.5 cm avec des ciseaux courbes ténotomie.
- Inspecter et l’embryon issu des critères établis par le Hamburger et Hamilton10 et sceller la piqûre de l’étape 3.2 avec du ruban adhésif transparent.
NOTE : Ici, embryons au stade 19 HH sont utilisés qui ont des somites 37−40 s’étendant dans le bourgeon de la queue. La ponction ne devrait pas être scellée jusqu'à ce qu’après l’ouverture de la fenêtre sur le haut de l’oeuf (étape 3.3). - Injecter ~ 200 µL du mélange de l’encre de Chine/HBSS (1:5) sous l’embryon à l’aide d’une aiguille de 32 G avec seringue jointe 1 mL.
Remarque : l’encre de Chine offre un contraste visuel entre l’embryon et le jaune sous. Alternative colorants tels que neutre disponible dans le commerce ou rouge cyan protéine fluorescente (CFP) ou jeux de filtres de fluorescence bleue protéine fluorescente (BFP) peut être utilisé pour améliorer le contraste. - Ajouter 1 mL de HBSS goutte à goutte sur le disque embryonnaire et sceller les coquilles fenêtrées avec film de paraffine. Replacez les œufs dans l’incubateur humidifié jusqu’au moment de l’injection.
4. isolement de tissu donneur
- Incuber les oeufs de poulet fertile du donateur dans un incubateur humidifié à 38 ° C jusqu’au stade HH 19 (ou scène désirée).
- Retirer l’embryon de l’oeuf et les placer dans un plat de pétri 100 x 15 mm contenant stérile HBSS à température ambiante (RT).
- Chirurgicalement le tissu auriculaire donneur microdissect de chaque embryon par tout d’abord isoler tout coeur embryonnaire de l’embryon et puis en isolant les oreillettes du coeur à l’aide de pinces, ciseaux ténotomie et microspatula sous un stéréo binoculaire. Piscine dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL contenant 1 mL de HBSS sur la glace.
- Une fois que tous les tissus du donneur a été recueillie, pellet le tissu par centrifugation à 1000 x g pendant 5 min à 4 ° C dans une micro-centrifugeuse angle fixe.
5. la digestion trypsique de tissu donneur
- Remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de préchauffée 0.05 % trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 15 min dans un bloc chauffant secouant à 300 tr/min. Sinon, utiliser un bain-marie avec agitation périodique de l’échantillon.
- Déposer de la solution de digestion haut et bas pour casser vers le haut de n’importe quel tissu restant et pellet comme au point 4.4.
- Resuspendre le culot dans 1 mL de la trypsine neutralisant solution et centrifugeuse comme au point 4.4.
- Remettre en suspension les cellules de 400 µL de rouge fluorescent étiquetage solution teintée et incuber à 37 ° C pendant 20 min dans un bloc chauffant. Vous pouvez également utiliser un bain d’eau.
- Une fois que la réaction d’étiquetage est terminée, les cellules comme au point 4.4 de granule et laver avec 1 mL de HBSS (nombre de lavage étapes peuvent varier entre 1 et 3).
- Remettre en suspension les cellules marquées, granulés à une concentration de ~ 50 000 cellules/µL, qui donne généralement lieu à un volume de travail 5−10 µL selon le rendement total de cellules.
Remarque : Les concentrations de cellules au-dessous de ~ 50 000 cellules/µL peuvent entraîner efficacité pauvre injection.
6. in vivo injection
- Charger par l’arrière la suspension cellulaire dans une pipette capillaire de silicone verre traité suivant la procédure à l’étape 1.2. Montez la pipette dans l’appareil de microinjector de pression.
- Retirer les embryons hôte incubateur humidifié et placer dans un support oeuf sous la stéréo fluorescent binoculaire.
- Ouvrez la membrane vitelline, à l’aide d’une pince fine stérile et faire une petite incision (~0.5−1.0 mm de longueur) dans le péricarde. Manipulation/dissection supplémentaire peuvent être nécessaires selon votre région cible pour injection.
- Placez le microinjector de telle sorte que la pointe de l’aiguille de microinjection pénètre le tissu cible.
- Pression injecter des cellules et utilisez l’étiquette fluorescent pour déterminer que les cellules implantés sont présentes dans le tissu désiré. Pour les injections typiques, appliquer seule impulsions inférieures à 0,5 s à une durée allant de 100 à 400 hectopascals en pression.
NOTE : Durée d’impulsion et de la pression absolue varient selon le nombre de cellules à doser et peuvent être modifiés en fonction des besoins individuels. - Retirer l’appareil microinjector et retirez le œuf du support après l’injection de la pression.
- Pression injecter des cellules et utilisez l’étiquette fluorescent pour déterminer que les cellules implantés sont présentes dans le tissu désiré. Pour les injections typiques, appliquer seule impulsions inférieures à 0,5 s à une durée allant de 100 à 400 hectopascals en pression.
- Ajouter 1 mL de HBSS chaude goutte à goutte sur l’embryon, sceller les oeufs à l’aide de ruban d’emballage transparent et incuber dans l’incubateur humidifié à 38 ° C pour l’implantation de poste de 24h.
7. isolement et analyse
- Isoler les embryons hôte dans HBSS RT à l’aide de pinces, ciseaux ténotomie et microspatula similaire à l’étape 4.3 et difficulté à 4 % PFA pour la nuit à 4 ° C avec le doux balancement.
