Summary
In questo metodo, tessuti cardiaci embrionali sono chirurgicamente microdissected, dissociato, fluorescente etichettati e impiantati nei tessuti embrionali dell'ospite. Questo fornisce una piattaforma per lo studio dell'organizzazione inerente allo sviluppo livello individuale o tessuto ectopiche condizioni emodinamiche, e/o alterati paracrine/juxtacrine ambienti.
Abstract
Interpretare l'impatto relativo di patterning autonoma delle cellule contro microambiente estrinseca influenza sulla determinazione di lignaggio cellulare rappresenta una sfida generale nella ricerca di biologia inerente allo sviluppo. Nel cuore embrionale, questo può essere particolarmente difficile in quanto le differenze regionali nell'espressione di regolatori trascrizionali, spunti di segnalazione paracrina/iuxtacrina, e forza emodinamica sono tutti noti per influenzare la maturazione dei cardiomiociti. Un metodo semplificato per alterare il microambiente molecolare e biomeccanica di un cardiomyocyte in via di sviluppo, di conseguenza, servirebbe come una potente tecnica per esaminare come locali condizioni influenza destino della cellula e la funzione. Per risolvere questo problema, abbiamo ottimizzato un metodo per trapiantare fisicamente giovanili cardiomiociti in località ectopico nel cuore o il tessuto embrionale circostante. Questo ci permette di esaminare come microambientali condizioni influenza del cardiomyocyte destino transizioni alla risoluzione della singola cella all'interno dell'embrione intatto. Qui, descriviamo un protocollo in cui miociti embrionale possono essere isolato da una varietà di cardiaci sotto-domini, dissociato, fluorescente etichettati e microiniettati negli embrioni di host con alta precisione. Le cellule possono poi essere direttamente analizzate in situ utilizzando una varietà di tecniche di imaging e istologiche. Questo protocollo è una valida alternativa ai tradizionali esperimenti d'innesto che può essere eccessivamente difficile in un tessuto commovente come il cuore. La struttura generale di questo metodo può anche essere adattata ad una varietà di tessuti del donatore e ambienti host e la facilità d'uso, basso costo, e velocità lo rendono un'applicazione potenzialmente utile per una varietà di studi evolutivi.
Introduction
Ricerca inerente allo sviluppo cardiaco ha beneficiato enormemente l'avvento di sistemi di modello transgenico di germline che hanno identificato molti delle reti di regolazione genica che modello cellulari diversi lignaggi e domini funzionali nel cuore. Tuttavia, identificare come queste reti geniche interagiscono e rispondere alle condizioni microambientali, compresi segnali paracrini/juxtacrine e biofisici ingressi (tratto, lo sforzo, flusso emodinamico), può essere impegnativo. Come tale, non è sempre facile determinare se un fenotipo cellulare si pone come diretta conseguenza di una perturbazione genetica o come un risultato secondario di un adattamento ai cambiamenti in biomeccanica cardiaco o di più alto ordine tessuto composizione1,2 .
L'innesto di esperimenti, che sono stati utilizzati classicamente ai concetti di indirizzo della specifica di destino, impegno, induzione e competenza3,4, rappresenterebbe un approccio ideale per aggirare alcune delle sfide inerenti definizione di cellula autonoma contro influenza ambientale nel cuore. Purtroppo, le contrazioni del cuore fare approcci d'innesto standard difficile. Rapido movimento del tessuto impedisce spesso innestate cellule di aderire al cuore e grande tessuto forature (normalmente richiesti per l'innesto) spesso portano a insufficienza cardiaca e mortalità embrionale5,6,7. Pertanto, abbiamo sviluppato una base alla pressione, sistema di microiniezione per l'impianto cellulare precisione nel cuore di pulcino in via di sviluppo, aggirando le transenne tecniche di innesto di tessuto descritto in precedenza8,9. Utilizzando questa tecnica, singoli o piccoli gruppi di cellule cardiache isolate da un embrione donatore possono essere microiniettati in diverse regioni di un cuore embrionale host eliminando la necessità per la preparazione di vasto host e gli insulti di tessuto grande che sorgono utilizzando tecniche d'innesto standard. Gli aghi di microinjection usati per questi studi di impianto hanno un diametro esterno di ~ 30−40 µm, che significa che l'ago può essere inserito direttamente nel tessuto bersaglio (cioè, può penetrare la parete miocardica embrionale) e le cellule possono essere consegnate focale con minimo danno al tessuto circostante. Il protocollo può essere utilizzato per eseguire una varietà di isochoric isotopica, eterotopica e manipolazioni eterocronico, fornendo un approccio rapido, flessibile e a basso costo per esaminare direttamente classici paradigmi sperimentali embriologici in via di sviluppo Cuore quattro-a temperatura ambiente.
