Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Summary

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Abstract

לפרש את ההשפעה היחסית של תא המתבנת אוטונומית לעומת חיצוני microenvironmental השפעה על שושלת היוחסין תא בנחישות מייצג אתגר כללי בחקר ביולוגיה התפתחותית. בלב עובריים, זה יכול להיות קשה במיוחד כמו הבדלים אזוריים הביטוי של גנים ברמת השעתוק וסתים, רמזים איתות paracrine/juxtacrine, ואת כוח והמודינמיקה ידועים כדי להשפיע על cardiomyocyte ההבשלה. שיטה פשוטה כדי לשנות microenvironment biomechanical המולקולריים של cardiomyocyte המתפתח, לכן, לשמש טכניקה חזקה כדי לבחון איך מקומי תנאים השפעה גורל ותפקוד. כדי לטפל בבעיה זו, אנו יש אופטימיזציה שיטה פיזית השתלת cardiomyocytes לנוער לתוך מקומות חוץ רחמי הלב או עובריים הרקמה שמסביב. זה מאפשר לנו לבחון איך microenvironmental תנאים השפעה cardiomyocyte הגורל מעברים ברזולוציה תא בודד בתוך העובר תקין. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שבו נייטרלים עובריים יכול להיות מבודדת ממגוון רחב של תחומי המשנה לב הפומבית, הנקרא fluorescently, microinjected לתוך המחשב המארח העוברים עם דיוק גבוהה. התאים ניתן לאחר מכן ישירות לנתח באתרו תוך שימוש במגוון טכניקות הדמיה היסטולוגית. פרוטוקול זה היא חלופה חזקה ניסויים הרכבה מסורתי זה יכול להיות קשה מדי בממחטת נע כגון הלב. התכנית הכללית של שיטה זו גם ניתן להתאים מגוון רחב של התורם רקמות וסביבות המארח, קלות השימוש, עלות נמוכה, ולעשות את מהירות זה יישום שעשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים התפתחותיים.

Introduction

מחקר התפתחותי הלב יש כמיותרים והצרפתית כניסתו של מערכות מודל הטרנסגניים germline אשר זיהו רבים רשתות בקרה רגולטריות הזה שושלות תאים שונים דוגמת ותחומים פונקציונלי בלב. עם זאת, זיהוי כמה רשתות גנים אלה אינטראקציה עם ולהגיב תנאים microenvironmental, כולל paracrine/juxtacrine אותות biophysical תשומות (מתח, מתח, זרם בגרימת), יכול להיות מאתגר. בתור שכזה, זה לא תמיד קל לקבוע אם הפנוטיפ הסלולר מתעוררת כתוצאה ישירה של ההפרעות גנטיות או כתוצאה משנית של התאקלמות לשינויים ביומכניקה הלב או גבוה יותר סדר רקמות קומפוזיציה^1,2 .

הרכבה ניסויים, אשר בסגנון קלאסי לשמש כתובת מושגים של מפרט הגורל, ומחויבות, אינדוקציה, מיומנות^3,4, מייצגים גישה אידיאלי כדי לעקוף כמה מן האתגרים הטמונה הגדרת תא אוטונומית לעומת השפעה סביבתית בלב. למרבה הצער, התכווצויות הלב להקשות גישות הרכבה סטנדרטי. תנועה מהירה של הרקמה לעתים קרובות מונע תאי המושתל של הקפדה על הלב ועל רקמות גדולות פנצ'רים (בדרך כלל נדרש עבור הרכבה) לעתים קרובות להוביל ספיקת לב ועובריים lethality^5,6,7. לכן, פיתחנו מבוסס-לחץ, מערכת microinjection עבור דיוק השרשה הסלולר אל הלב האפרוח המתפתח, עקיפת הקשיים הטכניים של רקמות הרכבה שתוארה לעיל^8,9. בעזרת טכניקה זו, בודדים או קבוצות של תאי לב מבודד של העובר התורם יכול להיות microinjected לתוך מגוון של אזורים של לב מארח עובריים ומבטלת את הצורך עבור המארח נרחב הכנה וההעלבות רקמות גדולות שעולות באמצעות טכניקות הרכבה סטנדרטי. המחטים microinjection המשמש עבור מחקרים אלה ההשתלה יש של הקוטר החיצוני של ~ 30−40 מיקרומטר, מה שאומר כי ניתן למקם את המחט ישירות ברקמות היעד (קרי, יכולים לחדור את החומה שריר הלב עובריים) תאים יכול להיות מועברת focally עם נזק מינימלי הרקמה שמסביב. הפרוטוקול יכול לשמש כדי לבצע מגוון איזוטרופי, הטרוטופיות, isochoric, heterochronic מניפולציות, מתן גישה מהירה, גמישות בעלות נמוכה לבחון ישירות קלאסית פרדיגמות embryological ניסיוני בפיתוח תאיים ארבע לב.