- Laver les embryons 3 x 5 min dans HBSS RT avec doux balancement et stocker dans HBSS à 4 ° C pour une analyse ultérieure en aval (microscopie, immunohistochimie, hybridation in situ, etc.).
Representative Results
Après 24 h d’incubation, le cœur et surround tissu d’hôte embryons ont été isolés, photographié (Figure 1A) et traitement pour analyse par immunofluorescence. Dans cet exemple, donneur myocytes auriculaires ont été microinjected dans la proepicardium d’une multitude de mises en scène similaire embryon. L’embryon de l’hôte était taché alors avec le marqueur de muscle (MF20 vert) et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; bleu). Les cellules injectées (rouge) sont clairement visibles (Figure 1B). Ajustements possibles à examiner si les cellules ne sont pas visibles comprennent : tissus du donneur a été digéré plus (les cellules seraient incapables de fixer), solution teintée d’étiquetage a été trop dilué, les cellules sont trop lavés ou plusieurs divisions cellulaires a entraîné une perte de l’étiquette.
Pour confirmer que les cellules injectées dans cet exemple ont été myocardiques, nous avons sectionné optiquement cet embryon à l’aide d’un microscope confocal (Figure 1C-E). Les seules cellules positives MF20 au sein de la proepicardium (PE) sont les cellules positives rouges fluorescents qui ont été circonscrits implantés.
Figure 1 : Des images représentatives des embryons isolement 24 heures post injection. Image de fond clair de faible grossissement (A) de la région du tronc d’un embryon de poussin E3.5 (HH étape 19). Cellules d’affichage d’image fusionnée injecté (B) (rouges), cardiomyocytes (verts) et DAPI. Les cellules ont été isolées de l’oreillette et micro dans le proepicardium. (C) l’imagerie confocale fort grossissement montrant étiquetés cellules dans le noyau de la proepicardium. (D) l’imagerie confocale fort grossissement confirmant CT rouge marqué des cellules est des cardiomyocytes. (E) en trois dimensions (3D) reconstruction des cellules injectées par des panneaux D et E. At, oreillettes ; OFT, des voies de sortie ; PE, proepicardium ; VT, ventricule ; MF20, myosine 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
La possibilité de définir comment micro-environnementales conditions impact cellule cardiaque sort spécification et lignée de stabilisation est fondamentale à la création d’une compression compréhension des maladies cardiaques congénitales ainsi quant à l’élaboration de protocoles efficaces pour la bonne maturation des cellules souches ou cellules somatiques des cardiomyocytes reprogrammation-basé. Le protocole décrit ci-dessus donne chercheurs la possibilité d’analyser directement les développement des cellules cardiaques sous altéré les conditions in vivo, ce qui permet pour les processus de maturation autonome cellule d’être séparé de signaux paracrines/juxtacrine et/ou hémodynamiques. Lorsqu’il est combiné avec l’imagerie haute résolution, analyse génétique et les essais physiologiques, cette technique peut servir de complément puissant de modèles transgéniques existantes.
Former un point de vue technique, le protocole présenté ici s’appuie sur une isolation efficace, étiquetage et implantation précise des cellules cardiaques donneur dans les tissus embryonnaires de l’hôte. L’utilisation d’un système de micro-injection grandement contribue à cibler les cellules du donneur et permet une implantation réussie sans la nécessité de créer un site de grande prise de greffe dans les tissus de l’hôte. Certaines compétences opérationnelles sont requis pour effectuer cette technique toutefois, comme la viabilité réduite peut se produire si l’aiguille d’injection n’est pas soigneusement placé dans le tissu cible (ce qui provoque la rupture du cœur ou du système vasculaire locale). Soins et la pensée conviendrait aussi à l’isolement et l’étiquetage des étapes. Au cours de la digestion du donneur tissu peut conduire à l’efficacité médiocre de l’implantation, et transitoire des techniques de marquage peut limiter la durée de validité sur laquelle les cellules donneuses peuvent être suivis (comme la division cellulaire peut diluer l’étiquette).
Cette technique est très modifiable et adaptable pour une variété d’usages. Par exemple, donneur de cellules dans une large gamme de tissus et de stades peuvent être isolés (bien que l’optimisation de la digestion enzymatique est requise) et peut de même être injecté dans une variété de tissus de l’hôte à travers différents stades de développement. De même, la démarche d’étiquetage peut être modifiée pour assurer le suivi des cellules à travers des fenêtres temporelles différentes, y compris l’utilisation de nanocristaux fluorescents semi-conducteurs inorganiques pour l’étiquetage plus transitoire et l’implantation de cellules de caille ou cellules du vert (protéine fluorescente transgéniques GFP +) donneur embryons11 pour l’étiquetage perméants.
Alors qu’actuellement, nous utilisons cette technique pour les études d’implantation aviaire, nous pensons qu’il pourrait être utilisé pour une vaste gamme d’études chimériques dans l’avenir. Par exemple, les cellules cardiaques génétiquement modifiés provenant d’organismes transgéniques pourraient être isolées et micro au cœur aviaire à l’aide d’un protocole très similaire. En outre, les cellules différenciées dans les cardiomyocytes de provient de cellules ou par l’intermédiaire de cellules somatiques, reprogrammation des approches pourraient être micro au cœur embryonnaire pour évaluer leur intégration dans le tissu et/ou la maturation sous in vivo biomécanique conditions.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par grant R00HL122360 de la National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
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