Nel protocollo descritto qui di seguito, etichettiamo donatore di cellule con un colorante fluorescente permeante cellulare, che permette di essere monitorati in tempo reale per il successo di un esperimento di microiniezione e l'ubicazione delle cellule engrafted essere documentata senza la necessità di qualsiasi ulteriore la macchiatura. Tuttavia, dovrebbe essere notato che questo approccio è più adatto per esperimenti di breve termine (circa 48 h) come il colorante fluorescente può essere perso attraverso la divisione cellulare. Approcci alternativi possono essere usati per esperimenti di più lungo termine.
Mentre stiamo presentando questa tecnica nel contesto di sviluppo cardiaco, noi abbiamo usato di grande effetto per esperimenti l'impianto delle cellule nel mesoderma, testa, arti e somiti. Come tale l'approccio di base descritta di seguito è altamente trattabile e può essere utilizzato in una varietà di sistemi dell'organo.
Protocol
Tutti i metodi descritti aderiscano alle linee guida di cura degli animali di The University of North Carolina a Chapel Hill.
1. preparazione delle pipette micro-iniezione
- Tirare tubi capillari in vetro utilizzando un estrattore micropipetta. Per alcune iniezioni, smussatura dell'ago è consigliabile poichè fornisce una superficie estremamente nitida prive di impurità strutturali. Per effettuare questa operazione, polacco alla fine di un ago tirato su una ruota smussatura inclinata di 45° per 15 − 20 min.
Nota: Le impostazioni esatte per la trazione variano in base sulla levetta di regolazione viene utilizzato. Il diametro interno finale della smussatura dovrebbe essere tra 20−40 µm. - Ricoprire le superfici interne ed esterne del vetro capillare con silicone. Prima di immergere gli aghi nell'agente di siliconatura per rivestire la superficie esterna dell'ago e poi inserire la siliconatura soluzione agente in ogni micropipetta per rivestire la superficie interna.
Nota: Il rivestimento dei vasi capillari di vetro dovrebbe essere fatto 24 h prima dell'esperimento di impianto. I capillari di vetro con del silicone del rivestimento fornisce una superficie chimicamente inerte al vetro. Se i capillari sono lasciati non trattati, la sospensione cellulare generata nei passaggi successivi verrà aderire al vetro e collegare l'ago. Di conseguenza, il rivestimento è necessaria e vitale per il successo del metodo.
Attenzione: L'agente di siliconatura è una miscela disponibile in commercio già pronta di eptano e 1,7-dicloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabella materiali). È estremamente infiammabile e acutamente tossici. Maneggiare sempre con adeguata PPE all'interno di una cappa aspirante.- Per inserire l'ago, caricare ~ µ l di 5−10 dell'agente siliconatura in un micro-iniezione puntale (Tabella materiali). Posizionare la punta di micro-iniezione in estremità larga del vetro tirato capillare e posizionare la punta più lontano giù come possibile (vicino alla punta dell'ago di vetro). Espellere l'agente siliconatura mentre lentamente rimuovendo la pipetta di carico al fine di ridurre al minimo le bolle d'aria nell'ago.
- Lasciare l'agente siliconatura nell'ago di vetro per 10 min, rimuovere aspirando con una nuova pipetta di caricamento e consentire aghi asciugare per una notte in una cappa aspirante.
- La mattina dell'esperimento, risciacquare i capillari di vetro con acqua deionizzata seguendo la procedura al punto 1.2 e lasciare per asciugare per 3 − 4 h.