בפרוטוקול המפורטות להלן, מתייגים התורם תאים תא permeant הפלורסנט, מה שמאפשר עבור ההצלחה של ניסוי microinjection כדי להיות במעקב בזמן אמת ואת המיקום של תאים engrafted כדי להיות מתועד ללא כל הצורך נוספים מכתים. עם זאת, יש לציין כי גישה זו היא המתאימה ביותר עבור ניסויים לטווח קצר (כ- 48 שעות) כמו הפלורסנט עלול ללכת לאיבוד דרך חלוקת התא. גישות אלטרנטיביות יכול לשמש לניסויים לטווח ארוך יותר.

בזמן שאנו מציגים טכניקה זו בהקשר של התפתחות הלב, השתמשנו בו אפקט נהדר עבור ניסויים השרשה התא לתוך והמזודרם, הראש, הגפיים, ו somites. ככזה הגישה הבסיסית המתוארת להלן הוא צייתן מאוד והוא יכול לשמש במגוון של מערכות איברים.

Protocol

כל השיטות המתוארות לדבוק הנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת צפון קרולינה בצ'פל היל.

1. הכנת מיקרו-הזרקת פיפטות

1. משוך נימים זכוכית באמצעות של פולר micropipette. עבור כמה זריקות, המחט שיפוע מומלץ כפי שהיא מספקת של השטח מושחזות ללא זיהומים מבנית. כדי לעשות זאת, פולנית סוף מחט משך על גלגל מסגרת משופעת בזווית של 45 מעלות למשך דקות 15−20.
   הערה: ההגדרות המדויק עבור משיכת ישתנו בהתאם פולר בשימוש. הקוטר הפנימי הסופי של השיקוע צריך להיות בין 20−40 מיקרומטר.
2. מעיל של משטחי זכוכית נימי עם סיליקון פנימיים וחיצוניים. קודם לטבול את המחטים, הסוכן siliconizing לו מעיל על המשטח החיצוני של המחט, ואז backload הפתרון הסוכן siliconizing אל כל micropipette כדי להרגיע את השטח הפנימי.
   הערה: ציפוי של הנימים זכוכית צריך להיעשות 24 שעות לפני הניסוי השרשה. ציפוי זכוכית נימי הדם עם סיליקון מספק משטח אינרטי מבחינה כימית אל הזכוכית. אם הנימים נותרים ללא טיפול, התליה תא שנוצרו בשלבים מאוחר יותר לדבוק הזכוכית וחבר את המחט. לכן, ציפוי הוא הכרחי וחיוני להצלחת השיטה.
   זהירות: הסוכן siliconizing היא תערובת זמינים מסחרית מוכנות של heptane ב 1, 7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (טבלה של חומרים). זה דליק ביותר בחריפות רעילים. תמיד לטפל עם עיקרון השוויון הפוליטי הנכון בתוך ברדס fume.
   1. כדי backload המחט, לטעון ~ 5−10 µL של סוכן siliconizing לתוך טיפ מיקרו-הזרקת פיפטה (טבלה של חומרים). מקם את הטיפ מיקרו-הזרקת בסוף רחב של הזכוכית משך נימי ומקם את הטיפ עד למטה ככל האפשר (קרוב קצה המחט זכוכית). הוצא את הסוכן siliconizing בעת הסרת לאט על פיפטה העמסה על מנת למזער את בועות האוויר במחט.
   2. להשאיר את הסוכן siliconizing המחט זכוכית 10 דקות, להסיר על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה טעינה חדשה ולאפשר מחטים יבש ללון בשכונה fume.
3. בבוקר של הניסוי, לשטוף את נימים זכוכית עם מים יונים בעקבות ההליך בשלב 1.2 ולאפשר לייבוש על 3−4 h.

2. אופן ההכנה של פתרונות

1. להכין 5 מ של טריפסין נטרול פתרון על ידי שכשהם מ 4.2 ל בינונית ששונה הנשרים של Dulbecco, התערובת של בשר חזיר מזין F12 (DMEM/F12) עם 750 µL של העובר שור סרום (FBS), µL 50 של פניצילין/סטרפטומיצין. לאחסן ב 37 ° C עד השימוש.
2. להכין 5 מיקרומטר תיוג לצבוע פתרון על-ידי pipetting µL 5 מניות 1 מ מ תיוג צבען (ב דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד], טבלה של חומרים) לתוך µL 995 של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS). מערבולת 1 דקות, חנות ב 37 ° C עד השימוש.
3. להכין טרי paraformaldehyde (PFA) על ידי שילוב של 10 מ"ל של 32% PFA פתרון מניות 62 מ של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית ו- 8 מ של 10 x מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). הריכוז הסופי הוא 4% מחברים ב- 1 x DPBS.

3. הכנת העוברים מארח

1. דגירה ביצי עוף פורייה כיוון אופקי ב חממה humidified ב 38 ° C עד המבורגר והמילטון (HH) 19 בשלב¹⁰.
   הערה: השלב שבחרת עבור מניפולציה הוא תלוי לחלוטין המטרות של כל ניסוי בודדות וגמישים.
2. ניקוד בסוף "שטוח" קליפת ביצה לאורך קו המשווה ביצה באמצעות מלקחיים בזווית כדי לעשות נקב קטן > 1 מ מ קוטר. המחט של 18 גרם עם מזרק מצורף 10 מ"ל דרך הניקוב ולהסיר ~ 5 מ של אלבומין.
   הערה: מיקום אנטומי זה הוא חיצוני לתא"אוויר" בתוך הביצה ושומר אלבומין דולף לאחר הניקוב. השלב זה מומלץ כמו זה "מפיל" את העובר מן הקליפה ביצה, מניעת נזק פוטנציאלי והשלבים הבאים.
3. השקוף חלות על החלק העליון של קליפת ביצה. ציון עם מלקחיים בזווית וחותכים חלון ס מ ~2.5 באמצעות מספריים tenotomy מעוקל.
4. לבדוק בשלב העובר על פי קריטריונים שנקבעו על-ידי המבורגר והמילטון¹⁰ , לאטום הניקוב מהשלב 3.2 עם סלוטייפ.
   הערה: כאן, שלב HH 19 עוברי משמשים אשר יש somites 37−40 לעומק ניצן הזנב. לא צריך להיות חתום הניקוב עד לאחר החלון נפתח לאורך החלק העליון של הביצה (שלב 3.3).
5. להזריק ~ 200 µL תערובת דיו הודו/HBSS (1:5) מתחת העובר באמצעות מחט 32 G עם מזרק מצורף 1 מ"ל.
   הערה: אינדיה אינק מספק חדות חזותית בין העובר לבין החלמון מתחת. חלופה צבענים כמו נייטרלי אדום או זמינים מסחרית ציאן חלבון פלואורסצנטי (CFP) או מערכות סינון קרינה פלואורסצנטית כחול חלבון פלואורסצנטי (BFP) יכול לשמש כדי לשפר את הניגודיות.
6. להוסיף 1 מ"ל של HBSS dropwise אל הדיסק העוברי, לאטום פגזים חלון עם סרט פרפין. מניחים ביצים בחזרה בחממה humidified עד מוכן להזרקה.

4. בידוד של רקמה

1. דגירה לתרומת ביציות עוף פורייה ב חממה humidified ב 38 ° C עד שלב HH 19 (או השלב הרצוי).
2. מוציאים את העובר מהביצה ומניחים בצלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ המכיל HBSS סטרילי בטמפרטורת החדר (RT).
3. בניתוח microdissect פרפור רקמה של כל העובר על ידי לראשונה לבודד את הלב העוברי כל העובר ולאחר מכן על-ידי בידוד של אטריה מכל הלב באמצעות מלקחיים, מספריים tenotomy ו- microspatula תחת מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ. בריכה צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי המכיל 1 מ"ל של HBSS על הקרח.
4. לאחר שנאספו כל רקמה, גלולה הרקמה על ידי צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ב- microcentrifuge זווית קבועה.

5. טריפסין העיכול של רקמה

1. Resuspend תא כדורי ב 1 מ"ל של טריפסין 0.05% prewarmed-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתוך גוש חום חזק ב 300 סל ד. לחלופין, להשתמש באמבט מים עם עצבנות מחזוריים של המדגם.
2. Pipette הפתרון עיכול למעלה ולמטה כדי לשבור את כל רקמות הנותרים, גלולה כמו שלב 4.4.
3. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של טריפסין נטרול פתרון וצנטריפוגה כמו שלב 4.4.
4. Resuspend תאי µL 400 של פלורסנט אדום תיוג פתרון לצבוע, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בתוך גוש חום. לחלופין, להשתמש באמבט מים.
5. לאחר סיום התגובה תיוג, גלולה התאים כמו שלב 4.4 ולשטוף עם 1 מ"ל של HBSS (מספר שטיפת השלבים יכולים להיות מגוונים בין 1 ל- 3).
6. Resuspend התאים שכותרתו, מגורען-ריכוז של ~ 50,000 תאים/µL, שתוצאתה בדרך כלל אמצעי העבודה µL 5−10 בהתאם התשואה cell סך הכל.
   הערה: תא ריכוזים מתחת ~ 50,000 תאים/µL יכול לגרום יעילות הזרקת המסכן.