2. preparazione delle soluzioni
- Preparare 5 mL di tripsina soluzione neutralizzante completando 4,2 mL di medium modificato dell'Aquila di Dulbecco e miscela nutriente di Ham F12 (DMEM/F12) con 750 µ l di siero bovino fetale (FBS) e 50 µ l di penicillina/streptomicina. Conservare a 37 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare 5 µM etichettatura soluzione colorante pipettaggio 5 µ l di brodo di 1mm etichettatura tintura (in dimetilsolfossido [DMSO], Tabella materiali) in 995 µ l di Hank soluzione salina (HBSS) equilibrata. Vortexare per 1 min e store a 37 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare fresco paraformaldeide (PFA) unendo 10 mL della soluzione madre di PFA 32% con 62 mL di acqua di grado di biologia molecolare e 8 mL di soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS): 10x. La concentrazione finale è 4% PFA in 1 x DPBS.
3. preparazione degli embrioni di host
- Incubare uova fertili del pollo in un orientamento orizzontale in un incubatore a 38 ° C fino a Hamburger e Hamilton (HH) fase 1910.
Nota: Il palcoscenico scelto per manipolazione è flessibile e completamente dipendente dagli obiettivi di ogni singolo esperimento. - Punteggio ottenuto alla fine "flat" del guscio uovo lungo l'equatore di uovo utilizzando forcipe angolato per fare una piccola puntura > 1 mm di diametro. Inserire un ago da 18 G con annesso 10 mL siringa attraverso la puntura e rimuovere ~ 5 mL di albumina.
Nota: Questa posizione anatomica è esterna alla cella di"aria" all'interno dell'uovo e impedisce la fuoriuscita una volta fatta la puntura di albumina. Questo passaggio è consigliato come si "scende" l'embrione lontano il guscio d'uovo, impedire potenziali danni nei passaggi successivi. - Applicare nastro trasparente sulla parte superiore del guscio dell'uovo. Punteggio ottenuto con il forcipe angolato e tagliare una finestra di cm ~2.5 usando le forbici tenotomy curvo.
- Ispezionare e tappa l'embrione in base a criteri stabiliti da Hamburger e Hamilton10 e sigillare la puntura da passo 3.2 con nastro adesivo trasparente.
Nota: Qui, embrioni in fase 19 HH sono usati che hanno 37−40 somiti che avanza nel germoglio della coda. La puntura non deve essere sigillata fino a dopo la finestra viene aperta nella parte superiore dell'uovo (punto 3.3). - Iniettare ~ 200 µ l di miscela di inchiostro di India/HBSS (1:5) sotto l'embrione usando un ago 32G con siringa da 1 mL allegata.
Nota: l'inchiostro di India fornisce contrasto visivo tra l'embrione e il tuorlo sotto. Alternativa tinture come neutra disponibile in commercio o rossa ciano proteina fluorescente (CFP) o set di filtri di fluorescenza della proteina fluorescente blu (BFP) può essere utilizzato per migliorare il contrasto. - Aggiungere 1 mL di HBSS goccia a goccia sul disco embrionale e sigillare con finestre conchiglie con film di paraffina. Rimettere le uova nell'incubatrice umidificata fino a che pronto per l'iniezione.
4. isolamento del tessuto del donatore
- Incubare uova di pollo fertile del donatore in un incubatore a 38 ° C fino a fase HH 19 (o fase desiderata).
- Rimuovere l'embrione dall'uovo e mettere in una capsula Petri 100 x 15 mm contenente HBSS sterile a temperatura ambiente (TA).
- Chirurgicamente microdissect tessuto di donatore atriale da ogni embrione prima isolando l'intero cuore embrionale dell'embrione e quindi isolando gli atri dal cuore utilizzando pinze, forbici tenotomy e microspatula sotto uno stereo microscopio per dissezione. Piscina in un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL contenente 1 mL di HBSS sul ghiaccio.
- Una volta che tutto il tessuto donatore è stati raccolti, pallina del tessuto mediante centrifugazione a 1000 x g per 5 min a 4 ° C in una microcentrifuga ad angolo fisso.
5. digestione della tripsina del tessuto del donatore
- Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di preriscaldati 0.05% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 15 min in un blocco di calore agitazione a 300 giri/min. In alternativa, è possibile utilizzare un bagnomaria con agitazione periodica del campione.
- Dispensare la soluzione di digestione su e giù per rompere qualsiasi tessuto restante e pellet come descritto al punto 4.4.
- Risospendere il pellet in 1 mL di tripsina neutralizzando soluzione e centrifugare come descritto al punto 4.4.