6. ב- vivo הזרקה

1. Backload התליה תא לתוך נימי סיליקון הזכוכית שטופלו פיפטה ביצוע הפרוצדורות בשלב 1.2. בעיא פיפטה של המנגנון microinjector הלחץ.
2. להסיר את העוברים מארח חממה humidified ולמקם מחזיק ביצה מתחת הסטריאו פלורסנט לנתח מיקרוסקופ.
   1. פתח את הקרום vitelline באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי, עושים חתך קטן (~0.5−1.0 מ מ אורך) בהכפורת. ייתכן שיהיה צורך מניפולציה נוספים/ניתוח בהתאם לאזור היעד להזרקה.
3. מקם את microinjector כך קצה המחט microinjection חודר את רקמת המטרה.
   1. הלחץ להזריק תאי, ויש להשתמש בתווית פלורסנט כדי לקבוע כי תאים מושתל נמצאים בתוך הרקמה הרצויה. לזריקות טיפוסי, החל פולסים יחיד פחות מ- 0.5 s במשך זמן הנע בין 100-400 hectopascals בלחץ.
      הערה: ללחץ מוחלט לאורכה של הדופק משתנה בהתאם מספר התאים כדי להיות מוזרק, יכול להיות שונה כדי להתאימה לצרכיו האישיים.
   2. . משכי את המנגנון microinjector ולהסיר את הביצה ממחזיק אחרי הזרקת לחץ.
4. להוסיף 1 מ"ל של HBSS חמים dropwise אל העובר, לאטום ביצים באמצעות דבק סלוטפ שקוף, דגירה בחממה humidified ב 38 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה שלאחר ההשתלה.

7. בידוד וניתוח

1. לבודד את העוברים מארח ב- RT HBSS באמצעות מלקחיים, מספריים tenotomy microspatula דומה לשלב 4.3, ותקן ב 4% מחברים בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין.
2. לשטוף את העוברים 3 x 5 דקות ב- HBSS ב RT עם נדנדה עדין, ולאחסן ב- HBSS ב 4 ° C עבור במורד הזרם ניתוח נוסף (מיקרוסקופ, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה מקומיים, וכו '.).

Representative Results

לאחר 24 שעות דגירה, את הלב ואת היקפי רקמות של מארח העוברים היו מבודדים, צולם (איור 1א'), מעובד עבור ניתוח immunofluorescent. בדוגמה זו, היו נייטרלים פרפור התורם microinjected לתוך proepicardium של מחשב מארח בשלבים דומים העובר. העובר המארח היה מוכתם ואז עם הסמן שרירים (MF20 ירוק) ו- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי; כחול). שהוחדר תאים (אדום) הם בבירור (איור 1B). כוללים התאמות אפשריות לשקול אם התאים אינם גלויים: רקמה היה מתעכל מעל (תאים יהיה אפשרות לצרף), תיוג לצבוע הפתרון היה גם שתדללו, התאים היו שטף יתר או חלוקות תאים מרובים, גרמו לאובדן של התווית.

כדי לוודא כי התאים מוזרק בדוגמה זו היו שריר הלב, אנחנו שטיחות למחלקה זו העובר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 1C-E). התאים MF20 החיובית היחידה בתוך proepicardium (PE) הם תאים פלורסנט חיובי אדום זה השתילו focally.

איור 1 : להחליפן בתמונות של העוברים מבודד 24 שעות שלאחר הזרקת. (א) הגדלה נמוכה brightfield תמונה של אזור המטען של העובר צ'יק E3.5 (HH שלב 19). (B) ממוזג תמונת מראה הזרקת תאים (אדום), cardiomyocytes (ירוק) ודאפי. התאים הם בודדו אותנו מהמתרחש אטריה, microinjected לתוך proepicardium. (ג) בהגדלה קונאפוקלית הדמיה מציג בתווית תאים הליבה של proepicardium. (D) בהגדלה הדמיה קונאפוקלית המאשרת CT אדום עם התווית תאים הם cardiomyocytes. (E) תלת מימדי (3D) שחזור של תאים מוזרק לוחות D ו- E. ב, אטריה; OFT, יצוא בדרכי; PE, proepicardium; Vt, החדר; . MF20, צולבות הקישור חוטים שרירן 4 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

היכולת להגדיר איך microenvironmental תנאים ההשפעה תא לב גורל מפרט, שושלת היוחסין מייצב הוא היסוד ליצירת הבנה compressive של מולדת מחלת לב גם כדי לפתח פרוטוקולים יעיל עבור נכונה ההבשלה של תאי גזע או תאים סומטיים reprograming מבוססי cardiomyocytes. הפרוטוקול המתוארים לעיל נותן חוקרים היכולת ישירות assay תא לב פיתוח תחת ששונו תנאי ויוו, המאפשרות התא תהליכי התבגרות אוטונומית מהדת רמזים paracrine/juxtacrine ו/או בגרימת. בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, ניתוח גנטי של מבחני פיזיולוגיים, טכניקה זו יכול לשמש כהשלמה עוצמה קיימים מודלים מהונדס.

טופס נקודה טכנית לעמוד, פרוטוקול המובאת כאן מסתמך על בידוד יעיל, תיוג, ועל ההשתלה מדויק של תאי הלב התורם לרקמות עובריים המארח. השימוש של מערכת microinjection מאוד מסייע המיקוד של תאי התורם ומאפשר להשתלה מוצלחת ללא צורך יצירת אתר גדול engraftment ברקמות הפונדקאי. מיומנות תפעולית מסוימת נדרש לבצע טכניקה זו אולם, הכדאיות מופחת יכול לגרום אם המחט הזרקה לא ממוקם היטב ברקמות היעד (גורם קרע של הלב, או להערכת המקומי). ומחשבה תינתן גם בידוד, צעדים תיוג. על העיכול של התורם רקמות יכול להוביל יעילות ההשתלה המסכן, ארעי תיוג טכניקות יכול להגביל את חלון הזמן שבו תאי התורם ניתן לעקוב (כמו חלוקת התא יכול לדלל את התווית).

טכניקה זו היא מאוד לשינוי, ניתן להתאים למגוון רחב של מטרות. לדוגמה, התורם תאים מתוך מגוון גדול של רקמות ו בשלבים יכול להיות מבודד (למרות אופטימיזציה של עיכול אנזימטי נדרשת) והוא יכול באופן דומה להיות מוזרק במגוון רחב של רקמות המארח ברחבי בשלבים שונים של פיתוח. באופן דומה, ניתן לשנות את הגישה תיוג כדי לעקוב אחר תאים על פני חלונות טמפורלית שונים, לרבות השימוש של מוליכים למחצה אורגניים פלורסנט nanocrystals עבור תיוג יותר ארעית ההשתלה של תאים שליו או תאים מ גרין חלבון פלואורסצנטי הטרנסגניים (GFP) התורם עוברי¹¹ עבור תיוג permeant.

בעוד אנחנו כעת להשתמש בטכניקה זו ללימודי השרשה העופות, אנו חשים כי זה יכול לשמש למגוון גדול של מחקרים chimeric בעתיד. לדוגמה, תאי לב גנטית שונה של אורגניזמים הטרנסגניים יכול להיות מבודדת, microinjected ללב העופות באמצעות פרוטוקול דומה מאוד. יתר על כן, תאים הבדיל לתוך cardiomyocytes מ נובעת תאים או באמצעות תאים סומטיים reprograming גישות יכול להיות microinjected לתוך הלב העוברי כדי להעריך את השתלבותם רקמות ו/או התבגרות תחת ויוו ביו-מכני תנאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringe	BD	329654
1.7 mL Microtubes, Clear	Genesee Scientific	24-282
10 ml Syringe	BD	305482
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-430
15 mL Centriguge Tubes, Racked	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator Incubator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 Needle	BD	305196
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Needle	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alchohol Wipes 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
Angled Forceps	Fine Scientific Tools	11260-20
Backloading Tips	Eppendorf	930001007
Black India Ink	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Green CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in DMSO
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Commercial Grade Packing Tape	Staples	2619001
Curved Tenotomy Scissors	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Hatching Eggs	Pilgrim's Hatchery	--
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Micromanipulator	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade	VWR	100496-496
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Petri Dish	Genesee Scientific	32-107
Pipette Grinder	Narishige	EG-44
Pipette Puller	HEKA	PIP 6
Scotch Transparent Tape	Staples	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Stereo Microscope	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Transfer Pipette	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054