- Risospendere le cellule in 400 µ l di rosso fluorescente etichettatura soluzione colorante e incubare a 37 ° C per 20 min in un blocco di calore. In alternativa, utilizzare un bagno d'acqua.
- Una volta terminata la reazione d'etichettatura, appallottolare le celle come descritto al punto 4.4 e lavare con 1 mL di HBSS (numero di lavaggio passaggi possono essere variate tra 1 e 3).
- Risospendere le cellule etichettate, pellettate ad una concentrazione di ~ 50.000 cellule / µ l, che si traduce generalmente in un volume di lavoro 5−10 µ l a seconda del rendimento totale delle cellule.
Nota: Le concentrazioni cellulari sotto ~ 50.000 cellule / µ l possono provocare l'efficienza scarsa iniezione.
6. in-vivo iniezione
- Inserire la sospensione cellulare in una pipetta capillare di vetro trattato in silicone seguendo le procedure descritte in passaggio 1.2. Montare la pipetta nell'apparato di microinjector di pressione.
- Rimuovere gli embrioni host da incubatore e posto in un portauovo sotto il fluorescente stereo microscopio per dissezione.
- Aprire la membrana vitellina usando una pinzetta sterile e praticare una piccola incisione (~0.5−1.0 mm di lunghezza) nel pericardio. Ulteriore manipolazioni/dissezione può essere necessaria a seconda della regione di destinazione per l'iniezione.
- Posizionare il microinjector in modo tale che la punta dell'ago microiniezione penetra il tessuto bersaglio.
- Pressione iniettare le cellule e utilizzare l'etichetta fluorescente per determinare che le cellule impiantate sono presenti nel tessuto desiderato. Per preparazioni iniettabili tipici, applicare singoli impulsi inferiori a 0,5 s in durata che va da 100-400 ettopascal in pressione.
Nota: Lunghezza di impulso e la pressione assoluta varierà a seconda del numero delle cellule deve essere iniettato e possono essere modificati per soddisfare le esigenze individuali. - Ritrarre l'apparato microinjector e togliere l'uovo dal titolare dopo l'iniezione di pressione.
- Pressione iniettare le cellule e utilizzare l'etichetta fluorescente per determinare che le cellule impiantate sono presenti nel tessuto desiderato. Per preparazioni iniettabili tipici, applicare singoli impulsi inferiori a 0,5 s in durata che va da 100-400 ettopascal in pressione.
- Aggiungere 1 mL di caldo HBSS goccia a goccia sull'embrione, uova usando nastro adesivo trasparente ed incubare nell'incubatore umidificato a 38 ° C per l'impianto di post 24 h.
7. isolamento e analisi
- Isolare gli embrioni di host in HBSS RT utilizzando pinze, forbici tenotomy e microspatula simile al punto 4.3 e difficoltà nel 4% PFA durante la notte a 4 ° C con dolce dondolio.
- Lavare gli embrioni 3 x 5 min in HBSS a RT con dolce dondolo e conservare in HBSS a 4 ° C per ulteriori analisi a valle (microscopia, immunoistochimica, ibridazione in situ, ecc.).
Representative Results
Dopo del tessuto 24 h di incubazione, il cuore e surround dell'host gli embrioni sono stati isolati, fotografato (Figura 1A) e trattati per analisi immunofluorescente. In questo esempio, miociti atriali dei donatori sono stati microiniettati nella proepicardium di un host in fasi simile dell'embrione. L'embrione di host quindi era macchiato con il marcatore di muscolo (MF20 verde) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blu). Cellule iniettate (rosso) sono chiaramente visibili (Figura 1B). Regolazioni possibili da considerare se le celle non sono visibili sono: tessuto erogatore oltre è stato digerito (cellule sarebbe impossibile connettersi), etichettatura soluzione colorante era troppo diluito, le cellule erano over-lavate o più divisioni cellulari ha provocato la perdita dell'etichetta.
Per confermare che le cellule iniettate in questo esempio sono stati del miocardio, abbiamo otticamente sezionato questo embrione utilizzando un microscopio confocale (Figura 1C-E). Solo le cellule positive MF20 entro il proepicardium (PE) sono le cellule positive rosse fluorescente che focale sono state impiantate.
Figura 1 : Immagini rappresentative degli embrioni isolato 24 ore dopo l'iniezione. (A) immagine di campo chiaro basso ingrandimento della regione tronco di un embrione di E3.5 (HH fase 19). (B) visualizzando immagine Merged iniettato le cellule (rosse), cardiomiociti (verdi) e DAPI. Le cellule sono state isolate dagli atri e microiniettati nella proepicardium. (C) formazione immagine confocal ad alto ingrandimento che mostra etichettati cellule nel nucleo della proepicardium. Formazione immagine confocal di alto ingrandimento (D) confermando CT rosso etichettato le cellule è cardiomyocytes. (E) ricostruzione tridimensionale (3D) delle cellule iniettate da pannelli D ed E. Presso, atria; OFT, tratto di efflusso; PE, proepicardium; VT, ventricolo; MF20, miosina 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La possibilità di definire come microambientali condizioni impatto delle cellule cardiache destino specifica e lignaggio stabilizzazione è fondamentale per la creazione di una comprensione alla compressione delle cardiopatie congenite anche per quanto riguarda lo sviluppo di efficienti protocolli per una corretta maturazione dei cardiomiociti basati sulla riprogrammazione delle cellule staminali o cellule somatiche. Il protocollo di cui sopra dà gli investigatori alterato la capacità di dosare direttamente lo sviluppo delle cellule cardiache sotto condizioni in vivo, consentendo per i processi di maturazione autonoma delle cellule essere separati da segnali paracrini/juxtacrine e/o emodinamici. Quando combinato con imaging ad alta risoluzione, analisi genetica e dosaggi fisiologici, questa tecnica può servire come un complemento potente ai modelli transgenici esistenti.
Formare un punto di vista tecnico, il protocollo qui presentato si basa sull'isolamento efficiente, l'etichettatura e preciso impianto delle cellule erogarici cuore nei tessuti embrionali dell'ospite. L'uso di un sistema di microiniezione notevolmente aiuti mirati di cellule del donatore e consente riuscito impianto senza la necessità di creare un sito di grande attecchimento nel tessuto ospite. Per eseguire questa tecnica, tuttavia, è necessaria una certa abilità operative come vitalità ridotta può provocare se l'ago per iniezione non viene attentamente inserito nel tessuto bersaglio (che causa la rottura del cuore o il sistema vascolare locale). Cura e pensiero occorre anche per l'isolamento e la procedura di etichettatura. Sopra digestione del donatore tessuto può portare all'efficienza dell'impianto povero e transitori tecniche di etichettatura possono limitare l'intervallo di tempo su cui le cellule erogarici possono essere monitorate (come divisione cellulare può diluire l'etichetta).
Questa tecnica è altamente modificabile e può essere adattata per una varietà di scopi. Ad esempio, donatore cellule da una vasta gamma di tessuti e fasi possono essere isolato (anche se ottimizzazione della digestione enzimatica è richiesto) e allo stesso modo può essere iniettato in una varietà di tessuti dell'ospite attraverso diversi stadi di sviluppo. Allo stesso modo, l'approccio di etichettatura possa essere modificato per tenere traccia di cellule in diverse finestre temporali, compreso l'uso di nanocristalli semiconduttori inorganici fluorescenti per l'etichettatura più transitoria e l'impianto di cellule di quaglia o cellule da green (proteina fluorescente transgenici GFP +) donatore embrioni11 per l'etichettatura permeante.
Mentre attualmente usiamo questa tecnica per gli studi di impianto aviaria, riteniamo che potrebbe essere utilizzato per una vasta gamma di studi chimerici in futuro. Ad esempio, le cellule cardiache geneticamente alterate da organismi transgenici potrebbero essere isolate e microiniettate in cuore aviaria utilizzando un protocollo molto simile. Inoltre, cellule differenziate in cardiomiociti da deriva cellule o tramite approcci di riprogrammazione di cellule somatiche potrebbe essere microiniettati in cuore embrionale per valutare la loro integrazione nel tessuto e/o maturazione sotto in vivo biomeccanico condizioni.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da grant R00HL122360 dal National Institutes of Health, National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
| 10 ml Syringe | BD | 305482 | |
| 1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
| 15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
| 1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
| 18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
| 200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
| 32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
| Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
| Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
| Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
| CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
| Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
| Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | -- | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
| Micromanipulator | Leica Microsystems | -- | |
| Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
| Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
| Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
| Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
| Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
| Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
| Stereo Microscope | Leica | -- | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |
References
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